微波干燥對(duì)生物解離富肽豆粉蛋白亞基及功能性的影響

王 歡 佟曉紅 鐘明明 齊寶坤 李 楊,2 江連洲

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030； 2.哈爾濱市食品產(chǎn)業(yè)研究院，哈爾濱 150028)

0 引言

生物解離是一種新型的綠色提油工藝，在機(jī)械破碎的基礎(chǔ)上，通過對(duì)植物油料進(jìn)行酶解處理可實(shí)現(xiàn)油脂與蛋白的同步提取，具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。生物解離同步制取大豆油脂及蛋白技術(shù)以其安全、健康、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，已充分體現(xiàn)其工業(yè)可行性。破乳技術(shù)使油和蛋白的提取率分別高達(dá)98%和96.5%，然而其水資源及副產(chǎn)物綜合利用率低的問題亟待解決[2]。生物酶法同步制取油脂及蛋白工藝產(chǎn)生的副產(chǎn)物水解液中主要成分為水解蛋白。研究表明，每生產(chǎn)1 L油脂可產(chǎn)生4.4 kg豆渣和約28 L水解液[3]。生物解離大豆廢料與傳統(tǒng)大豆加工副產(chǎn)物廢料相比，經(jīng)過酶解后會(huì)有更多的高價(jià)值成分釋放，典型的水解液含60%蛋白質(zhì)(水解蛋白)、22%碳水化合物以及原料中幾乎50%的磷脂。現(xiàn)有的用于發(fā)酵酒精、生產(chǎn)水溶性多糖等再利用方案不能很好地利用異黃酮等生理活性物質(zhì)，造成一定程度的浪費(fèi)[4]。因此，如何對(duì)水解液進(jìn)行高值化利用是提高此項(xiàng)技術(shù)經(jīng)濟(jì)效益、環(huán)境效益和社會(huì)效益的重要因素。

微波干燥技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于多種食品的生產(chǎn)。REDDY等[5]研究微波干燥條件(固形物含量、進(jìn)口溫度)對(duì)山羊奶粉性質(zhì)的影響，研究發(fā)現(xiàn)，L*值、水分活度、堆積密度隨著進(jìn)口溫度的升高而降低，固形物含量的升高引起堆積密度的增大，溶解性、可濕性和分散性均受到微波干燥條件的影響，平均值分別為98.49%、533.4 s和81.48%。TELANG[6]研究微波干燥條件對(duì)發(fā)酵豆粉性質(zhì)的影響，研究發(fā)現(xiàn)，較高進(jìn)口溫度、較低進(jìn)料速度時(shí)，粉末顆粒的殘留水分較低；產(chǎn)品得率在較低進(jìn)料速度條件下較高；升高進(jìn)口溫度引起產(chǎn)品異黃酮種類的減少及含量的降低；較低進(jìn)料速度使物料更多暴露于干燥塔，蛋白質(zhì)更易變性，且形成較多小顆粒粉末，從而引起豆粉溶解性下降。SHEN[7]利用微波干燥生產(chǎn)乳蛋白-纖維復(fù)合物的研究發(fā)現(xiàn)，隨著進(jìn)口溫度升高，所得產(chǎn)品顆粒水分活度降低，微波干燥所得粉末顆粒就微生物腐敗來說相對(duì)穩(wěn)定。目前，關(guān)于微波干燥技術(shù)的利用多集中于工藝參數(shù)的優(yōu)化，而微波干燥條件對(duì)產(chǎn)品性質(zhì)的影響機(jī)理尚不明確，因此有必要針對(duì)生產(chǎn)過程產(chǎn)品特性的變化進(jìn)行深入研究。

本文以模擬大豆油提煉工藝條件下的生物解離大豆水解液為研究對(duì)象，運(yùn)用高效液相體積排阻色譜技術(shù)研究不同微波干燥條件對(duì)富肽豆粉中蛋白類物質(zhì)亞基組分和空間構(gòu)象的變化規(guī)律，并對(duì)生物解離富肽豆粉的粉體性質(zhì)及功能性質(zhì)進(jìn)行研究，旨在探討結(jié)構(gòu)變化與理化、功能特性的內(nèi)在聯(lián)系，為生物解離技術(shù)工業(yè)化示范提供理論指導(dǎo)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

