復(fù)合酶酶解作用對豆粉溶解性的影響

陳龍，林艷春，范志軍，王冬梅，于愛華

（黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責(zé)任公司，黑龍江佳木斯154000）

我國是大豆的故鄉(xiāng)。大豆是五大油料作物之一，是我國主要的糧食作物，也是植物蛋白質(zhì)的重要來源。同時(shí)大豆?fàn)I養(yǎng)豐富，大約含有40%的蛋白質(zhì)、25%的碳水化合物和18%的脂肪，此外，含有豐富的生物活性物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)成分，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值[1]。因此，利用大豆制備的豆粉具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，食用方便，深受消費(fèi)者喜愛。豆粉的生產(chǎn)主要有干法制備豆粉、半干法制備豆粉和濕法制備豆粉3 種方法。

目前，濕法工藝是制備豆粉最常用的方法，其工藝過程一般是將大豆浸泡后磨漿，再經(jīng)濃縮調(diào)配及噴霧干燥制得豆粉[2]。然而，由于豆粉中脂肪含量較高且大豆蛋白的疏水性較強(qiáng)，因而若噴霧干燥時(shí)形成的豆粉顆粒比重輕、不具有多孔的毛細(xì)管結(jié)構(gòu)，使得豆粉溶解性不高，氮溶解指數(shù)為70%～80%[3]，存在沖調(diào)性差等問題，影響了豆粉的食用性，給豆粉的推廣帶來了一定障礙。提高豆粉溶解性的方法有很多，如酶解處理、添加還原劑和乳化劑、超聲處理等[4]。

近年來，已經(jīng)有關(guān)于提高豆粉溶解性的報(bào)道，由于大豆中含有的油脂較多，在水中的乳化性不好，影響了豆粉的溶解性，因此添加一定量的乳化劑可以提高豆粉的溶解性，宋清等[5]利用流化床噴涂技術(shù)將卵磷脂噴涂到豆粉中，能夠明顯提高豆粉的溶解性；超聲波的空穴效應(yīng)能夠增加豆粉中蛋白質(zhì)的溶出率，提高豆粉的溶解性，梁歧等[6]利用超聲波處理經(jīng)濕磨后的大豆?jié){渣混合液態(tài)物，使豆乳蛋白含量相對提高6.6%，豆乳干物質(zhì)重量相對提高11.6%，提高了豆粉的溶解性，齊寶坤等[3]采用超聲聯(lián)合酶解法制備豆粉，生產(chǎn)出豆粉的溶解性比傳統(tǒng)豆粉的溶解性提高10%；酶解技術(shù)也得到了廣泛的應(yīng)用，尋崇容等[7]利用堿性蛋白酶酶解豆粉，制備出了高溶解性、高消化率的豆粉。魯緋等[8]研究了內(nèi)切酶和外切酶對脫脂豆粉酶解條件的影響，發(fā)現(xiàn)利用外切酶酶解脫脂豆粉的水解度為26.7%。Bu?ko S 等[9]研究了堿性蛋白酶和胃蛋白酶水解南瓜籽分離蛋白對其溶解性的影響，這兩種酶均可以提高南瓜籽分離蛋白的溶解性。郭榮佳[10]研究了3 種蛋白酶對大豆分離蛋白的酶解作用，發(fā)現(xiàn)Alcalase堿性蛋白酶的酶解效果最好，且提高了大豆分離蛋白的溶解性。

酶解是一種無污染、反應(yīng)條件溫和、能耗低的處理技術(shù)，酶解作用可以提高豆粉的乳化性、溶解性等。但目前利用酶解技術(shù)提高豆粉溶解性主要選用的單一的蛋白酶，不僅對提高豆粉溶解性有一定的限制，而且還可能影響豆粉的風(fēng)味。

因此，本文利用3 種蛋白酶（風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶）對豆粉進(jìn)行酶解處理，對3 種酶的配比進(jìn)行篩選，通過響應(yīng)面法對酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，改善豆粉的溶解性，并且對生產(chǎn)出的豆粉進(jìn)行粒徑、蛋白含量、可溶性膳食纖維含量、顯微結(jié)構(gòu)的分析，酶解作用不僅可以提高豆粉的溶解性，而且可以增加豆粉中多肽的含量，提高豆粉的營養(yǎng)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆：哈爾濱九三油脂集團(tuán)；堿性蛋白酶（20 萬U/g～40 萬 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（20 萬 U/g～40 萬 U/g）、木瓜蛋白酶（20 萬U/g～40 萬U/g）：北京索萊寶生物科技有限公司；麥芽糖漿：山東欣鼎生物科技有限公司；對苯二甲醛、乙醇、四硼酸鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉（sodium dodecylsulphate，SDS）：北京索萊寶生物科技有限公司；絲氨酸：Sigma 公司；其它試劑均為分析純。

