酵母菌和乳酸菌發(fā)酵葡萄皮渣生物飼料的研究

翟羽佳，張惠玲，張麗芝

（1.寧夏大學(xué)，寧夏 銀川 750021；2.銀川能源學(xué)院，寧夏 銀川 750105）

隨著葡萄酒釀造行業(yè)的不斷發(fā)展，其廢棄物——葡萄皮渣的產(chǎn)生量也日益增加。葡萄皮渣主要是葡萄皮、葡萄籽和葡萄梗等，是葡萄加工過程或葡萄酒生產(chǎn)過程產(chǎn)生的下腳料，營養(yǎng)價值豐富，并且集中于葡萄加工過程或葡萄酒生產(chǎn)過程，易于收集，因此，葡萄渣在飼料上的利用優(yōu)勢明顯[1]。

近年來，有較多關(guān)于葡萄皮渣綜合利用的研究報道，但主要集中于其有效成分提取工藝和生物活性方面的研究[2-3]，以及單純利用酵母菌發(fā)酵葡萄皮渣生產(chǎn)飼料的研究[4-5]。有學(xué)者使用香菇—酵母共生系統(tǒng)發(fā)酵冰葡渣飼料[6]，而對酵母菌和乳酸菌組合發(fā)酵葡萄皮渣生產(chǎn)飼料則鮮有報道。研究表明，乳酸菌和酵母菌之間穩(wěn)定的共培養(yǎng)是普遍存在的，因為該種共生作用可以增加微生物對于復(fù)雜食品系統(tǒng)的適應(yīng)性[7]，同時也能增加菌種之間的協(xié)作。利用酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵可以增加發(fā)酵產(chǎn)物的適口性，同時能發(fā)揮乳酸菌的益生作用和抑菌功能[8]。葡萄皮渣作為一種廉價且來源豐富的資源，用來生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白生物飼料具有很大的開發(fā)潛力。該研究以產(chǎn)朊假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌混合發(fā)酵葡萄皮渣生產(chǎn)生物飼料，根據(jù)發(fā)酵后產(chǎn)物的真蛋白含量變化情況，探討2種菌的共生關(guān)系，同時對葡萄皮渣固體培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得品質(zhì)優(yōu)良的發(fā)酵葡萄皮渣生物飼料，為拓寬飼料原料資源提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種：產(chǎn)朊假絲酵母菌（Candida tails）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）培養(yǎng)物，由山東落星生物工作室提供，均為斜面培養(yǎng)后2次活化得到的菌液。

1.1.2 原料與試劑：葡萄皮渣，由寧夏張裕摩塞爾15世酒莊有限公司提供；麩皮、玉米，市售；尿素、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等均為分析純。

1.1.3 葡萄皮渣固體培養(yǎng)基：葡萄皮渣75%，輔料（玉米∶麩皮=1∶1）25%，尿素 1.5%，硫酸銨 1.0%，磷酸二氫鉀1.0%，硫酸鎂 0.30%，料水比 1.0∶1.0，自然條件下pH值，稱取100 g置于500 mL三角瓶中。

1.1.4 主要儀器設(shè)備：高速萬能粉碎機，鼓風(fēng)干燥箱，電子天平，隔水式恒溫培養(yǎng)箱，控溫消煮爐，凱氏定氮裝置。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄皮渣發(fā)酵工藝：原輔料→混合→加水潤料→接種→混合→發(fā)酵→干燥→粉碎→發(fā)酵產(chǎn)品。

1.2.2 操作要點：①原輔料處理。葡萄皮渣經(jīng)50℃烘干24 h，粉碎，過40目篩；麩皮、玉米，粉碎過40目篩。②原料混合。尿素及無機鹽先溶于一定量的蒸餾水中，再與原輔料混合均勻，混合后的物料呈松散不結(jié)團(tuán)狀態(tài)。③接種。將活化的產(chǎn)朊假絲酵母菌菌液和嗜酸乳桿菌菌液按比例接入固體培養(yǎng)基。④發(fā)酵：取500 mL三角瓶，每瓶分裝100 g固體培養(yǎng)基，32℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)酵72 h，每日翻動2次。⑤干燥：在恒溫鼓風(fēng)干燥箱中50℃烘干至恒重。⑥粉碎。將干燥樣用粉碎機粉碎后過40目篩。