大豆，哈爾濱市依蘭大豆專業(yè)合作社；堿性蛋白酶Protease 2.4L，諾維信生物技術(shù)有限公司；氫氧化鈉，上海市天力化學(xué)試劑有限公司；鹽酸，上海市天力化學(xué)試劑有限公司；正己烷，天津渤海化工集團(tuán)供銷公司；乙腈，天津渤?；ぜ瘓F(tuán)供銷公司；其他常用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

手提式多功能粉碎機(jī)，天津市華鑫儀器廠；剖分式雙螺桿擠壓機(jī)，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院自行研制；HS-25型數(shù)字酸度計(jì)，上海偉業(yè)儀器廠；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋，天津常儀儀器設(shè)備有限公司；JJ-1型增力電動(dòng)攪拌器，上?？粕齼x器有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；BL-6000Y型微波干燥機(jī)，上海比朗儀器制造有限公司；FD5-3型冷凍干燥機(jī)，美國(guó)SIM公司；AL204型分析天平，北京京國(guó)藝科技發(fā)展有限公司； Waters型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 生物解離水解液的制備

大豆生物解離水解液制備流程[8]如下：大豆清理→粉碎→擠壓膨化(?？卓讖?8 mm、套筒溫度90℃、水分調(diào)節(jié)14%、螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min)→粉碎(過60目篩)→酶解(50℃，pH值9，3 h)→滅酶(沸水浴10 min)→離心(4 500 r/min, 20 min)→大豆生物解離水解液。

2.2 生物解離富肽豆粉的制備

采用微波干燥技術(shù)制備大豆生物解離富肽豆粉，在進(jìn)行微波干燥前，對(duì)大豆生物解離水解液進(jìn)行濃縮處理，隨后用2 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH值7.4，并用膜截留分子量為500 u的透析膜進(jìn)行脫鹽。依據(jù)前人實(shí)驗(yàn)，選取微波干燥條件為：進(jìn)口溫度140、150、160、170、180、190、200℃；固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%；進(jìn)料速率3、6、9、12、15、18、21 mL/min。將旋風(fēng)分離器和干燥塔中所得富肽豆粉用聚氯乙烯袋收集并密封，于干燥器中室溫(20℃)保存?zhèn)溆肹9]。

2.3 高效液相體積排阻色譜(HPLC-SEC)分析

聯(lián)用AKTA快速蛋白液相(FPLC)系統(tǒng)與10/300 GL Superdex TM 75型凝膠色譜柱測(cè)定樣品肽分子量分布。將不同微波干燥條件所得大豆生物解離高值粉溶解于磷酸緩沖液(0.05 mol/L，pH值6.8)中，得到質(zhì)量濃度1 mg/mL樣品，用孔徑為0.45 μm的親水性纖維素膜過濾，注入量500 μL，流動(dòng)相速率0.6 mL/min，在215 nm處進(jìn)行紫外檢測(cè)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品(磷酸化酶97.4 ku；牛血清蛋白66.2 ku；肌動(dòng)蛋白43 ku；碳酸酐酶31 ku；生長(zhǎng)激素22.0 ku；溶菌酶14.4 ku；胰島素5.5 ku)分子量對(duì)數(shù)值與洗脫體積的關(guān)系建立回歸方程[10]。

2.4 熒光光譜分析

對(duì)不同微波干燥條件生物解離富肽豆粉進(jìn)行熒光測(cè)定。將0.2 mg/mL的樣品溶液置于石英比色皿中，激發(fā)波長(zhǎng)285 nm，發(fā)散波長(zhǎng)掃描范圍300～500 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為5 nm[11]。

2.5 水溶性指數(shù)的測(cè)定

稱取(1±0.01) g生物解離豆粉于燒杯，加入15 mL蒸餾水進(jìn)行混勻，在室溫條件下磁力攪拌1 h后以5 000 r/min離心20 min。將上清液倒入蒸發(fā)皿，于105℃下干燥至質(zhì)量恒定，所得干物質(zhì)占所稱取豆粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)即為水溶性指數(shù)[12]。

2.6 分散性指數(shù)的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取10.00 g生物解離富肽豆粉放入100 mL 25℃的去離子水中，記錄粉體完全分散所用時(shí)間，分散性指數(shù)測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[13]。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行樣的平均值，結(jié)果采用SPSS 22.0分析軟件和Origin 8.0進(jìn)行處理，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

