孫勤國 羅蒙 江波 郭乃燕 張賢梅 徐鴻婕 牟艷杰 呂琨 楊倩

5羥色胺(serotonin,5-HT)又名血清素，其作為神經(jīng)遞質(zhì)主要存在于松果體與下丘腦中，對機體許多生理功能包括痛覺、睡眠、體溫等起重要作用；5-HT作為興奮性的神經(jīng)遞質(zhì)，可以促進動脈血管收縮以及血小板聚集，在抑郁發(fā)病過程中起重要作用[1],而抑郁與耳鳴呈相互遞進關(guān)系[2]；5-HT的神經(jīng)元胞體雖然位于聽覺系統(tǒng)以外，但是其神經(jīng)纖維末梢廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的大部分聽覺核團，比如：下丘、耳蝸核、上橄欖復(fù)合體等，對聲音主要起調(diào)節(jié)作用。已有研究證實耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neuron，SGN)上存在多種5-HT受體亞型，其中包括5-HT1B、2C受體[3，4]，而目前研究最為廣泛的是5-HT1A受體對于聽覺通路的影響，而5-HT1B、2C鮮少提及。本研究前期進行了大量的臨床研究工作，發(fā)現(xiàn)補腎活血化痰方聯(lián)合針刺翳風穴能夠有效的緩解老年性神經(jīng)性耳鳴患者的癥狀[5]，初步的建立了耳鳴患者以“多虛多瘀”為中心的病理病機理論。雖然有多種方法可以用于耳鳴動物造模，但目前研究最多、最為穩(wěn)定的是以噪聲及耳毒性藥物誘發(fā)耳鳴，并且該造模方法不僅可以檢測是否成功誘發(fā)耳鳴，而且還可以研究藥物治療耳鳴的療效、耳鳴相關(guān)的神經(jīng)生理學機制[6,7]。本研究擬通過改良Jastreboff[8]經(jīng)典的“飲水抑制”法建立大鼠耳鳴模型，觀察補腎活血化痰開竅方對耳鳴大鼠耳蝸SGN中5-HT1B、2C受體表達的影響，探討其治療耳鳴的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康SPF級雄性SD大鼠60只，體重250±50 g，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號SCXK(鄂)2015-0018；飼養(yǎng)于各頻率聲音均小于25 dB SPL的隔聲動物房內(nèi)，室溫20 ℃左右，相對濕度50%～60%。60只大鼠隨機分為正常組(生理鹽水組)10只，耳鳴模型組50只，耳鳴模型組再分為：水楊酸鈉組(10只)、低劑量中藥組(10只，按體質(zhì)量5.5 g/kg)、中劑量中藥組(10只，按體質(zhì)量11 g/kg)、高劑量中藥組(10只，按體質(zhì)量22 g/kg)及卡馬西平組(10只)。

1.2實驗藥品、試劑及儀器 補腎活血化痰開竅方由熟地黃15 g、山茱萸12 g、桑椹子12 g、菟絲子12 g、郁金15 g、遠志6 g、澤瀉10 g、石菖蒲12 g、葛根12 g、丹參10 g、三七12 g、磁石30 g、蔓荊子10 g、蟬蛻6 g組成。以上藥物均購于同仁醫(yī)院中藥房，經(jīng)過中藥傳統(tǒng)方法浸潤、煎煮、過濾、濃縮制成煎劑，按相當生藥量5.5 g/kg、11 g/kg,22 g/kg體質(zhì)量制成低、中、高劑量，真空包裝，低溫冷藏備用；卡馬西平片(上海中西三雄藥業(yè)有限公司)，水楊酸鈉注射液(sigma公司)；生理鹽水注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)。試劑：HTR1B Antibody(Proteintech，貨號22189-1-AP)；SR-2C (Q437) polyclonal antibody(bioworld，貨號BS2766)；生物素化羊抗兔lgG(拓捷生物，貨號BA1003)；DAB顯色試劑盒(博士德生物，貨號AR1022)。儀器：熒光顯微鏡(OLYMPUS)、成像系統(tǒng)(MicroPublisher)、移液槍(Thermo)。

