伍文兵 李文威

鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院）泌尿外科, 腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北黃石 435000）

不孕不育癥診斷中，男性因素約占40%[1]，男性不育癥與諸多因素相關(guān)，近年有關(guān)男性生育能力與年齡的關(guān)系得到關(guān)注，Sloter等[2]研究顯示，男性子代染色體缺陷風(fēng)險(xiǎn)加大與年齡的增長(zhǎng)密切相關(guān)；de la Rochebrochard等[3]發(fā)現(xiàn)，男性年齡越大，配偶自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)越高；這可能與35歲以上健康男性精子DNA損傷水平增加有關(guān)[4]。目前有關(guān)男性不育的診斷，除無(wú)精子癥可由指標(biāo)確診外，其他診斷技術(shù)相對(duì)匱乏，常規(guī)檢測(cè)僅能通過(guò)精子活力、濃度、形態(tài)等常規(guī)精液參數(shù)評(píng)估，不能滿(mǎn)足臨床要求[5]。隨著DNA完整性診斷技術(shù)發(fā)展，評(píng)估男性生育能力技術(shù)得以提升，其中雙尾彗星試驗(yàn)是評(píng)估DNA完整性的方法之一，可通過(guò)9種彗星模型鑒別精液DNA損傷屬于單鏈還是雙鏈損傷情況，臨床鑒別價(jià)值高[6]。本研究通過(guò)雙尾彗星實(shí)驗(yàn)分析我院＞40歲男性精子DNA損傷與其精液常規(guī)參數(shù)的關(guān)系，為男性生育能力評(píng)估提供臨床參考。

資料與方法

一、一般資料

收集本院308例20歲至55歲不育男性患者精液。不育癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：結(jié)婚同居≥1年，性生活正常，無(wú)任何避孕舉措，配偶生殖能力正常，未育。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床診斷符合不育癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診者；年齡20～55歲者；身體健康者；無(wú)遺傳性疾病者；無(wú)睪丸、輸精管、附睪等生殖器官異?；蛲鈧?；無(wú)性功能障礙者；無(wú)其他器質(zhì)性疾病者；無(wú)不良生活習(xí)慣者。排除標(biāo)準(zhǔn)：繼發(fā)性不育者；伴有腮腺炎病史者；伴有隱睪癥、精索靜脈曲張、無(wú)精子癥、泌尿生殖系統(tǒng)疾病、乳腺發(fā)育異常、陰毛發(fā)育異常等者；合并其他急慢性疾病者；不配合研究者。

二、方法

（一）精液標(biāo)本收集

308例受檢者取精液前2～7d禁欲，取樣前排凈小便，洗凈雙手，采用手淫法收集全部精液標(biāo)本于無(wú)菌、干燥、潔凈塑料采樣容器內(nèi)，后馬上置于37℃恒溫水浴箱中液化處理，同時(shí)記錄所有受試者禁欲時(shí)間和精液量，液化處理完畢后立刻進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

（二）精液常規(guī)和精子誘發(fā)頂體反應(yīng)檢查

依據(jù)第五版WHO相關(guān)操作[7]進(jìn)行：（1）精子濃度、總活力、前向運(yùn)動(dòng)率檢測(cè)：取液化后精子5μL，采用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）（購(gòu)自北京偉力新世紀(jì)科技發(fā)展有限公司，型號(hào)WLJY29000型）于帶37℃加熱載物臺(tái)的顯微鏡下觀察精子濃度、精子總活力、精子前向運(yùn)動(dòng)率；（2）精子形態(tài)學(xué)檢測(cè)：制備精液涂片，涂片風(fēng)干后，采用Diあ-Quik染色法（試劑盒購(gòu)自 Baxter公司）于光學(xué)顯微鏡下分析精子形態(tài)，計(jì)算正常形態(tài)率；（3）精子誘發(fā)頂體反應(yīng)檢測(cè)：采用考馬斯亮藍(lán)染色法進(jìn)行精子誘發(fā)頂體反應(yīng)檢測(cè)，于光學(xué)顯微鏡下觀察熒光標(biāo)記染色精子，計(jì)算頂體反應(yīng)率。試驗(yàn)由2人同時(shí)檢測(cè)2次，取平均值，對(duì)于檢測(cè)結(jié)果偏倚≥10%的樣本，重新檢測(cè)分析。

