張菲玲 夏云 姚裕恒 王軍義

耳蝸毛細(xì)胞凋亡是多種感音性聾(噪聲暴露、電離輻射、藥物毒性等)的重要病理學(xué)過程[1]，氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生大量氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是誘發(fā)耳蝸毛細(xì)胞凋亡的最主要因素[1，2]，ROS通過激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄誘發(fā)毛細(xì)胞凋亡是目前的主要觀點(diǎn)[3]；熱休克蛋白75(glucose regulated protein 75，GRP75，又名熱休克蛋白A9，HSPA9)和熱休克蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78，又名熱休克蛋白A5，HSPA5)均屬于熱休克蛋白70家族成員，這二種蛋白具有重要的生物學(xué)功能，生理情況下主要作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)合成后的修飾、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)等過程，但在細(xì)胞受到各種刺激時的應(yīng)激反應(yīng)和惡性腫瘤細(xì)胞中，GRP75、GRP78與細(xì)胞的增殖和凋亡過程密切相關(guān)[4～7]，但其機(jī)制尚不十分清楚，尤其在內(nèi)耳毛細(xì)胞凋亡機(jī)制研究中尚無GRP75、GRP78的相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過檢測體外培養(yǎng)毛細(xì)胞并應(yīng)用叔丁基雙氧水誘導(dǎo)制作的氧化應(yīng)激損傷凋亡模型[8，9]的GRP75、GRP78表達(dá)水平，分析其在毛細(xì)胞凋亡中的可能作用，為研究感音性聾毛細(xì)胞凋亡機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1毛細(xì)胞株 采用美國House研究所(House Ear Institute，HEI)提供的HEI-OC1毛細(xì)胞株，該細(xì)胞株從永生化小鼠耳蝸Corti器分離培育，并能在體外穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。

1.2儀器和試劑 70%叔丁基雙氧水(tert-Butyl hydroperoxide,t-BHP)(南京化學(xué)試劑公司，中國)，胎牛血清(HyClone，美國)，DMEM 培養(yǎng)液(HyClone，美國)，Caspase-3兔單克隆抗體(CST，美國)，GAPDH兔單克隆抗體(Proteintech，美國)，Western細(xì)胞裂解液(Proteinsimple，美國)，Anti-Rabbit Detection Module for Wes試劑盒(Proteinsimple，美國)，12-230kDa Wes Separation Module試劑盒(Proteinsimple，美國)，TRNzol Universal總RNA提取試劑(天根生化科技公司，中國)，F(xiàn)ermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622(MBI Fermentas，美國)，F(xiàn)ermentas K0223 qPCR試劑盒(MBI Fermentas，美國)，引物設(shè)計(jì)合成(廣州賽哲生物公司，中國)，BPX-82型恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)公司，中國), Wes型全自動Western blot分析儀(Proteinsimple，美國)，ABI Stepone Plus型熒光定量PCR儀(ABI，美國)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1毛細(xì)胞t-BHP染毒[8,9]取正常生長的HEI-OC1毛細(xì)胞置于含 10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，在33 ℃、10% CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞濃度為106個/ml。用培養(yǎng)液將70% t-BHP稀釋制備成20、40、60 μM濃度，去除各細(xì)胞培養(yǎng)孔的培養(yǎng)液，分別加入200 μl含20、40、60 μMt-BHP的培養(yǎng)液，對照孔加入200 μl無藥物培養(yǎng)液，6復(fù)孔培養(yǎng)24小時后進(jìn)行GRP75/GRP78 mRNA、Caspase-3、Active-Caspase-3蛋白檢測。

