神經生長因子及受體p75NTR在喉癌前病變及喉鱗狀細胞癌組織中的表達及臨床意義

申宇鵬，李曉明，靳海峰，賈立峰，陶振峰，宋 琦

喉腔是人體重要的組織器官，具有發(fā)音、呼吸、吞咽、防御等重要生理功能，喉部病變如未得到及時有效的治療，往往會影響患者重要生理功能甚至危及生命，探索有效途徑進行喉癌的綜合輔助治療成為頭頸腫瘤相關研究熱點[1]。喉癌及癌前病變的發(fā)生及惡性進展都處在機體生理環(huán)境中，受到內源性生長因子及相應受體調節(jié)網絡的營養(yǎng)支持。圍繞喉癌發(fā)病機制中表皮生長因子及其受體(epidermal growth factor receptor， EGFR)[2]、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)[3]、低氧誘導因子(HIF)[4]的作用都有研究報道。神經生長因子(nerve growth factor， NGF)歸屬神經營養(yǎng)素家族的成員，擁有酪氨酸蛋白激酶A(tyrosine kinase A， TrkA)及p75NTR受體，以往圍繞神經生長因子及其受體的研究多限于神經系統(tǒng)[5-6]，在頭頸鱗狀細胞癌組織中的表達及相關研究少有報道。我們前期研究已經證實，TrkA受體的高表達與喉癌的惡性進展及淋巴結轉移呈明顯相關[7]。本研究針對NGF及p75NTR受體在喉癌前病變及喉癌組織中的表達進行分析探討。

1 材料與方法

1.1標本來源及分組 標本選自解放軍白求恩國際和平醫(yī)院2006年7月—2009年7月經手術切除的喉鱗狀細胞癌組織42例，喉不典型增生病變14例，喉乳頭狀瘤6例，取正常喉黏膜11例作為對照組。喉鱗狀細胞癌組中男36例，女6例，平均年齡61歲。根據國際抗癌協(xié)會(UICC)標準(2002)劃分TNM分期。依據病理學診斷結果分組:高分化組(鱗癌Ⅰ級)21例,中、低分化組(鱗癌Ⅱ級和Ⅲ級)21例;根據術后病理報告分組:伴頸部淋巴結轉移組20例，無轉移組22例。喉乳頭狀瘤組男6例，平均年齡53歲；不典型增生組男12例，女2例，平均年齡55歲；正常對照組男9例，女2例，平均年齡56歲。3組病例均經病理學診斷明確。3組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，具有可比性。所有標本均經4%多聚甲醛溶液固定24 h,石蠟包埋切片,切片厚5 μm,每例標本先經蘇木精及伊紅(HE)染色觀察病理學特征,再進行免疫組化染色。

1.2抗體、試劑盒及儀器設備 p75NTR兔抗人單克隆抗體(ab52987)購自Abcam公司；Ki67單克隆抗體(sc-23900)及p63單克隆抗體(sc-8431)為Santa Cruz公司生產；β-NGF兔抗人多克隆抗體(bs-0067R)購自北京博奧森生物技術有限公司；即用型免疫組化試劑盒(SP-9002)及HRP-山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術公司。熒光顯微鏡(DMIRB，德國Leica)；石蠟切片機(RM2135，德國Leica)；組織包埋機(EG1140C，德國Leica)。

1.3免疫組化染色 石蠟標本行連續(xù)切片，先經脫蠟及乙醇水化后高壓抗原修復，然后給予免疫組化染色，采用常規(guī)SP法，將上述準備組織切片滴加3%過氧化氫溶液滅活過氧化物酶活性；山羊血清封閉非特異性顯色；滴加一抗(p75NTR單克隆抗體稀釋度1∶50)4℃孵育過夜；陰性對照組添加PBS抗體稀釋液代替一抗；經二抗、辣根鏈霉素卵白素作用后行DAB顯色，顯色滿意后給予蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明及中性樹膠封片。