1.3耳鳴動物造模方法 隔聲室內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁水2天，待動物體重均下降至原體重80%開始進行經(jīng)典的“背景噪聲停止-飲水減少”條件反射[4]，在條件反射訓練前3小時，正常組給予2 ml生理鹽水腹腔注射，其他各組均按350 mg/kg給予10%水楊酸鈉溶液腹腔注射；注射完成后，各組大鼠放置于有背景白噪聲(70 dB SPL)的隔聲室內(nèi)[華中科技大學同濟醫(yī)學院耳鼻喉科提供聽力檢測儀器使用誘發(fā)電位儀、揚聲器(Tucker-Davis-Technologies,美國)、外置揚聲器(飛利浦，中國)，功率放大器(TOMO，中國)]，噪聲軟件為consecutive white noise，聲級器(TES-1351B，臺灣泰仕)校對；每只大鼠每天訓練一次，每次30分鐘，訓練中條件刺激是背景白噪聲停止，分別于訓練的第5、10、15、20、25分鐘出現(xiàn)，每次持續(xù)1分鐘，當背景噪聲停止后，動物舔水即從飲水嘴處給予48 V電擊[220 V變24、36、48 V，交流變直流變壓器(上海天覺提供)、時控開關(guān)控制電流(樂青八開電器提供)]，使其將電擊的非條件刺激與噪聲停止的條件刺激結(jié)合起來，形成“背景噪聲停止-飲水減少或停止”的條件反射；全程用DV攝像機拍攝，經(jīng)相關(guān)軟件處理后記錄每只動物在背景白噪聲關(guān)閉前后各1 min內(nèi)的累計舔水時間，將背景噪聲關(guān)閉前1 min的舔水時間記錄為A，背景噪聲關(guān)閉后1 min的舔水時間記錄為B，用舔水抑制率R=B/(A+B)反映動物條件反射的建立；在訓練前，大鼠的R值穩(wěn)定在0.5左右，動物尚未建立條件反射;訓練后，R值逐漸下降，當R值小于0.2時，說明大鼠條件反射建立成功。條件反射消退期(即聲音停止后不進行電擊)，R值如果漸漸回到0.5時，模型組與對照組反射消退時間具有差異性則造模成功。

1.4耳鳴造模成功后各組給藥方法 正常組(生理鹽水組)及水楊酸鈉組分別給予2 ml生理鹽水灌胃，中藥低、中、高劑量組按大鼠體重1 ml/100 g分別給予低(5.5 g/kg)、中(11 g/kg)、高(22 g/kg)劑量中藥灌胃；卡馬西平組按5 mg/kg生理鹽水稀釋后給予卡馬西平2 ml灌胃，均為每天一次，各組持續(xù)給藥8周，造模期間只在條件訓練期30分鐘內(nèi)及造模成功后給水，不禁食。

1.5耳蝸取材 動物造模成功后給藥至第8周，最后一次給藥后3小時各組行耳蝸取材，整個過程在冰上操作，以10%水合氯醛(5 ml/kg)腹腔注射麻醉動物后，斷頭取腦，取雙側(cè)顳骨放入PBS平衡液中，在體視顯微鏡下打開聽泡去除骨性耳蝸部分，分離螺旋韌帶、血管紋、基底膜等組織，從蝸軸分離蝸螺旋管，獲取SGN的組織塊。

1.6免疫組化法檢測耳蝸SGN的5-HT1B、2C受體的表達 將耳蝸石蠟切片置60 ℃干燥箱預(yù)溫10分鐘，脫蠟5～10分鐘，以蒸餾水浸洗3～5遍，洗去殘留乙醇，滅活內(nèi)源性過氧化物酶后微波抗原修復(fù)，將切片浸泡在0.01 M、pH9.0 Tris-EDTA抗原修復(fù)液中，微波爐中火加熱至沸騰，低火保持2分鐘，5分鐘后再低火加熱5 min。待自然冷卻后封閉，在每張切片上滴加50 μl適當稀釋一抗，37 ℃孵育2小時，PBS洗3分鐘×3次后孵育二抗，每張切片滴加50 μl生物素標記羊抗鼠IgG工作液，37 ℃孵育30分鐘。PBS洗3分鐘×3次。孵育SABC，配制DAB顯色液，按購自博士德的DAB顯色試劑盒(AR1022)說明書配制，預(yù)先配制好的DAB顯色液，室溫顯色。復(fù)染，封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.7統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布的計量資料兩兩比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1耳鳴動物造模結(jié)果 60只大鼠中，10只為正常對照組，實驗期間死亡1只；50只耳鳴模型組大鼠中，44只造模成功，其中6只因死亡及順應(yīng)性差造模不成功淘汰，造模成功率為88%(44/50)。與正常組相比，水楊酸鈉組消退期明顯縮短(表1，t=-20.42,P<0.01)，說明大鼠很有可能將水楊酸鈉引起的耳鳴與背景聲音混淆，從而其消退期當背景聲音消失后比生理鹽水組更加積極的飲水，對寂靜環(huán)境的恐懼消除的更快，其他組均與正常組比較消退期有所縮短，且差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.01),證明耳鳴動物造模成功。