1.3.2Western blot檢測各組HEI-OCI細(xì)胞中Caspase-3、Active-Caspase-3的表達(dá) 對上述各樣本加入80 μl細(xì)胞裂解液冰上裂解10 min，6 000 rmp、5 min離心后收集上清蛋白液用Wes儀進(jìn)行Western blot檢測，樣品處理嚴(yán)格按照試劑盒Anti-Rabbit Detection Module for Wes和12-230kDa Wes Separation Module的操作步驟，反應(yīng)參數(shù)為：分離膠吸取200 s、濃縮膠吸取15 s、吸樣9 s、電泳25 min(恒壓375 V)、凝膠清除230 s、洗滌3次(每次150 s)、封閉5min、抗Caspase-3或抗GAPDH(內(nèi)參)孵育30 min、二抗孵育30 min、發(fā)光液曝光50 s。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各樣品的灰度值，由于Caspase-3正常以酶原(32 KD)形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基(Active-Caspase-3，17 KD)和兩個小亞基(12 KD)組成，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算Caspase-3(32 KD)和Active-Caspase-3(17 KD)的相對灰度值分別表示其表達(dá)水平。

1.3.3實(shí)時熒光定量PCR檢測GRP75、GRP78 mRNA的表達(dá) 培養(yǎng)的各組細(xì)胞PBS洗滌后加1 ml TRNzol Universal裂解細(xì)胞，分別加入200 μl氯仿，混勻靜置5 min，12 000 rpm、4 ℃離心15 min，取上清加入異丙醇500 μl，混勻后室溫靜置10 min，12 000 rpm、4 ℃離心10 min，棄上清，加入1 ml 70%乙醇，7 500 rpm、4 ℃離心5 min棄上清，加30 μl DEPC水溶解沉淀，取少量進(jìn)行檢測，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)嚴(yán)格按照Fermentas K1622試劑盒操作說明，實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)于ABI Stepone Plus PCR儀中進(jìn)行，反應(yīng)嚴(yán)格按照Fermentas K0223試劑盒操作說明。反應(yīng)條件為：95 ℃、10 min預(yù)變性，按95 ℃、15 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s共做40個循環(huán)，最后95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s 1次。應(yīng)用2-△△Ct法對GRP75/GRP78 mRNA和GAPDHmRNA(GAPDH mRNA為內(nèi)參基因)表達(dá)進(jìn)行相對定量檢測，每組細(xì)胞每個基因至少重復(fù)6次；引物設(shè)計(jì)合成序列參見表1。

表1 GRP75/GRP78和GAPDH基因引物序列

2 結(jié)果

2.1各組HEI-OC1細(xì)胞中Caspase-3、Active-Caspase-3蛋白表達(dá) Western-blot檢測各組HEI-OC1細(xì)胞Caspase-3和Active-Caspase-3蛋白表達(dá)水平見表2和圖1，與對照組相比，各染毒組Caspase-3和Active-Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著增高(F=1 196.741,P<0.001和F=184.131,P<0.001)，40 μM和60 μM染毒組Caspase-3和Active-Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著高于20 μM染毒組(P<0.01)，40 μM和60 μM染毒組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對照組正常HEI-OC1細(xì)胞幾乎不表達(dá)Caspase-3、Active-Caspase-3，凋亡細(xì)胞中二者表達(dá)水平顯著增加，且Active-Caspase-3表達(dá)水平遠(yuǎn)低于Caspase-3。

表2 各組Caspase-3、Active-Caspase-3、GRP75/78 mRNA表達(dá)水平比較±s)

圖1 Western-blot檢測各組HEI-OCl細(xì)胞中Caspase-3、Ac-tive-Caspase-3表達(dá)

2.2各組HEI-OC1細(xì)胞中GRP75、GRP78 mRNA的表達(dá) 實(shí)時熒光定量PCR檢測各組HEI-OC1細(xì)胞GRP75、GRP78 mRNA表達(dá)水平見表2，與對照組相比較，各染毒組GRP75、GRP78 mRNA表達(dá)水平顯著增高(F=228.065,P<0.001和F=1 298.057,P<0.001)，40 μM和60 μM染毒組GRP75、GRP78 mRNA的表達(dá)水平顯著高于20 μM染毒組(P<0.01)，但40 μM與60 μM染毒組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程的重要執(zhí)行因子，正常以酶原形式存在于胞漿中并無催化活性，Active-Caspase-3由二個大亞基(17 KD)和二個小亞基(12 KD)組成，通過裂解胞漿、胞核底物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，所以Caspase-3和Active-Caspase-3也可認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志物。本研究發(fā)現(xiàn)t-BHP染毒的HEI-OC1細(xì)胞Caspase-3和Active-Caspase-3表達(dá)水平較對照組顯著升高，在一定程度上代表了細(xì)胞凋亡水平，但高濃度(40 μM和60 μM)染毒組之間氧化損傷嚴(yán)重的HEI-OC1細(xì)胞中Caspase-3和Active-Caspase-3表達(dá)水平并沒有隨著氧化損傷的加重而增高，GRP75和GRP78的檢測結(jié)果與此類似，提示GRP75和GRP78與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

