● 王振飛 劉 麗 梁 琳 張 晉 李佳晨 郝 欽▲

肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康與生命的一種疾病，其發(fā)病率與死亡率均居各種惡性腫瘤之首[1]。造成肺癌患者高死亡率的主要原因在于其高侵襲轉(zhuǎn)移率。手術(shù)和放療無法清除、殺滅轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，已有的化療藥物大都毒副作用巨大，極大降低了患者的生活質(zhì)量和治療效果[2]，而且一些化療藥物還會(huì)加速腫瘤細(xì)胞的進(jìn)化，促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[3]。急需以新的思路研發(fā)無毒、高效的抑制肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的藥物。

中國醫(yī)藥學(xué)博大精深，尤其在腫瘤治療方面，更有其獨(dú)特之處。它不是僅著眼于殺滅腫瘤細(xì)胞，而是提出了“扶正固本”“清熱解毒”“軟堅(jiān)散結(jié)”等一系列治療思路。許多低毒、無毒中藥在腫瘤治療中都發(fā)揮了顯著的功效[4]。北沙參是一味常用無毒中藥，入肺、胃經(jīng)，善治肺臟疾患，具有養(yǎng)陰清肺、生津潤燥、祛痰止咳等作用，在許多抗肺癌方劑中都有廣泛應(yīng)用[5]。我課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，北沙參可以有效抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，并探討了它的作用機(jī)理。

1 材料

1.1細(xì)胞株人正常支氣管上皮細(xì)胞系16HBE購自南京凱基生物技術(shù)有限公司，人肺癌細(xì)胞系H460購自中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2藥物北沙參生藥飲片購自內(nèi)蒙古中醫(yī)院藥房。將生藥磨為細(xì)粉，過200目篩，75%乙醇回流提取2次，每次40min，過濾，合并濾液，回收乙醇，濃縮至稠膏，冷凍干燥，得到干粉。干粉用PBS(磷酸鹽緩沖液)溶解，配制成濃度為100mg/mL(按生藥計(jì)算)的提取液。

1.3試劑胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)液、PBS、胰蛋白酶消化液均購自Gibco公司，CCK-8試劑盒(C16038)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Marigel基質(zhì)膠購自BD Biosciences，總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司，熒光定量PCR試劑盒購自上海翊圣生物，ELISA試劑盒購自北京百智生物技術(shù)公司。

1.4儀器二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)，超凈工作臺(蘇州金燕)，倒置相差顯微鏡(Nikon TE2000)，多功能酶標(biāo)儀SpectraMax? i3x(Molecular Devices)，7500 Real-Time PCR Systems(Applied Biosystem)。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)16HBE和H460細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、0.1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基(完全RPMI-1640培養(yǎng)基)中，37°C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞毒效應(yīng)將16HBE細(xì)胞懸于完全RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度為2.5×104個(gè)/mL，接種于96孔板(0.2mL/孔)。培養(yǎng)12h后，藥物組加入北沙參提取液(終濃度為1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL)，對照組加入等體積的PBS。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，每孔加入CCK-8溶液20μl，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1h。以450nm為檢測波長、以650nm為參考波長，測定吸光度。

2.3 Transwell法檢測細(xì)胞遷移能力將H460細(xì)胞以106個(gè)/mL懸于無血清RPMI1640培養(yǎng)液。向Transwell小室的每個(gè)上室中加入150μl細(xì)胞懸液，同時(shí)加入北沙參提取液，使其終濃度為5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL；向每個(gè)下室中加入650μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24h后，取出上室，吸棄液體，PBS漂洗，棉簽輕輕擦掉膜上面的細(xì)胞，濾膜用甲醇固定30min，蘇木素染色15min，顯微鏡下，選取膜的上、下、左、右、中5個(gè)不同區(qū)域計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)。

2.4 Matrigel法檢測細(xì)胞侵襲能力將H460細(xì)胞以106 個(gè)/mL懸于無血清RPMI 1640培養(yǎng)液。用預(yù)冷的無血清RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel，取100μl稀釋液加入Transwell小室的上室，小室置于37°C 4h，使膠凝固。向每個(gè)上室中加入150μl細(xì)胞懸液，同時(shí)加入北沙參提取液，使其終濃度為5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL；向每個(gè)下室中加入650μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24h后，取出上室，吸棄液體，PBS漂洗，棉簽輕輕擦掉膜上面的Matrigel及未穿過膜的細(xì)胞，濾膜用甲醇固定30min，蘇木素染色15min，顯微鏡下，選取膜的上、下、左、右、中5個(gè)不同區(qū)域計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)。