L18-YJ08 豆?jié){機(jī)：九陽股份有限公司；pHS-25 pH 計(jì)：上海江儀儀器有限公司；HWS24 電熱恒溫水浴鍋：余姚市東方電工儀器廠；GL-21M 型高速冷凍離心機(jī)：上海市離心機(jī)械研究所；UTL2000 型乳化機(jī)：德國IKA 儀器設(shè)備公司；LP-2200G 噴霧干燥機(jī)：無錫昂益達(dá)機(jī)械有限公司；TU-1800 紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Mastersizer 2000 型粒度儀：英國馬爾文儀器有限公司；K12 全自動凱氏定氮儀：上海晟聲自動化分析儀器有限公司；Vortex-M 漩渦震蕩儀：上海圣科儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豆粉的制備

大豆→精選→浸泡→熱燙→磨漿→酶解→煮漿→殺菌→濃縮→均質(zhì)→噴霧干燥

精選后的大豆與水按照1 ∶7（g/mL）料液比混合，添加0.5%的NaHCO3，調(diào)節(jié)pH 值至7.0 進(jìn)行磨漿處理，過濾處理后得到豆乳，調(diào)節(jié)豆乳的溫度和pH 值，加入復(fù)合蛋白酶[木瓜蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶∶堿性蛋白酶=1 ∶1 ∶1（質(zhì)量比）]進(jìn)行酶解處理，酶解后 95 ℃滅酶5 min，向酶解后的豆乳中添加2%的麥芽糖漿調(diào)配混勻，調(diào)配好的豆乳在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min 下進(jìn)行乳化，乳化后進(jìn)行真空濃縮至豆乳固形物含量達(dá)15%左右，然后在進(jìn)口溫度為185 ℃、出口溫度為85 ℃條件下進(jìn)行噴霧干燥即得豆粉。

1.2.3 酶解工藝的單因素試驗(yàn)

研究表明，豆粉的溶解性主要受酶的添加量、酶解溫度、時(shí)間、pH 值等因素的影響。以豆粉的分散系數(shù)為指標(biāo)，分別考察酶的添加量（0.38%、0.75%、1.13%、1.5%、1.88%）、酶解溫度（40、50、60、70 ℃）、時(shí)間（15、30、45、60 min）、pH 值（2、4、6、8）對豆粉溶解性的影響。

1.2.4 酶解工藝響應(yīng)面優(yōu)化確定試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以豆粉的分散系數(shù)為響應(yīng)值，選取酶添加量、酶解溫度、時(shí)間、pH 值4 個(gè)因素，通過響應(yīng)面分析法對工藝條件進(jìn)行四因素五水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化酶解條件對豆粉溶解性影響的工藝參數(shù)。響應(yīng)面分析因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析及因素水平Table 1 Encodetable of factors and levels

1.2.5 水解度的測定

采用鄰苯二甲醇（O-phthalaldehyde，OPA）的方法進(jìn)行測定[11]，具體操作方法：10 mL 的 50 mmol/L 的OPA（溶于乙醇），5 mL 的 20%的 SDS，75 mL 的硼酸鹽緩沖溶液混合均勻后，避光保存。20 μL 樣品與2.4 mL的OPA 試劑混合，在35 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 min 后，在340 nm 下測定其吸光度值。計(jì)算公式如下：

式中：Wserine-NH2為每克蛋白質(zhì)中含serine-NH2的量，mmol/g；Cserine-NH2為蛋白質(zhì)濃度，mol/L；X 為樣品質(zhì)量，g；P 為樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；V 為樣品水解液體積，L；N 為水解液稀釋倍數(shù)；h 為水解過程中，每克豆粉蛋白被斷裂的肽鍵數(shù)，mmol/g；α、β 分別為常數(shù) 1.00、0.40。