1.4結果判定 NGF陽性細胞的胞漿及胞核內顯示棕黃色顆粒，p63及Ki67陽性顯色基本位于胞核內。NGF染色評估標準：高倍鏡下隨機選取5個視野(每個視野觀察細胞數(shù)≥150個)，按陽性細胞所占百分比及著色深淺度分別進行計分判定。①按視野中細胞著色深淺評分:細胞無顯色(0分)，淺棕黃色(1分)，深棕黃色(2分)。②按陽性細胞數(shù)占同類細胞數(shù)百分比評分：<5%為0分，5%～20%為1分，20%～40%為2分，40%～60%為3分，<61%為4分。取①、②兩項分值相加為最后得分：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，≥4分為強陽性(++)。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據分析，計數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗。α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1正常喉黏膜中NGF及p75NTR的表達 正常喉黏膜的復層鱗狀上皮主要包括：基底層、副基底層、棘狀層、顆粒層、角質層。喉黏膜中NGF染色非常淺淡，陽性細胞呈胞漿淺淡著色，部分伴隨胞核顯色，NGF陽性細胞主要分布于黏膜的基底層、副基底層和棘狀層，上棘狀層及顆粒層罕見顯色。參照預設評分標準，NGF表達分布與TrkA表達區(qū)域基本一致[7]，靠近黏膜表層著色淺淡。p75NTR陽性細胞主要為胞膜顯色，部分細胞的胞漿也有顯色。p75NTR僅表達于正常黏膜鱗狀上皮的基底層細胞，其他黏膜上皮層均無顯色。p75NTR陽性細胞于基底膜上方呈單排整齊排列，與下方間質組織分界清晰。p63陽性細胞主要分布于上皮的基底層和副基底層，胞核呈棕黃色，在黏膜基底層附近p63陽性細胞最密集。Ki67陽性細胞分布于副基底層附近，基底層無顯色。相鄰切片對比發(fā)現(xiàn)，p75NTR陽性染色嚴格分布于喉黏膜鱗狀上皮的基底層，與上方的Ki67陽性細胞層緊密相貼(見圖1，紅色箭頭標示陽性細胞)。

圖1 正常喉黏膜中神經生長因子、p75NTR及相關蛋白的表達(DAB×200)

2.2喉不典型增生黏膜中NGF及p75NTR的表達 對經病理學證實的喉不典型增生黏膜進行染色，NGF及p75NTR的表達均高于正常喉黏膜。不典型增生黏膜中p75NTR染色的強陽性率為57.1%,p75NTR表達已不局限于基底層，在副基底層及周圍層中也有分布，靠近基底部的染色較深，細胞膜及胞漿都有著色(圖2A)。NGF計數(shù)強陽性率僅為14.3%，NGF表達升高表現(xiàn)為陽性著色加深及分布范圍變廣，重度不典型增生中NGF陽性細胞廣泛分布至全層上皮，胞漿顯色更加明顯(圖2B)。NGF染色與Ki67染色分布區(qū)域相近，形態(tài)學分析NGF及p75NTR的高表達與上皮細胞的高增殖活力相伴隨(圖2C)。

圖2 喉部重度不典型增生黏膜中p75NTR、神經生長因子及Ki67的表達(DAB×200)

2.3喉乳頭狀瘤組織中NGF及p75NTR的表達 對病理學證實的7例喉乳頭狀瘤組織(4例發(fā)生癌變)做染色分析。喉乳頭狀瘤切片中p75NTR陽性細胞主要分布于腫瘤的基底細胞層，部分區(qū)域向上擴散至副基底層，陽性細胞的胞膜及胞漿均有著色，深染色區(qū)域集中于乳頭狀外向生長的基底部。NGF的表達在喉乳頭狀瘤組織中明顯高于正常喉黏膜，乳頭狀瘤的腫瘤全層均可見NGF染色，細胞胞漿顯色為主。我們觀察到在乳頭狀瘤發(fā)生癌變的區(qū)域，NGF、p75NTR、Ki67表達均呈現(xiàn)明顯上升，該區(qū)域p75NTR陽性染色范圍擴大，細胞極性紊亂，提示乳頭狀瘤發(fā)生癌變的細胞存在高增殖活力。見圖3。

圖3 人乳頭狀瘤組織中p75NTR、神經生長因子及Ki67的表達(DAB×200)

2.4喉鱗狀細胞癌組織中NGF及p75NTR的表達 喉鱗狀細胞癌組織中，p75NTR的表達呈明顯的區(qū)域性分布。分化程度較高的喉鱗狀細胞癌組織中，p75NTR陽性細胞主要位于癌巢的周邊基底層細胞，以胞膜顯色為主，中央區(qū)細胞幾乎無陽性染色(圖4)，與p63的陽性分布區(qū)域基本接近。中分化喉鱗狀細胞癌組織中，p75NTR陽性細胞分布由癌巢基底層及浸潤緣擴展至周邊范圍(圖5)。低分化喉鱗狀細胞癌組織中，p75NTR陽性染色區(qū)更為廣泛和分散，陽性細胞多數(shù)呈胞漿顯色為主，缺失了分布區(qū)域性。低分化喉鱗狀細胞癌中p75NTR陽性細胞雖然廣泛分布，但是胞膜染色強度有所降低。高分化喉鱗狀細胞癌中p75NTR陽性細胞多呈胞膜及胞漿顯色，而低分化喉鱗狀細胞癌中p75NTR陽性細胞少有胞膜深染，胞漿顯色為主。形態(tài)學研究證實喉鱗狀細胞癌組織中p75NTR陽性細胞的分布具有區(qū)域特異性。喉鱗狀細胞癌組織中NGF陽性染色范圍廣泛，42例標本中僅3例(7%)呈陰性表達。多數(shù)標本中可見NGF陽性細胞分布于腫瘤各層，以胞漿陽性染色為主，NGF染色無明顯區(qū)域性分布。與正常喉黏膜及乳頭狀瘤比較，喉鱗狀細胞癌組織內NGF表達有所升高，強陽性率達52.4%。