1.2.3 發(fā)酵菌種比例確定試驗

1.2.3.1 菌種間不同接種比例發(fā)酵試驗：為確定產(chǎn)朊假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌之間的合適配比，在葡萄皮渣固體培養(yǎng)基中按10%的接種量接入不同比例的混合菌種，設(shè)置的產(chǎn)朊假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌的配比分別為：A（2.0∶1.0）、B（1.5∶1.0）、C（1.0∶1.0）、D（1.0∶1.5）、E（1.0∶2.0）、F（空白對照組，發(fā)酵前），每個配比3次平行，自然條件下pH值，32℃恒溫培養(yǎng)72 h，低溫烘干至恒重，粉碎后測定其真蛋白含量。

1.2.3.2 不同接種量發(fā)酵試驗：2種菌按照5.0%、7.5%、10.0%、12.5%、15.0%的不同接種量接種到葡萄皮渣固體培養(yǎng)基中，每個接種量3次平行，自然條件下pH值，32℃恒溫培養(yǎng)72 h，低溫烘干至恒重，粉碎后測定其真蛋白含量。

1.2.4 固體培養(yǎng)基配方的優(yōu)化：將尿素、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂4個影響因素進(jìn)行4因素4水平L1645正交試驗，測定產(chǎn)物真蛋白含量，確定最佳培養(yǎng)基配方。

1.2.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化：將培養(yǎng)基投放質(zhì)量、溫度、時間、料水比4個因素進(jìn)行4因素3水平L934正交試驗，測定產(chǎn)物真蛋白含量，確定最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.2.6 發(fā)酵產(chǎn)物指標(biāo)的檢測：樣品中的水分、粗灰分、粗蛋白、鈣、總磷、粗脂肪、粗纖維按照國標(biāo)方法進(jìn)行測定?？偺堑臏y定方法：精確稱取原料試樣，經(jīng)過鹽酸水解、氫氧化鈉中和后定容，離心，采用DNS法[9]測定。真蛋白含量的測定：采用硫酸銅沉淀法[10]。

1.2.7 葡萄皮渣固體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分析：葡萄皮渣由于加工方式的不同，其營養(yǎng)成分也會有所差別。為滿足微生物生長需要，培養(yǎng)基中必須兼顧碳源、氮源、無機鹽、能量、生長因子和水分等營養(yǎng)要素。該試驗所用的葡萄皮渣來自紅提釀酒后的下腳料，為便于開展試驗，按1.2.2項下方法處理后，測定其營養(yǎng)成分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄皮渣固體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分析

由表1可知，葡萄皮渣含有較豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，但糖含量偏低，蛋白含量較少，需采用其他輔料補充其不足部分。玉米和麩皮含糖量較高，是理想的碳源，同時麩皮具有多孔性結(jié)構(gòu)利于發(fā)酵過程中的通氣。尿素和硫酸銨是常用的廉價氮源，不僅可以提高單細(xì)胞蛋白含量,同時可以促進(jìn)菌體生長，在微生物發(fā)酵中總是將二者混合使用，其效果要優(yōu)于單一使用[11]。磷酸二氫鉀和硫酸鎂作為能量來源和生長因子，對提高蛋白轉(zhuǎn)化有一定促進(jìn)作用，從而構(gòu)成營養(yǎng)全面的固體培養(yǎng)基，保證微生物的良好生長。

2.2 發(fā)酵菌種比例確定試驗

2.2.1 菌種間不同接種比例對發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響：由圖1可知，當(dāng)產(chǎn)朊假絲酵母菌與嗜酸乳桿菌比例為1.5∶1.0（B）時，產(chǎn)物的真蛋白含量最高（14.28%），當(dāng)配比為 2.0∶1.0（A）時，產(chǎn)物的真蛋白含量也較高（14.09%）。這2組發(fā)酵產(chǎn)物的表面被一層白色菌絲所覆蓋，菌絲體成塊，且具有濃郁的酸香氣味。