（三）精液DNA損傷分析

采用雙尾彗星實(shí)驗(yàn)（雙向單細(xì)胞凝膠電泳法）檢測(cè)308例受檢者精液DNA損傷情況：先進(jìn)行預(yù)處理，將預(yù)先處理好的新鮮液化精液經(jīng)PBS稀釋至1×106/mL濃度，取25μL稀釋精液與50μL 1%的瓊脂糖于37℃下充分混合，加入至凝膠玻片，4℃下冰浴5 min，保證其凝固，后經(jīng)裂解、洗滌、解旋、中性凝膠電泳、堿性凝膠電泳、脫水干燥、染色等步驟處理完畢后，使用CASP軟件于10×40倍熒光顯微鏡（購(gòu)自 Olympus BX41 型）下觀察精子DNA損傷情況和損傷類(lèi)型，記錄DNA碎片化指數(shù)（DFI）、精子單鏈損傷指數(shù)（SSB-DFI）、精子雙鏈損傷指數(shù)（DSBDFI）、精子SSB占所有損傷精子比例（SSB-DFI/DFI）和精子DSB占所有損傷精子比例（DSB-DFI/DFI）。

三、觀察指標(biāo)

（1）觀察不同年齡層不育男性精液參數(shù)與精子DNA總體損傷率（DFI值）；（2）以DFI值=30%為分界線(xiàn)，分析＞40歲不育男性不同精子損傷程度患者精液參數(shù)情況；（3）分析＞40歲不育男性DFI值與各精液參數(shù)的相關(guān)性；（4）記錄＞40歲不育男性精子SSB-DFI/DFI和DSB-DFI/DFI比例，將SSB-DFI/DFI＞DSB-DFI/DFI者定為單鏈損傷比例高組，將SSBDFI/DFI＜DSB-DFI/DFI者定為雙鏈損傷比例高祖，比較兩組精液參數(shù)；（5）采用Pearson相關(guān)性分析法分析＞40歲不育男性DSB-DFI /DFI、SSB-DFI /DFI值與各精液參數(shù)的相關(guān)性。

四、數(shù)據(jù)分析

結(jié) 果

一、＞40歲不育男性與同齡已育男性精液參數(shù)與精子DNA總體損傷率比較

＞40歲組不育男性精液總活力、前向運(yùn)動(dòng)率和頂體反應(yīng)率顯著低于＞40歲正常組，DFI值顯著高于＞40歲已育組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組精液量、精子濃度、精子正常形態(tài)率差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

二、＞40歲不育男性不同DFI值患者精液參數(shù)分析

＞40歲不育男性中，DFI值≤30%組精子濃度、總活力、精子正常形態(tài)率、前向運(yùn)動(dòng)率和頂體反應(yīng)率均顯著高于DFI＞30%組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表1 不同年齡層不育男性精液參數(shù)與精子DNA總體損傷率比較（s）

表1 不同年齡層不育男性精液參數(shù)與精子DNA總體損傷率比較（s）

DFI(%)＞40歲已育組1202.94±1.4239.85±15.6437.42±7.853.83±2.3226.84±7.356.32±2.3428.63±11.65＞40歲不育組1483.09±1.3538.45±15.5335.33±6.343.81±2.6224.12±8.115.61±2.8832.54±13.54 t 0.8840.7322.4110.0092.8462.1792.501 P＞0.05＞0.05＜0.05＞0.05＜0.01＜0.05＜0.05組別n 精液參數(shù)精液量(mL)濃度(×106/mL)總活力(%)正常形態(tài)率(%)前向運(yùn)動(dòng)率(%)頂體反應(yīng)率(%)

表2 ＞40歲不育男性不同DFI值患者精液參數(shù)分析（s）

表2 ＞40歲不育男性不同DFI值患者精液參數(shù)分析（s）

組別n精液量(mL)濃度(×106/mL)總活力(%)正常形態(tài)率(%)前向運(yùn)動(dòng)率(%)頂體反應(yīng)率(%)DFI≤30%1123.12±1.3741.54±16.2242.82±8.024.89±2.7131.11±9.027.84±3.11 DFI＞30%363.02±1.2835.02±12.5525.45±5.413.15±2.0222.55±6.254.12±2.15 t 0.3872.20712.1243.5455.2946.675 P＞0.05＜0.05＜0.001＜0.01＜0.001＜0.001