表1 各組大鼠條件反射平均消退期比較(天，±s)

注：*與正常組比較，P<0.05

2.2各組耳蝸SGN中5-HT1B、2C受體表達比較 各組耳蝸螺旋神經(jīng)元胞漿內(nèi)均顯示明顯棕色陽性信號，表明5-HT1B、2C受體均存在于耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)；與正常組比較，水楊酸鈉組5-HT1B受體表達明顯減少(圖1)；與水楊酸鈉組比較，卡馬西平組及各中藥組尤其是中劑量組5-HT1B受體表達明顯增多；與正常組比較，水楊酸鈉組5-HT2C受體表達明顯增多；與水楊酸鈉組比較，卡馬西平組及各中藥組尤其是中劑量組5-HT2C受體表達明顯減少(圖2)。

3 討論

耳鳴作為一種嚴重影響人們身心健康的臨床癥狀，表現(xiàn)為無外界刺激下個體主觀感受到的聲音感覺，其發(fā)病機制可能是多因素作用，導致聽覺系統(tǒng)的抑制與興奮平衡被破壞，造成異常刺激對耳蝸結(jié)構(gòu)的破壞、聽覺傳導途徑的神經(jīng)纖維異常放電、聽皮層超微結(jié)構(gòu)的改變及功能重組致聽覺中樞可塑性變化等[9,10]，其中，聽覺通路神經(jīng)遞質(zhì)及其受體一直被廣泛關(guān)注，例如：谷氨酸受體(包括NMDA受體及非NMDA受體)、γ-氨基丁酸(GABA)及其受體、多巴胺及其受體、乙酰膽堿及其受體、P物質(zhì)、5-HT及其受體等[11]。根據(jù)受體的氨基酸序列、藥理學特性及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制，5-HT分為7種類型，即5-HT1～7受體，5-HT1B受體主要存在基底核、紋狀路和前腦，5-HT1B受體激動劑激活突觸前受體和突觸后受體后能促進5-HT神經(jīng)元放電，進而增強神經(jīng)末梢5-HT的合成、轉(zhuǎn)運及釋放，因此，5-HT1B受體在5-HT系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[12]；5-HT2C是迄今為止由RNA修飾來調(diào)節(jié)的G蛋白偶聯(lián)受體，其RNA編輯對其功能影響重大，包括對情感、認知、焦慮等的調(diào)節(jié)，并參與精神障礙疾病發(fā)病的過程[13]；而耳鳴與情感、焦慮又密不可分，許多國際性耳鳴調(diào)查問卷，如：耳鳴殘疾評估量表(tinnitus handicap inventory,THI)等多側(cè)重于情感評估，一項對慢性耳鳴患者采用復(fù)合性國際診斷問卷調(diào)查的臨床研究[14]結(jié)果顯示，約半數(shù)的慢性耳鳴患者伴有心理障礙，其中包括情感障礙、焦慮及軀體形式障礙等。許多研究證實5-HT1B、2C受體在耳鳴的發(fā)病過程中影響重大，Hurley等[15]認為下丘神經(jīng)元中突觸前5-HT 1B受體能下調(diào)γ-GABAa受體介導的抑制作用，導致一些神經(jīng)元誘發(fā)活動水平提高；而激活GABAa受體可在一定程度上減輕谷氨酸興奮所致的耳蝸聽功能損傷[16]；姚晨等[17]研究水楊酸鈉致耳毒性時,對SGN上GABAa受體的作用機制分析也發(fā)現(xiàn)其亞單位mRNA的改變；柳玉芳等[18]提出伴有5-HT2C受體缺失的遺傳突變可增加小鼠對聲刺激所致癲癇的敏感性，而藥物5-HT7可防止該效應(yīng)，認為5-HT2A和2C受體功能改變的遺傳多態(tài)現(xiàn)象與Alzheimer病的聽覺反應(yīng)的改變有關(guān)；上述研究均提示5-HT特別是5-HT2C在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)興奮性中的重要作用，認為很多抗精神類藥物，如利司呱酮(risperidone)和奧氮平(olanzapine)，除了常規(guī)的多巴胺拮抗劑作用外，還具有獨特的5-HT2受體拮抗劑功能,這些藥物也能用于耳鳴的治療，而卡馬西平通過抑制神經(jīng)元的異常放電、鎮(zhèn)靜催眠，多方面緩解患者神經(jīng)癥狀及情緒，成為治療耳鳴的一線用藥，故本研究選用卡馬西平作為治療耳鳴的西藥對比。