表1 葡萄皮渣及輔料的主要營養(yǎng)成分含量%

從試驗結(jié)果可以看出，當(dāng)產(chǎn)朊假絲酵母菌的添加比例較高時，發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量較高，由此可知，產(chǎn)朊假絲酵母菌對發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量影響較大，而嗜酸乳桿菌的影響較小。這主要是由于產(chǎn)朊假絲酵母菌在發(fā)酵過程中可以利用底物的營養(yǎng)成分在短時間內(nèi)合成菌體蛋白[12]，而乳酸菌在發(fā)酵中也是必不可少的，因為它在發(fā)酵中起到產(chǎn)酸的作用，可以抑制雜菌的生長，同時，產(chǎn)生的乳酸可以改善發(fā)酵飼料的適口性[13]。因此，確定產(chǎn)朊假絲酵母菌與嗜酸乳桿菌之間的最佳比例為 1.5∶1.0。

圖1 復(fù)合菌間不同接種比例對發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響

2.2.2 復(fù)合菌不同接種量對發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響：由圖2可知，隨著復(fù)合菌接種量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量也隨之增加，當(dāng)接種量為10.0%～12.5%時，發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量最高，但相差不大，當(dāng)接種量為15.0%時，真蛋白含量小幅降低，這可能是由于接種量過大，菌種生長較快，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，會釋放大量熱量，容易導(dǎo)致溫度過高，從而抑制菌體生長[13]；而接種量過小，發(fā)酵周期較長，發(fā)酵過程也容易污染雜菌。綜合以上因素以及試驗經(jīng)濟(jì)成本，確定最佳接種量為10.0%。

2.3 固體培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

圖2 復(fù)合菌不同接種量對發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量的影響

按照L1645正交試驗方案設(shè)計試驗，根據(jù)圖1、圖2的結(jié)果，因素水平如表2所示，16組試驗組合中的真蛋白含量結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。由表3、表4可知，因素A在α=0.05水平上顯著，因素C和因素D在α=0.25水平上顯著，因素B不顯著。主次因素順序為A＞D＞C＞B，最優(yōu)水平組合為A2B3C4D3，即葡萄皮渣固體培養(yǎng)基中最佳添加量為：尿素1.5%，磷酸二氫鉀1.5%，硫酸鎂0.4%，硫酸銨1.5%。與文獻(xiàn)研究相符，尿素、硫酸銨、硫酸鎂、磷酸二氫鉀4個因素對微生物生長均具有顯著作用[14-15]。

2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

根據(jù)上述試驗結(jié)果，按照L934正交試驗方案設(shè)計試驗，因素水平如表5所示，分別檢測9組試驗組合中的真蛋白含量，結(jié)果見表6。將表6中極差分析結(jié)果最次要的因素C作為空列，進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表7。影響微生物發(fā)酵的主要因素包括溫度、發(fā)酵時間、料水比、通氣條件等，產(chǎn)朊假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌混合發(fā)酵屬于好氧發(fā)酵，而發(fā)酵料的投放量直接影響發(fā)酵過程的通氣狀況，發(fā)酵料投放太多，通氣狀況不佳，不利于微生物的生長，發(fā)酵料投放太少、太薄，造成資源浪費又不可行。由表6、表7可知，培養(yǎng)基的投放量對發(fā)酵產(chǎn)物真蛋白含量影響最大，在α=0.05水平上顯著，其次是發(fā)酵時間和料水比，主次因素順序為A＞B＞D＞C，最優(yōu)水平組合為 A1B2C3D2，因發(fā)酵溫度影響不大，考慮到試驗成本，因素C選擇C2，最佳發(fā)酵條件為正交表中A1B2C2D2組合，即：培養(yǎng)基投放量 100 g/500 mL，料水比 1.0∶1.0，32 ℃發(fā)酵 72 h。