圖4 高分化喉鱗狀細胞癌組織不同病理分級中p75NTR及神經生長因子的表達情況(DAB×200)

圖5 中分化喉鱗狀細胞癌組織p75NTR、p63及Ki67的染色(DAB×200)

2.5喉鱗狀細胞癌組織中NGF的表達與頸部淋巴結轉移的關系 將42例喉鱗狀細胞癌標本根據頸部淋巴結術后病理學結果分為陽性淋巴結轉移組20例和無淋巴結轉移組22例，對2組切片的NGF表達情況進行染色對比分析。陽性淋巴結轉移組中NGF染色強陽性15例(75.0%)，無淋巴結轉移組為7例(31.82%)，陽性淋巴結轉移組中NGF染色強陽性率高于無淋巴結轉移組(χ2=6.025,P<0.05)。

3 討論

NGF是神經營養(yǎng)素家族首要成員，其擁有Trks以及p75NTR。p75NTR是腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor, TNFR)家族成員之一，廣泛分布于人體神經、上皮等組織系統(tǒng)及相應來源的腫瘤細胞中。研究表明，NGF等神經營養(yǎng)因子與其受體p75NTR和TrkA結合后，對組織細胞的生長、遷徙、分化及凋亡具有調節(jié)支持作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)NGF與其受體p75NTR和TrkA之間相互調節(jié)，影響機體細胞及腫瘤細胞的生長、增殖、分化。機體內正常喉黏膜上皮由自然修復增生至惡變進展，要經過量變到質變的過程，即由正常上皮、上皮增生、不典型增生至喉癌。喉癌前病變?yōu)榫植炕颦h(huán)境因素長期刺激造成的喉黏膜形態(tài)變化，疾病的進展受到眾多生長因子及受體信號途徑的調節(jié)支持。以往關于NGF及p75NTR的研究大多限于神經系統(tǒng)，在喉黏膜、癌前病變及喉癌中的表達及功能情況少有研究報道。我們通過免疫組化觀察NGF、p75NTR、Ki67等分子在喉黏膜、癌前病變及喉癌中的表達情況，為進一步研究該信號通路的功能奠定基礎。

正常喉黏膜中NGF陽性染色主要分布于黏膜基底層、副基底層和棘狀層，靠近黏膜表層幾乎不顯色。NGF陽性細胞的分布區(qū)域與TrkA陽性細胞分布區(qū)域基本一致。相比較p63陽性細胞主要分布于鱗狀上皮的基底層、副基底層，分布范圍比NGF更局限于基底部，但缺乏p75NTR表達的特異性。本研究結果顯示，正常喉黏膜中p75NTR僅表達于基底層細胞，在基底層細胞上方的各細胞層中均未染色。p75NTR陽性細胞沿基底膜排列整齊，與下方結締組織分界清晰。p63陽性細胞分布范圍較p75NTR廣泛，在靠近黏膜基底層周圍p63陽性細胞最為密集。Ki67陽性染色細胞多數(shù)分布于副基底層周圍，基底層沒有顯色。眾所周知，Ki67陽性細胞具有旺盛的增殖活力。此外，p75NTR陽性細胞嚴格分布于Ki67染色區(qū)域相貼的下方基底層，符合黏膜上皮干細胞的特征。p75NTR陽性細胞具有自我更新、分化成熟的能力，其可作為正常喉黏膜鱗狀上皮干細胞的良好標志物。