三、＞40歲不育男性DFI值與精液參數(shù)的相關(guān)性分析

＞40歲不育男性DFI值與精子濃度（r=-0.254, P=0.021）、總活力（r=-0.512, P＜0.01）、正常形態(tài)率（r=-0.321, P=0.002）、前向運(yùn)動(dòng)率（r=-0.492, P＜0.001）和頂體反應(yīng)率（r=-0.385, P=0.013）呈顯著負(fù)相關(guān)，而與精液量無(wú)明顯相關(guān)性，見(jiàn)表3。

四、＞40歲不育男性不同精子DNA損傷類(lèi)型比例患者精液參數(shù)分析

＞40歲不育男性精子單鏈損傷比例高組精子濃度、總活力、正常形態(tài)率、前向運(yùn)動(dòng)率和頂體反應(yīng)率均顯著高于雙鏈損傷比例高組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表3 ＞40歲不育男性DFI值與精液參數(shù)的相關(guān)性分析

表4 ＞40歲不育男性不同精子DNA損傷類(lèi)型比例患者精液參數(shù)分析（s）

表4 ＞40歲不育男性不同精子DNA損傷類(lèi)型比例患者精液參數(shù)分析（s）

組別n精液量(mL)濃度(×106/mL)總活力(%)正常形態(tài)率(%)前向運(yùn)動(dòng)率(%)頂體反應(yīng)率(%)單鏈損傷比例高1083.11±1.3647.12±17.8845.65±9.115.12±2.8833.15±8.877.91±2.98雙鏈損傷比例高403.03±1.2535.58±15.7223.54±6.553.03±2.3121.68±7.024.09±2.02 t 0.3253.59814.0504.1227.3637.487 P＞0.05＜0.01＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

五、＞40歲不育男性DSB-DFI /DFI、SSB-DFI /DFI值與精液參數(shù)的相關(guān)性分析

＞40歲不育男性DSB-DFI /DFI值與精子濃度（r= -0.467, P=0.015）、總活力（r =-0.623, P=0.005）、正常形態(tài)率（r= -0.384, P=0.028）、前向運(yùn)動(dòng)率（r =-0.612, P＜0.001）和頂體反應(yīng)率（r= -0.454, P=0.008）均呈顯著負(fù)相關(guān)；SSB-DFI /DFI與精液各參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05），見(jiàn)表5。

表5 ＞40歲不育男性DSB-DFI /DFI、SSB-DFI /DFI值與精液參數(shù)的相關(guān)性分析

討 論

環(huán)境改變、基因突變、染色體異常等均可影響精子的正常發(fā)育，引起精子魚(yú)精蛋白缺乏、染色體包裝異常、精子DNA碎片化等，造成精子DNA損傷，而DNA完整性是保證父系遺傳物質(zhì)傳至后代的前提[8]。年齡與精子質(zhì)量下滑密切相關(guān)，高齡男性精子多存在基因缺陷和染色體異常概率增加現(xiàn)象，且隨著男性年齡的增加，不育者附睪內(nèi)氧自由基和睪丸生精過(guò)程DNA損傷修復(fù)能力下降，增加精子損傷與凋亡風(fēng)險(xiǎn)[9, 10]。Eskenazi等[11]報(bào)道稱(chēng)，男性的精液量、活性和濃度隨年齡上升而下降，而精子活力則在40歲以后明顯下降。有關(guān)年齡對(duì)不育男性精液質(zhì)量的影響，已有諸多報(bào)道，而單純分析40歲以上男性精子DNA損傷與其精液常規(guī)參數(shù)的關(guān)系的報(bào)道鮮見(jiàn)。本文通過(guò)CASA系統(tǒng)和雙尾彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)40歲以上不育男性和同齡已育男性常規(guī)精液參數(shù)及精子DNA損傷情況發(fā)現(xiàn)，＞40歲不育男性精液總活動(dòng)率、前向運(yùn)動(dòng)率和頂體反應(yīng)率均顯著低于同齡已育男性，DNA損傷程度也更為嚴(yán)重，說(shuō)明40歲以上不育男性精液質(zhì)量下降程度較同齡已育男性嚴(yán)重，具體分析相關(guān)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，可能與精子DNA碎片化損傷和DNA損傷類(lèi)型有關(guān)。