3 結(jié)果與分析

3.1 HPLC-SEC分析

已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)經(jīng)Sephadex G-75凝膠層析分離后，各蛋白質(zhì)分子量、分子量對(duì)數(shù)值和洗脫體積所得結(jié)果見表1。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分子量對(duì)數(shù)值與洗脫體積關(guān)系建立線性方程(圖1)。采用最小二乘法求出直線的回歸方程為

y=-0.048 8x+5.304 4

式中x——洗脫體積，mL

y——分子量對(duì)數(shù)值

采用該回歸方程可以根據(jù)某蛋白的洗脫體積估算出其分子量。

表1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的分子量與洗脫體積關(guān)系Tab.1 Relationship of protein standard sample and retention volume

圖1 分子量對(duì)數(shù)值與洗脫體積關(guān)系Fig.1 Logarithm relationship of molecular weight as a function of retention volume

采用體積排阻-凝膠色譜(HPLC-SEC)方法研究在不同微波干燥條件下生物解離富肽豆粉中蛋白(肽)類分子量大小及其分布情況。不同微波干燥進(jìn)口溫度條件下生物解離富肽豆粉蛋白(肽)類分子量分布見表2。

由表2可知，洗脫譜圖的排阻時(shí)間位置存在1個(gè)主峰，微波干燥條件的不同對(duì)出峰時(shí)間無明顯影響，但對(duì)峰的強(qiáng)度影響明顯，即在數(shù)量上影響蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。根據(jù)圖1分子量對(duì)數(shù)值與洗脫體積關(guān)系的線性方程換算出各峰的分子量分布發(fā)現(xiàn)，先出峰的為分子量大于44 ku的蛋白質(zhì)，后出現(xiàn)的一系列峰為分子量小于18 ku的肽，數(shù)量最多的蛋白質(zhì)水解物分子量為18～44 ku，占總蛋白質(zhì)類的73.47%～89.36%，其主要亞基成分為大豆球蛋白，這與VIRGINIE等[14]研究所得大豆球蛋白是大豆水解產(chǎn)物較高的組成成分相似。這可能是由于不同微波干燥條件下的物相轉(zhuǎn)換率和分子間碰撞機(jī)會(huì)不同，蛋白纖維化聚集形成的速度不同，從而對(duì)生物解離富肽豆粉分子量產(chǎn)生影響。

3.2 熒光光譜分析

內(nèi)源熒光光譜主要用于表征色氨酸殘基附近微環(huán)境極性的變化，用于反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。色氨酸的最大熒光強(qiáng)度和熒光峰位受微環(huán)境變化的影響，熒光強(qiáng)度的變化與熒光猝滅有關(guān)；熒光峰位藍(lán)移表示色氨酸附近微環(huán)境極性降低，紅移則表示色氨酸附近微環(huán)境極性增加[15]。不同微波干燥條件生物解離富肽豆粉的熒光光譜如圖2所示。

表2 不同微波干燥條件下生物解離富肽豆粉的蛋白質(zhì)分子量分布Tab.2 Molecular weight distribution (MWD) of spray dried EAEP soy skim powders

注：同一參數(shù)同一列的不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 不同微波干燥條件下生物解離富肽豆粉熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectra of soy skim powder under different spray drying conditions

由圖2可知，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為285 nm時(shí)，生物解離富肽豆粉在不同微波干燥進(jìn)口溫度、不同轉(zhuǎn)速以及不同固形物含量條件下的最大吸收波長(zhǎng)均為355 nm。這表明微波干燥條件對(duì)色氨酸周圍空間結(jié)構(gòu)無明顯影響。由圖2a可知，當(dāng)微波干燥進(jìn)口溫度由140℃升到160℃時(shí)，生物解離富肽豆粉的熒光強(qiáng)度呈減小趨勢(shì)，隨著溫度繼續(xù)升高，熒光強(qiáng)度則呈增大趨勢(shì)，在200℃時(shí)熒光最強(qiáng)。由圖2b可知，當(dāng)進(jìn)料速度為19 r/min時(shí)，樣品熒光最強(qiáng)。這表明在19 r/min時(shí)，色氨酸的屏蔽作用最弱。