1.2.6 豆粉分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）的測定

取一定量豆粉樣品以1 ∶20（g/mL）的料液比分散于蒸餾水中，充分?jǐn)嚢?0 min，待分層后將溶解液于3 000 r/min 下離心10 min，離心后取上清液測定蛋白含量[12]。蛋白質(zhì)分散指數(shù)的計(jì)算公式如下：

蛋白質(zhì)的分散指數(shù)/%=（上清液中蛋白質(zhì)含量/豆粉中蛋白質(zhì)含量）×100

1.2.7 粒徑分布

采用Mastersizer 2000 型粒度儀測定豆粉的粒徑分布。將一定量的豆粉溶于去離子水中，并稀釋2 000 倍，其中顆粒折射率為1.46，分散劑折射率為1.33，吸收參數(shù)為0.001[13]，測定溫度為25 ℃，平衡時(shí)間為2 min，計(jì)算3 次重復(fù)試驗(yàn)得到的平均值。

1.2.8 豆粉溶液的顯微結(jié)構(gòu)

通過正置顯微鏡對傳統(tǒng)豆粉、風(fēng)味蛋白酶豆粉、木瓜蛋白酶豆粉、堿性蛋白酶豆粉及復(fù)合酶豆粉進(jìn)行觀察。分別將上述豆粉按照1 ∶10（g/mL）的料液比分散于去離子水中，利用漩渦振蕩儀進(jìn)行混勻，取混合后的豆粉溶液置于載玻片上，蓋上蓋玻片在20 倍下進(jìn)行顯微鏡觀察。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 20.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、多重比較分析和相關(guān)性分析，結(jié)果以x±s（n=3）表示，顯著性水平為P＜0.05，極顯著水平為p＜0.01。同時(shí)采用Design Expert 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，采用Oringin 8.5 作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解工藝單因素確定試驗(yàn)

2.1.1 酶的添加量對豆粉溶解性的影響

酶的添加量對豆粉溶解性的影響見圖1。

圖1 酶的添加量對豆粉溶解性的影響Fig.1 Effect of the amount of enzyme added on the solubility of soybean powder

由圖1 可知，隨著酶添加量的增加，豆粉的溶解性顯著的增加（p＜0.05），在1.13%的添加量時(shí)豆粉的溶解性達(dá)到最大為89.79%，酶添加量繼續(xù)增加時(shí)，豆粉的溶解性呈降低的趨勢這可能是由于復(fù)合酶添加量的增加，使得豆粉中更多的蛋白質(zhì)與酶接觸發(fā)生酶解反應(yīng)，因而增加豆粉的溶解性；當(dāng)添加量達(dá)到一定量時(shí)，底物與酶充分反應(yīng)，底物消耗完畢，因此不會進(jìn)一步的發(fā)生酶解反應(yīng)，使其溶解性有降低的趨勢。這一研究結(jié)果，與魯緋等[7]研究結(jié)果相似。綜合考慮，選擇酶的添加量為1.13%。

2.1.2 酶解時(shí)間對豆粉溶解性的影響

酶解時(shí)間對豆粉溶解性的影響見圖2。

圖2 酶解時(shí)間對豆粉溶解性的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the solubility of soybean powder

隨著酶解時(shí)間的增加，豆粉的溶解性呈現(xiàn)顯著增加的趨勢（p＜0.05），在 45 min 時(shí)豆粉的溶解性達(dá)到最大，為89.45%，這可能是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的增加，酶與底物接觸的更充分，酶解反應(yīng)發(fā)生的更徹底，增加了豆粉的溶解性；當(dāng)酶解時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，豆粉的溶解性反而有降低的趨勢，這可能是因?yàn)槊副旧淼淖饔檬怯邢薜模^長的酶解時(shí)間并不能增加酶解反應(yīng)的效率，因而降低豆粉的溶解性。這一研究結(jié)果與竇屾等[14]的研究結(jié)果相似。綜合考慮，豆粉酶解的最佳時(shí)間為45 min。

2.1.3 酶解溫度對豆粉溶解性的影響

酶解溫度對豆粉溶解性的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對豆粉溶解性的影響Fig.3 Effect of enzymatic temperature on solubility of soybean powder