耳鳴的發(fā)生與內(nèi)耳缺血缺氧、微循環(huán)障礙有關(guān)[19]，從非聽覺系統(tǒng)來看則與情感、記憶與情緒特別是負面情緒有關(guān)[20]。研究顯示熟地黃、澤瀉能夠明顯抑制GM誘導毛細胞區(qū)域凋亡標志酶Caspase-3、Caspase-9的激活，上調(diào)BcL2/Bax蛋白表達比值，從而減輕毛細胞凋亡[21]；葛根總黃酮有擴張腦及內(nèi)耳血管，調(diào)節(jié)毛細胞代謝[22]作用；山茱萸多糖通過改善骨髓造血，促進各種血細胞的恢復(fù)[23]；石菖蒲、蟬蛻、磁石均具有抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)、鎮(zhèn)驚、抗驚厥作用，其中石菖蒲發(fā)揮油和水煎劑可能提高中樞GABA含量，降低Glu和5-HT從而起到抗焦慮作用[24]；蟬蛻醇提取物和水提物均可延長小鼠發(fā)生驚厥的潛伏期和延長驚厥小鼠死亡時間[25]；而磁石中含有大量的鐵元素，而低鐵可能會使耳蝸處細胞膜過氧化，導致聽神經(jīng)損傷[26]；丹參的主要成分為丹參酮類化合物、三七的主要活性成分為皂苷，蔓荊子的果實中含有多種揮發(fā)油，這些物質(zhì)均具有抗氧化，改善微循環(huán)作用，從而增加內(nèi)耳的血運及含氧量，減少耳鳴的發(fā)生[27]。本研究選用的補腎活血化痰開竅方，方中以熟地黃為君藥，滋陰養(yǎng)血，補腎填精；臣以山茱萸補益肝腎，桑椹子滋陰補血，菟絲子補肝腎，益精髓；佐以郁金行氣解郁，涼血破瘀；遠志安神益智、祛痰，澤瀉配熟地黃瀉腎濁消腫；石菖蒲化痰開竅、化濕行氣；配葛根、丹參、三七活血化瘀通絡(luò)；磁石平肝潛陽、補腎益陰、聰耳明目；蔓荊子、蟬蛻疏風清熱，并以其疏散之性，使諸藥補而不滯；諸藥配合，共奏補腎活血、祛痰開竅之功。從文中結(jié)果看，水楊酸鈉組的5-HT1B受體表達較生理鹽水組明顯減少，5-HT2C受體則明顯增多；與既往的研究[28,29]一致，而卡馬西平組及低、中、高劑量補腎活血化痰開竅方各組的5-HT1B受體表達增加，5-HT2C受體減少，可能改變了水楊酸鈉致大鼠耳鳴相關(guān)的受體激活致耳鳴減弱或消失，故該方可應(yīng)用于耳鳴的治療。但本實驗的樣本含量較少，缺乏多元化比較分析，補腎活血化痰開竅方治療耳鳴的機制繁多，仍需進一步探討。