GRP78是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)合蛋白，參與合成蛋白質(zhì)的折疊與轉(zhuǎn)運(yùn)，也是細(xì)胞內(nèi)重要的應(yīng)激蛋白，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)密切相關(guān)，ERS是指細(xì)胞受到應(yīng)激反應(yīng)時發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白異常，導(dǎo)致錯誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積，進(jìn)而激活促凋亡因子誘發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10,11]。ERS凋亡途徑是通過多個下游因子激活Caspase-12，進(jìn)而激活凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3促進(jìn)凋亡發(fā)生[12,13]。ERS發(fā)生時GRP78表達(dá)水平升高，GRP78通過重新折疊錯誤的蛋白質(zhì)達(dá)到維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定、保護(hù)細(xì)胞的作用[14]，目前尚無證據(jù)說明GRP78與細(xì)胞凋亡的直接關(guān)系，但研究發(fā)現(xiàn)通過沉默GRP78的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，GRP78的過表達(dá)可以減輕細(xì)胞的凋亡[15，16]，推測其機(jī)制可能與GRP78修復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)錯誤折疊蛋白質(zhì)的功能相關(guān)，因?yàn)殄e誤折疊蛋白的堆積是誘發(fā)ERS凋亡途徑的最主要因素。本研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷的HEI-OC1毛細(xì)胞中GRP78高表達(dá)，而應(yīng)激損傷嚴(yán)重組GRP78表達(dá)水平不再升高，這與凋亡蛋白Caspase-3、Active-Caspase-3表達(dá)特征相似，說明GRP78參與了毛細(xì)胞的凋亡過程，推測其可能通過緩解ERS凋亡途徑發(fā)揮抗凋亡的作用。

GRP75是高度保守的應(yīng)激蛋白，盡管分布于多處亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但其主要定位于線粒體中，在應(yīng)激刺激(ROS、電離輻射、毒物等)下表達(dá)水平增高，具有保護(hù)細(xì)胞的生物學(xué)功能[17]。GRP75具有抗凋亡的生物學(xué)效應(yīng)[18]，其機(jī)制復(fù)雜，目前尚存爭議，主要有以下幾種觀點(diǎn)：第一、GRP75能抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)中線粒體細(xì)胞色素酶C(Cyt-c)釋放至胞漿，Cyt-c在線粒體內(nèi)可以抑制ROS的積累，而胞漿中的Cyt-c可激活Caspase-9、Caspase-7、Caspase-3誘發(fā)凋亡[19]；第二、GRP75可與P53蛋白結(jié)合，阻止P53入核激活凋亡基因Bax、Noxa、PUMA的表達(dá)[16];第三、GRP75可通過Raf/Mek/Erk1/2信號通路促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)、抑制Cyt-c的釋放抑制凋亡發(fā)生[20]。本研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷的HEI-OC1細(xì)胞中GRP75表達(dá)水平反應(yīng)性增高，是對細(xì)胞凋亡的應(yīng)激反應(yīng)，而且其表達(dá)特征與Caspase-3、Active-Caspase-3相似，符合GRP78抗凋亡機(jī)制?？梢?，盡管GRP75和GRP78都屬于同一家族的應(yīng)激蛋白，結(jié)構(gòu)和功能有相似的部分，都具有抗氧化、抗凋亡的生物學(xué)效應(yīng)，但其機(jī)制不同。

綜上所述，氧化應(yīng)激損傷的HEI-OC1細(xì)胞中GRP75和GRP78出現(xiàn)反應(yīng)性高表達(dá)，其生物學(xué)作用是抗凋亡保護(hù)細(xì)胞，但其具體的作用及機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。