DNA碎片化指數(shù)（DFI）是評(píng)估男性生育功能的重要指標(biāo)，Evenson等[12]分析精子染色體結(jié)構(gòu)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，DFI值與男性生育力呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)DFI值處于0～15%時(shí)，生育力高；當(dāng)DFI值為16%～29%時(shí)，生育力中等；當(dāng)DFI≥30%時(shí)，生育力低；而當(dāng)DFI≥80%時(shí)，生育力無(wú)。本文以DFI=30%為分界線(xiàn)，分析＞40歲不育男性精液參數(shù)發(fā)現(xiàn)，DFI值≤30%組精子濃度、總活力、正常形態(tài)率、前向運(yùn)動(dòng)率和頂體反應(yīng)率均顯著高于DFI＞30%組，且DFI值與精子濃度、總活力、正常形態(tài)率、前向運(yùn)動(dòng)率和頂體反應(yīng)率呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明精液DFI對(duì)＞40歲不育男性生育能力具有一定評(píng)估作用，推測(cè)可能與精子發(fā)育、成熟期間低程度氧自由基反應(yīng)、精子蛋白成分改變、精子線(xiàn)粒體代謝功能下降等諸多因素所致。Agarwal等[13]證實(shí)，低程度氧自由基反應(yīng)可增加精子DNA損傷和精子高激活運(yùn)動(dòng)，降低精子活動(dòng)率；Sergerie等[14]報(bào)道稱(chēng)，精子核魚(yú)精蛋白下降與DFI值上升密切相關(guān)，核魚(yú)精蛋白中P1/P2比例的下降，可明顯抑制二硫鍵生成，造成染色體結(jié)構(gòu)松散，增加精子DNA損傷和影響精子DNA完整性，影響精子正常活力和形態(tài)；此外，精子線(xiàn)粒體代謝功能下降，不僅可以加重DNA損傷，還可影響精子活力[15]；上述共同因素均可影響精子活力和DNA完整性。

精子DNA損傷類(lèi)型，包含單鏈與雙鏈損傷，而精子DNA單鏈損傷屬于精子遺傳物質(zhì)加工、包裝期間自然產(chǎn)物，而雙鏈損傷才是造成男性不育的決定性因素[16]。精子DNA雙鏈損傷后，其雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，損傷難以修復(fù)，而精子DNA單鏈損傷后，其雙螺旋結(jié)構(gòu)依然存在，不會(huì)造成遺傳物質(zhì)和結(jié)構(gòu)丟失，依然可以自行修復(fù)[17]。本文采用可辨別精子DNA損傷類(lèi)型的雙尾彗星試驗(yàn)評(píng)估DNA完整性發(fā)現(xiàn)，＞40歲不育男性精子單鏈損傷比例高組精子濃度、總活力、正常形態(tài)率、前向運(yùn)動(dòng)率和頂體反應(yīng)率均顯著高于雙鏈損傷比例高組，說(shuō)明精子DNA雙鏈損傷對(duì)生育能力的影響更大，與上述報(bào)道具有一致性。通過(guò)分析＞40歲不育男性精液DSB-DFI /DFI、SSB-DFI /DFI值與精液參數(shù)關(guān)系發(fā)現(xiàn)，DSB-DFI /DFI值與精子濃度、總活力、正常形態(tài)率、前向運(yùn)動(dòng)率和頂體反應(yīng)率呈顯著負(fù)相關(guān)，而SSB-DFI /DFI與精液各參數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性，說(shuō)明精子DNA雙鏈損傷可直接評(píng)估患者生育能力，是導(dǎo)致少弱精子癥的重要因素，而單鏈損傷并非是精子質(zhì)量的決定因素，與魏任雄等[6]報(bào)道結(jié)果一致。不育癥診斷中，DNA完整性檢測(cè)逐步應(yīng)用于臨床評(píng)估，利于極大提高不育癥診斷率。本文雖然具體分析了40歲以上不育男性精子DNA損傷與其精液常規(guī)參數(shù)的關(guān)系，得出DFI值和雙鏈損傷對(duì)其生殖情況具有一定評(píng)估價(jià)值，但相關(guān)機(jī)制和深入原因并未進(jìn)一步分析，且未針對(duì)低齡不育人群進(jìn)行分析，存在一定不足，后期需進(jìn)一步深化。

綜上所述， ＞40歲不育男性精液參數(shù)異常和DNA損傷情況較同齡已育男性嚴(yán)重，精液DNA碎片化指數(shù)和雙鏈損傷類(lèi)型對(duì)40歲以上不育男性生殖情況評(píng)估參考價(jià)值更高。