表2 培養(yǎng)基配方L1645正交試驗的因素和水平 %

表3 培養(yǎng)基配方L1645正交試驗方案及結(jié)果

表4 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗方差分析結(jié)果

表5 發(fā)酵工藝正交試驗L934的因素和水平

pH值是影響微生物生長代謝的關(guān)鍵因素之一，但固態(tài)發(fā)酵中某些物料的優(yōu)良緩沖性能有助于減少對發(fā)酵體系pH值控制的需要，所以固態(tài)發(fā)酵時，只要把初始pH值調(diào)到所需要的值，發(fā)酵過程通常不用檢測和控制pH值[16]。

2.5 發(fā)酵前后葡萄皮渣真蛋白含量變化

由表8可知，利用產(chǎn)朊假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌固態(tài)發(fā)酵葡萄皮渣，產(chǎn)物真蛋白含量變化明顯，發(fā)酵后產(chǎn)物的真蛋白含量較發(fā)酵前提高了4.35%，但發(fā)酵前后粗蛋白含量變化不大，這是因為一部分無機氮在發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化為菌體蛋白或含氮代謝產(chǎn)物類優(yōu)質(zhì)蛋白，提高了發(fā)酵產(chǎn)物的蛋白品質(zhì)，產(chǎn)物呈白色團(tuán)狀，具有濃郁的酸香氣味，這可能是酵母菌與乳酸菌共生產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)[17-18]。

表6 發(fā)酵工藝L934正交試驗方案及結(jié)果

表7 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗方差分析結(jié)果

3 討論

該研究利用產(chǎn)朊假絲酵母菌和嗜酸乳桿菌混合固態(tài)發(fā)酵葡萄皮渣生產(chǎn)生物飼料，確定了2種菌的接種比例為1.5∶1.0，接種量為10.0%，發(fā)酵產(chǎn)物的真蛋白含量較高，富含菌體蛋白，菌體成塊，氣味酸香。

只有營養(yǎng)全面、配比合適的發(fā)酵培養(yǎng)基，才能夠促進(jìn)微生物的生長、繁殖。該研究使用的培養(yǎng)基基礎(chǔ)成分為：葡萄皮渣75%，輔料25%（玉米∶麩皮＝1∶1），通過正交試驗進(jìn)一步確定了尿素及無機鹽最佳添加量為：尿素1.5%，硫酸銨1.5%，硫酸鎂0.4%，磷酸二氫鉀1.5%。最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵料投放量100 g/500 mL，料水比 1.0∶1.0，自然條件下pH值，32℃發(fā)酵72 h后，產(chǎn)物粗蛋白含量為21.48%，真蛋白含量為14.45%，發(fā)酵后產(chǎn)物的真蛋白含量較發(fā)酵前提高了4.35%，表明葡萄皮渣的飼用價值提高，此外，發(fā)酵后的葡萄皮渣具有酸香氣味，提高了其適口性。

表8 發(fā)酵前后葡萄皮渣粗蛋白和真蛋白含量

利用微生物間協(xié)作特性處理葡萄皮廢渣生產(chǎn)生物飼料，在提高蛋白質(zhì)含量的同時，產(chǎn)物中含有大量活性和非活性有益微生物，該方法投資小、見效快，可把發(fā)酵物包括菌體及其代謝產(chǎn)物和底物全部利用，既保留了活性成分又沒有廢液污染的問題；此外，發(fā)酵前基質(zhì)不用滅菌，因葡萄皮渣培養(yǎng)基自然顯酸性，可抑制一部分雜菌的生長，只要接入的發(fā)酵菌種達(dá)到一定比例，就會抑制其他雜菌的污染，能夠保證發(fā)酵質(zhì)量，從而減少了設(shè)備投資，節(jié)約了能耗。

根據(jù)發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)特性，發(fā)酵葡萄渣可以作為反芻動物的飼料，同時也屬于生物活性飼料。研究表明，日糧中添加益生菌可以調(diào)節(jié)反芻動物瘤胃pH值，從而促進(jìn)反芻動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高采食量。此外，益生菌的繁殖又反過來可以抑制病原微生物的繁殖，從而對動物機體起到增強免疫力和抗病力的作用[19]。