喉癌前病變是指臨床表現(xiàn)具有惡變潛能的喉部病變，由多種臨床癥狀、病理學特征和體征表現(xiàn)類似的疾病組成，主要包括：喉黏膜白斑病、喉角化病、喉乳頭狀瘤等。組織病理學表現(xiàn)為上皮單純增生和不典型增生。經病理學證實的喉不典型增生黏膜中，NGF及p75NTR的表達均高于正常喉黏膜。不典型增生黏膜中p75NTR表達并不局限于基底層，在副基底層及周圍層中也有分布，NGF陽性染色加深且分布范圍變廣。重度不典型增生中NGF陽性細胞廣泛分布至上皮全層，與Ki67染色分布變化一致，形態(tài)學分析NGF及p75NTR的表達升高與上皮細胞的高增殖活力相伴隨。乳頭狀瘤組織中p75NTR的深染色區(qū)域分布于腫瘤乳頭狀外向生長的基底層及副基底層。在乳頭狀瘤組織中，NGF表達高于普通黏膜上皮，特別是乳頭狀瘤發(fā)生癌變的區(qū)域，NGF、p75NTR及Ki67的表達水平相伴隨上升，p75NTR陽性細胞區(qū)域增大，細胞極性紊亂，證實乳頭狀瘤發(fā)生癌變的區(qū)域細胞具備高增殖活力。

p75NTR受體是一種單鏈跨膜糖蛋白，胞內結構域包含:腫瘤壞死因子受體相關因子(TNF-receptor associated factor， TRAF)結合位點、Ⅱ型死亡結構域、G蛋白激活域等分子結構，p75NTR的胞內域有與受體功能無關的特殊結構，這些都成為p75NTR介導多重信號轉導途徑的基礎[8]。近年來NGF及p75NTR受體在多種上皮及消化系統(tǒng)腫瘤中有相關研究報道，多數(shù)研究表明，p75NTR在腫瘤的發(fā)病及進展中具有重要作用，不同系統(tǒng)來源腫瘤中p75NTR受體通路的功能有明顯差別?，F(xiàn)有文獻報道，在胃癌[9]、膀胱癌[10]、前列腺癌[11]中p75NTR受體通路具有抑制腫瘤生長增殖的作用。對黑色素瘤[12]、食管癌[13]、舌鱗癌等研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR受體具備促進腫瘤生存進展的作用。p75NTR作為TNFR家族成員之一，具備抑制腫瘤細胞生長的結構基礎，已知能夠誘導激活下游凋亡信號通路。在對口腔鱗癌組織細胞中的研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR表達的上調及其分布區(qū)域特征的改變能夠預示患者治療后復發(fā)及預后不良[14]。Kojima等[15]發(fā)現(xiàn)，p75NTR與食管鱗癌干細胞相關性密切。因此目前p75NTR在各類腫瘤中的功能尚未明確，p75NTR在不同腫瘤中發(fā)揮的作用與組織細胞類型、分化狀態(tài)及微環(huán)境有關，同時也與細胞是否同時表達TrkA相關。

本研究發(fā)現(xiàn)，高分化喉鱗狀細胞癌中p75NTR陽性細胞主要分布于腫瘤癌巢周邊的基底層及與間質接觸的浸潤緣，與p63和Ki67的染色分布區(qū)域相接近，這些基底區(qū)及浸潤緣的細胞具有較強的增殖和自我更新潛力。伴隨分化程度的降低p75NTR分布范圍更加廣泛，逐漸缺失了分布區(qū)域性，陽性染色部位由胞膜向胞漿轉化，半定量評分法尚難以分辨p75NTR表達與喉癌臨床病理因素之間的關系，但我們推測胞漿內p75NTR表達上調與喉癌惡性進展有關聯(lián)。目前有關NGF及p75NTR依賴的促生存機制并未闡明，p75NTR能與TrkA協(xié)同作用調節(jié)NGF依賴的TrkA活化途徑，也可以通過自身信號通路來促進細胞增殖或誘導凋亡。p75NTR激活NF-κB途徑促進細胞存活已在嗜鉻細胞瘤PC12及泌乳素瘤細胞系中證實。已有研究支持TrkA受體對p75NTR受體的具體功能有直接影響，細胞中TrkA表達缺失時p75NTR能夠激活自身信號途徑，當同時表達TrkA受體時,p75NTR能夠輔助并增強NGF及TrkA信號通路的功能[16]。在喉癌組織中NGF及TrkA蛋白的表達已被形態(tài)學研究證實，我們推測喉癌組織中自分泌或旁分泌的NGF與p75NTR及TrkA受體一起促進腫瘤細胞生長。本研究結果顯示，陽性淋巴結轉移組中NGF染色強陽性所占比例高于無淋巴結轉移組，提示喉鱗狀細胞癌組織中NGF表達的升高與頸部淋巴結轉移相關，我們前期研究發(fā)現(xiàn)TrkA的高表達與喉癌頸部淋巴結轉移相關，因此NGF及TrkA受體表達增高與喉癌淋巴結轉移有關。

綜上所述，NGF及p75NTR受體與喉癌的發(fā)病、生長及惡性進展密切相關，研究如何調控或阻斷相關信號通路或許能夠為我們治愈腫瘤提供新的思路。