圖2c顯示，當(dāng)固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)由20%增加到35%時(shí)，生物解離富肽豆粉的最大熒光強(qiáng)度逐漸增大，當(dāng)料液固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加至50%，最大熒光強(qiáng)度減小。這可能是因?yàn)橐欢ǚ秶鷥?nèi)的固形物含量增加伴隨著物料中蛋白含量的增加，從而引起色氨酸含量增加，因此引起熒光強(qiáng)度增強(qiáng)；隨著固形物含量的繼續(xù)增加，糖類與蛋白分子交聯(lián)加劇，加強(qiáng)了其對(duì)色氨酸殘基周圍區(qū)域的屏蔽作用，熒光強(qiáng)度減弱[16]。

3.3 水溶性分析

水溶性是表征粉體復(fù)溶特性的重要指標(biāo)。水溶性高分子之所以溶于水是因?yàn)樵谒肿优c聚合物的極性側(cè)基之間形成了氫鍵。不同微波干燥條件生物解離富肽豆粉的水溶性指數(shù)如圖3所示。由圖3可知，較高的進(jìn)口溫度和較大的物料固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)都能使粉體顆粒具有較好的水溶性。依據(jù)GOULA等[17]的研究成果，粉體顆粒的殘留水分越低則水溶性越好，因此，當(dāng)微波干燥的進(jìn)口溫度升高，所得粉體顆粒的殘余水分少，則水溶性較好；增大物料固形物含量，可引起物料中蛋白質(zhì)類含量的增加，據(jù)DE ALMEIDA等[18]報(bào)道，蛋白質(zhì)的高溶解性可使所得粉體顆粒水溶性增強(qiáng)。MUZAFFAR[19]利用微波干燥生產(chǎn)酸角粉也得到相似趨勢(shì)。當(dāng)進(jìn)料速度增加，粉體顆粒水溶性減小，因?yàn)檩^大的進(jìn)料速率導(dǎo)致粉體顆粒的殘余水分增多，從而一定程度上減小粉體顆粒的水溶性。

圖3 不同微波干燥條件下生物解離富肽豆粉水溶性指數(shù)Fig.3 WSI of soy skim powder under different spray drying conditions

3.4 分散性分析

分散性是速溶豆粉的功能特性之一。不同微波干燥條件所得生物解離富肽豆粉的分散性指數(shù)如圖4所示。由圖4可知，生物解離富肽豆粉的分散性隨著溫度的升高而呈上升的趨勢(shì)，且上升幅度較大，而隨著進(jìn)料速度的提高，生物解離富肽豆粉的分散性明顯下降。隨著固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，生物解離富肽豆粉的分散性呈增加趨勢(shì)，但當(dāng)固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到40%以后其分散性則隨著固形物含量的增加而減少。較高微波干燥溫度促使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)伸展，也能引發(fā)不溶性蛋白質(zhì)裂解為可溶性蛋白質(zhì)，有助于提高生物解離富肽豆粉的分散性[20-21]。分散性先會(huì)隨著固形物含量的增加而增加，這是因?yàn)榇蠖沟鞍字饕煞智虻鞍椎挠H水性側(cè)鏈基團(tuán)(鹽鍵、酯鍵等)絕大多數(shù)處于其分子表面，易分散于水中[22]，但隨著蛋白濃度的繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)分子之間的相互作用和分子聚集的作用也隨之加劇，蛋白質(zhì)分子隨機(jī)聚成簇，并進(jìn)一步聚集成厚的索狀結(jié)構(gòu)從而形成粗糙型凝膠，則會(huì)導(dǎo)致分散性下降[23]。

圖4 不同微波干燥條件下生物解離富肽豆粉分散性指數(shù)Fig.4 Dispersibility of soy skim powder under different spray drying conditions

4 結(jié)束語

以生物解離大豆水解液為研究對(duì)象，運(yùn)用高效液相凝膠排阻色譜技術(shù)研究了不同噴霧-微波干燥條件對(duì)富肽豆粉中蛋白類物質(zhì)亞基組分和空間構(gòu)象變化規(guī)律，并對(duì)生物解離富肽豆粉的粉體性質(zhì)及功能性質(zhì)進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，微波干燥條件對(duì)HPLC-SEC分離主峰的強(qiáng)度影響明顯，分子量18～44 ku的蛋白質(zhì)水解物約占總蛋白質(zhì)類的73.47%～89.36%，主要亞基成分為大豆球蛋白。此外，生物解離富肽豆粉的水溶性和分散性在不同微波干燥條件下具有相似趨勢(shì)，與粉體殘余水分量、分子運(yùn)動(dòng)劇烈程度、分子構(gòu)象變化及分子聚集與裂解有關(guān)。