隨著溫度的增加豆粉的溶解性呈現(xiàn)顯著的增加，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，豆粉的溶解性最大，達(dá)到89.45%，這可能是因?yàn)樵谳^低的溫度下復(fù)合蛋白酶的活性較低，不足以與豆粉發(fā)生酶解反應(yīng)，當(dāng)溫度接近60 ℃時(shí)即為復(fù)合蛋白酶的最適反應(yīng)溫度，因此豆粉的溶解性達(dá)到最大；而當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，豆粉的溶解性呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，這可能是因?yàn)?，較高的溫度不僅會使復(fù)合蛋白酶變性，失去活性，而且還會使豆粉中本身的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合，導(dǎo)致豆粉的溶解性降低。這一結(jié)果與劉恩岐等[15]的研究相似。綜合考慮，酶解豆粉的最適溫度為60 ℃。

2.1.4 酶解pH 值對豆粉溶解性的影響

圖4 為酶解pH 值對豆粉溶解性的影響。

圖4 酶解pH 對豆粉溶解性的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis pH on soybean powder solubility

隨著pH 值的增加，豆粉的溶解性顯著的增加，在pH 值為6 時(shí)，豆粉的溶解性達(dá)到最大，為86.55%，而當(dāng)pH 繼續(xù)增加時(shí)，豆粉的溶解性明顯的降低。這可能是因?yàn)樵谥行詶l件下，復(fù)合蛋白酶的活性最高，溶解性最大，而過酸或者過堿的條件會使復(fù)合蛋白酶變性失活，同時(shí)也會使豆粉中的蛋白質(zhì)變性，發(fā)生聚集現(xiàn)象，因此降低了豆粉的溶解性。這一研究結(jié)果與王玲等[16]的研究結(jié)果相似。綜合考慮，酶解豆粉的最適pH值為6。

2.2 酶解工藝對豆粉溶解性影響的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以豆粉溶解性R 為響應(yīng)值，以A 復(fù)合酶的添加量、B 酶解時(shí)間、C 酶解溫度、D 酶解 pH 值為采用軟件DesignExpert 進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果（n=3）Table 2 Experiment scheme and results（n=3）

通過統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型如下：

R=88.97+2.77A+1.31B-0.72C-0.02D+0.26AB-1.33AC+1.01AD+0.22BC+0.50BD+0.93CD-2.30A2-1.32B2-3.75C2-4.34D2

對模型方程進(jìn)行方差分析，回歸與方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸與方差分析結(jié)果Table 3 Results of regression and variance analysis

由表3 可知，該模型回歸顯著（p＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05），并且該模型R2=97.7%，說明該模型與試驗(yàn)擬合良好，能夠很好地描述試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用該模型進(jìn)行試驗(yàn)分析是可行的。由F 檢驗(yàn)可以得到因子貢獻(xiàn)率為：酶的添加量（A）＞酶解時(shí)間（B）＞酶解溫度（C）＞酶解pH 值（D）。兩因素交互作用（顯著項(xiàng)）對蛋白質(zhì)分散指數(shù)影響的響應(yīng)面見圖5。

通過軟件Design-Expert 對回歸模型進(jìn)行分析可知，當(dāng)復(fù)合酶的添加量為1.13%，酶解時(shí)間為45 min，酶解溫度為60 ℃，酶解pH 值為6 時(shí)，豆粉的溶解性有最大值為89.98%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)的可操作性，將優(yōu)化的酶解工藝參數(shù)修正為：復(fù)合酶的添加量為1.2%，酶解時(shí)間為45 min，酶解溫度為60 ℃，酶解pH 值為6。在修正后的最優(yōu)工藝條件下，進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)取平均值，蛋白質(zhì)分散指數(shù)的平均值為89.45%與預(yù)測值89.98%較接近，說明響應(yīng)值的試驗(yàn)值與回歸方程預(yù)測值吻合良好，得到的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，可用于指導(dǎo)實(shí)踐。與未經(jīng)酶解處理的豆粉（蛋白質(zhì)分散指數(shù)為72.34%）相比，復(fù)合酶解法制備的豆粉溶解性提高了近15 個(gè)百分點(diǎn)，顯著提高了豆乳粉的溶解性。

2.3 豆粉的水解度

圖5 兩因素交互作用（顯著項(xiàng)）對蛋白質(zhì)分散指數(shù)影響的響應(yīng)面Fig.5 Response surface analysis of effective interaction（significant items）on protein dispersibility index