2.5熒光定量PCR法檢測TIMP2(組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑2)表達(dá)水平H460細(xì)胞傳代培養(yǎng)24h后，藥物組加入北沙參提取液，使其終濃度為5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL，對照組加入等體積PBS。作用24h后，提取各組細(xì)胞的總RNA，經(jīng)濃度和純度檢測后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。PCR條件：95°C 30s，(95°C 5s，60°C 31s)×40個(gè)循環(huán)。所用引物：TIMP2上游引物 5’-TCTGGATGGACTGGGTCACA-3’，TIMP2下游引物5’-CTTGATGCAGGC GAAGAACTT-3’；GAPDH上游引物5’-TGTCCCCACTGCCAACGTGTCA-3’，GAPDH下游引物5’-GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3’。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算TIMP2的相對mRNA表達(dá)量。

2.6 ELISA檢測培養(yǎng)液中TIMP2的含量取對數(shù)生長期的H460細(xì)胞，藥物組加入北沙參提取液，使其終濃度為5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL，對照組加入等體積PBS。作用24h后，換為無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后，收集培養(yǎng)上清，按試劑盒說明書操作，檢測TIMP2濃度。

2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1北沙參提取液對16HBE細(xì)胞增殖能力的影響CCK-8檢測結(jié)果顯示，在5mg/mL到15mg/mL濃度范圍內(nèi)，北沙參提取液對正常支氣管上皮細(xì)胞16HBE的增殖能力無影響，說明其對正常支氣管上皮細(xì)胞無毒性作用。見表1。

組別OD值對照組0.580±0.0065mg/mL組0.570±0.00810mg/mL組0.564±0.01515mg/mL組0.565±0.014

3.2北沙參提取液抑制H460細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示，5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的北沙參提取液對H460細(xì)胞的遷移能力具有抑制作用，且隨藥物濃度的提高，抑制作用逐漸增強(qiáng)。見表2。

3.3北沙參提取液抑制H460細(xì)胞侵襲能力的影響Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的北沙參提取液對H460細(xì)胞的侵襲能力具有抑制作用，且隨藥物濃度的提高，抑制作用逐漸增強(qiáng)。見表2。

組別遷移細(xì)胞數(shù) (個(gè))侵襲細(xì)胞數(shù)(個(gè))對照組164±14103±85mg/mL組131±9**85±9*10mg/mL組100±11**63±11**15mg/mL組62±5**31±7**

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.4北沙參提取液對H460細(xì)胞中TIMP2的表達(dá)水平的影響熒光定量PCR結(jié)果顯示，5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的北沙參提取液上調(diào)了H460細(xì)胞中TIMP2的mRNA表達(dá)水平，且隨藥物濃度提高，上調(diào)幅度逐漸增大。見表3。

組別相對mRNA表達(dá)量對照組1.00±0.005mg/mL組1.37±0.09**10mg/mL組1.65±0.08**15mg/mL組2.04±0.19**

注：與對照組相比，**P<0.01。

3.5北沙參提取液對H460細(xì)胞TIMP2的分泌水平的影響ELISA結(jié)果顯示，5mg/mL、10mg/mL和15mg/mL的北沙參提取液作用于H460細(xì)胞后，其培養(yǎng)液中TIMP2的濃度升高，且升高幅度隨藥物濃度提高而提高。說明北沙參提取液可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞對TIMP2蛋白的分泌。見表4。

表4 北沙參提取液對H460細(xì)胞TIMP2蛋白分泌水平的影響

注：與對照組相比，**P<0.01。

4 討論

已有的抑制腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲的藥物大多具有較強(qiáng)的毒副作用，給患者的肝臟、腎臟和骨髓造成較大的傷害，嚴(yán)重影響其臨床整體療效[6]。北沙參是一味常用中藥。已有研究表明：它具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力、抗氧化、逆轉(zhuǎn)肺纖維化、抑制肺部感染等多種藥理活性[7]。北沙參在很多抗腫瘤方劑中均有應(yīng)用，但是其確切的抗腫瘤作用機(jī)理還不很清楚。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，北沙參對正常支氣管上皮細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，同時(shí)能夠有效抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

基質(zhì)金屬蛋白酶是一類膠原酶，它們可以降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原成分，破壞腫瘤細(xì)胞遷移侵襲的組織學(xué)屏障。許多腫瘤細(xì)胞都分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶到細(xì)胞外空間，以利于自身的遷移和侵襲活動(dòng)。組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑是一類內(nèi)源性的基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，它們以1：1的比例與細(xì)胞外空間的基質(zhì)金屬蛋白酶結(jié)合，并封閉其降解細(xì)胞外基質(zhì)的活性位點(diǎn)，使其無法發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲的作用[8]。TIMP2是組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑家族的重要成員，是一種重要的抑癌因子。在肺癌細(xì)胞中，TIMP2的合成和分泌水平顯著降低。本研究中，北沙參作用于肺癌細(xì)胞后，有效增強(qiáng)了肺癌細(xì)胞對TIMP2的合成和分泌，從而有力抑制了肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

本研究從細(xì)胞和分子層面探究了北沙參的抗腫瘤作用機(jī)理，為北沙參的抗腫瘤臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。所得結(jié)果證明，從中藥，特別是無毒中藥中尋找新型抗腫瘤藥物是一個(gè)極有前景的方向。