水解度在酶解動力學(xué)的研究中是非常重要的參數(shù)，它能充分反映酶的活性以及酶解產(chǎn)物的水解程度[17]。豆粉的水解度也能夠從側(cè)面反映出豆粉的溶解性。圖6 為不同種類蛋白酶對豆粉水解度的影響。

圖6 不同種類蛋白酶對豆粉水解度的影響Fig.6 Effect of different kinds of protease on the degree of hydrolysis of soybean powder

從圖6 中可以看出，未經(jīng)酶解的豆粉的水解度為0，復(fù)合蛋白酶的水解度顯著高于3 種單一酶的水解度（p＜0.05）。這可能是由于單一的蛋白酶只能水解專一的蛋白質(zhì)，其他蛋白質(zhì)不能被水解，而復(fù)合酶是一種混合酶，能夠?qū)Χ鄠€(gè)蛋白進(jìn)行酶解，從而增加其水解度。豆粉的水解度增加說明豆粉中水解的蛋白質(zhì)增加，大分子的蛋白質(zhì)變成了小分子的肽類，增加了與水的接觸面積，從而提高了溶解性[18]，同時(shí)大豆肽類具有抗氧化、抗癌等功效，增加了豆粉的營養(yǎng)價(jià)值。

2.4 豆粉的平均粒徑及PDI值

由斯托克斯定律知，液滴移動速度與其半徑平方成正比，因此豆粉乳液的溶解性及表觀黏度可能與液滴粒徑有關(guān)，粒徑越小，豆粉乳液的溶解性越強(qiáng)[19-20]。圖7 為不同種類豆粉的平均粒徑和PDI 值。

圖7 不同種類豆粉的平均粒徑及PDI 值Fig.7 Average particle size and PDI value of different types of soybean powder

未酶解的豆粉的粒徑較大，而且PDI 值相對較高，分布不均；單一蛋白酶進(jìn)行酶解的豆粉粒徑明顯比未酶解的豆粉粒徑小，說明酶解作用能夠降低豆粉的粒徑大小，但是PDI 值變化不明顯，分布不均勻，影響豆粉的溶解性；經(jīng)過復(fù)合酶酶解的豆粉粒徑和PDI值最小，說明經(jīng)過復(fù)合酶酶解的豆粉不僅豆粉的粒徑降低，而且分布均勻，對豆粉的溶解性起到了正向的作用。這一研究結(jié)果與田杰等[21]的研究相似，說明酶解作用能夠改善豆粉的粒徑大小，進(jìn)而增加豆粉的溶解性。

2.5 豆粉的顯微結(jié)構(gòu)

圖8 為不同種類豆粉的顯微結(jié)構(gòu)。

圖8 不同種類豆粉的顯微結(jié)構(gòu)Fig.8 Microstructure of different kinds of soybean powder

圖8a 中未經(jīng)酶解的豆粉的粒徑較大，并且分布不均，圖8b，圖8c，圖8d 為單一酶解的豆粉，豆粉的粒徑明顯變小，但粒徑的大小不均一，豆粉中有較大的顆粒，圖8e 為經(jīng)過復(fù)合酶酶解的豆粉，豆粉的粒徑明顯變小，并且分布均勻。從豆粉的顯微結(jié)構(gòu)圖中我們可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過復(fù)合酶酶解后的豆粉分布均勻，顆粒較小，進(jìn)一步證明了復(fù)合酶酶解豆粉與單一的蛋白酶相比有更好的溶解性，顆粒分布均勻，可以提高豆粉產(chǎn)品的外觀。

3 結(jié)論

本文利用復(fù)合蛋白酶對豆粉進(jìn)行酶解處理，通過對豆粉水解度、粒徑、PDI 值的測定以及豆粉顯微結(jié)構(gòu)的觀察，表明復(fù)合酶的酶解對豆粉的溶解性有顯著的作用。單因素試驗(yàn)表明酶的添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度、酶解pH 值對豆粉的溶解性都有顯著的影響；通過響應(yīng)面試驗(yàn)得到復(fù)合蛋白酶酶解豆粉的最優(yōu)工藝參數(shù)為：酶的最適添加量為1.2%，酶解時(shí)間為45 min，酶解溫度為60 ℃，酶解pH 值為6，此時(shí)豆粉的溶解性為89.45%，與傳統(tǒng)豆粉和單一蛋白酶酶解的豆粉相比，溶解性提高了15%。