脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮對秀麗隱桿線蟲的聯(lián)合毒性研究

周鴻媛，唐莉莉，路勇，楊惠成，孫秀蘭，王加生,#，錢和,*

1. 江南大學(xué) 食品學(xué)院/食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122 2. 江南大學(xué) 食品安全國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122 3. 西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400716 4. 美國佐治亞大學(xué) 環(huán)境健康科學(xué)系，美國 佐治亞 雅典 30602 5. 中國食品藥品檢定研究院，北京 100050 6. 廣州廣電計(jì)量檢測股份有限公司，廣州 510630

糧食真菌毒素是一類存在于糧食中的真菌所產(chǎn)生的二級代謝產(chǎn)物。因其對生物體具有毒害作用且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、污染范圍廣泛，目前已成為威脅人類健康和環(huán)境安全的重要因素之一，受到廣泛關(guān)注[1]。總體來說，黃曲霉毒素(aflatoxins, Afla)、單端孢霉烯族毒素類、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)、伏馬菌素(fumonisin, FUM)、赭曲霉毒素A(AspergiltusOchratoxin, OTA)和麥角生物堿類被認(rèn)為是主要的生物毒素[2]。其中，黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)影響范圍最廣[3]，而DON在我國已成為污染量最大、污染范圍最廣的真菌毒素[4-5]。相關(guān)調(diào)查研究表明，全球范圍內(nèi)，越來越多的農(nóng)產(chǎn)品被檢出受到AFB1、DON和ZEN的單獨(dú)或共同污染[3,6]。一份來自于Biomin公司的調(diào)查顯示，在2010年中的3 300份送檢樣品(玉米、小麥、大麥、大米、大豆粉、玉米面筋粉、干酒糟和青貯飼料)中有78%樣品呈陽性，即受到Afla、DON、ZEN、FUM和OTA不同程度的污染。在此批次樣品中，同一樣品中測出含有2種及以上毒素的送檢樣品的比率高達(dá)42%[3]。至2013年，毒素聯(lián)合污染率仍居高不下(45%)[7]。由此可見，現(xiàn)實(shí)生活中食物可被多種真菌毒素污染，人類長期同時(shí)接觸多種真菌毒素，可對健康造成與單一毒素作用不同的危害。因此，開展對食品中多種毒素聯(lián)合毒性的評估，對指導(dǎo)食品安全、風(fēng)險(xiǎn)評估和公共健康等相關(guān)政策的制定以及未來研究發(fā)展方向具有極大的現(xiàn)實(shí)意義。

DON、AFB1和ZEN均為谷物及其制品中的常見污染物。研究表明，DON、AFB1和ZEN除對機(jī)體產(chǎn)生的各自最典型的毒作用(DON：拒食和細(xì)胞毒性；AFB1：三致作用；ZEN：類雌激素毒性)外，還存在一些交叉，如引起氧化應(yīng)激、蛋白合成受阻，導(dǎo)致免疫失調(diào)、生殖毒性等[8-15]。由此可推測，3種毒素共存時(shí)在一定程度上會產(chǎn)生相互作用，從而對其毒性產(chǎn)生影響(增強(qiáng)或減弱)。目前，基于這一猜想，“聯(lián)合毒性”這一概念已被提出，越來越多的學(xué)者對此展開了研究，但不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、?shí)驗(yàn)劑量間的研究結(jié)果存在差異，對多種毒素間的聯(lián)合毒性類型的評價(jià)也不相一致。Zhou等[16-17]研究表明，混合物AFB1+DON、DON+ZEN和AFB1+DON+ZEN均對HepG2人肝癌細(xì)胞(AFB1：0～5 μg·mg-1；DON：0～0.6 μg·mg-1；ZEN：0～11 μg·mg-1)和RAW 264.7鼠巨噬細(xì)胞(AFB1：0～3 μg·mg-1；DON：0～0.1 μg·mg-1；ZEN：0～12 μg·mg-1)產(chǎn)生協(xié)同/加和作用，混合物AFB1+ZEN則產(chǎn)生拮抗作用。而對BF-2藍(lán)鰓太陽魚細(xì)胞(AFB1：0～11.20 μmol·L-1；DON：0～16.20 μmol·L-1；ZEN：0～170.30 μmol·L-1)和野生型斑馬魚(AFB1：0～1.28 μmol·L-1；DON：0～135.00 μmol·L-1；ZEN：0～18.85 μmol·L-1)進(jìn)行DON和ZEN聯(lián)合暴露，則產(chǎn)生不同程度的拮抗作用，AFB1+ZEN卻產(chǎn)生協(xié)同作用，而AFB1、DON和ZEN三者混合則隨濃度的變化表現(xiàn)出不同的聯(lián)合毒性類型。此外，Ji等[18]發(fā)現(xiàn)，DON(2 mg·kg-1)和ZEN(20 mg·kg-1)聯(lián)合暴露對小鼠的肝臟代謝具有明顯的拮抗作用。而Smith等[19]在研究DON(0.2 μmol·L-1)和ZEN(20 μmol·L-1)對人肝細(xì)胞HepaRG蛋白質(zhì)組學(xué)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在毒素暴露1 h后，蛋白質(zhì)組分改變增多，而在暴露24 h后減少。由此可得，毒素的聯(lián)合毒性類型及強(qiáng)弱與毒素組合、暴露時(shí)間、混合比例和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ兔芮邢嚓P(guān)。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans,C.elegans)(后文均簡稱為線蟲)是一種可獨(dú)立生活的非寄生蟲類線蟲，因其生命周期短、繁殖速度快、產(chǎn)卵量大、身體透明、培養(yǎng)方便且操作簡單、成本低廉等優(yōu)勢，已被作為一種重要模式生物廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)和生物學(xué)研究中[20-23]。此外，通過全基因組測序方法、光消融技術(shù)和激光顯微技術(shù)破譯線蟲的全細(xì)胞系，并重建其神經(jīng)系統(tǒng)，已得到了大量的有關(guān)線蟲的生物學(xué)、遺傳學(xué)和基因組學(xué)的數(shù)據(jù)[24-26]。此外，線蟲有40%的基因已被證明與人類基因具有同源性，推斷以線蟲為模型的毒理學(xué)研究可在很大程度上反映人類對同種毒物所產(chǎn)生的毒理反應(yīng)[27]。目前，已有學(xué)者將線蟲作為人體健康與生態(tài)毒性的雙重模式動物，研究環(huán)境中重金屬或/和農(nóng)藥殘留單一或聯(lián)合暴露對機(jī)體的毒害作用，并逐步建立起了相對完整的研究體系[27-28]，但對糧食真菌毒素的毒性研究，鮮有報(bào)道。因此，本研究首次以線蟲為模型，對DON、AFB1和ZEN及其聯(lián)合毒性進(jìn)行評估，模擬毒素在現(xiàn)實(shí)生活中的存在模式，以國標(biāo)限量標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)設(shè)定實(shí)驗(yàn)暴露劑量，旨在為今后相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而指導(dǎo)人體健康效應(yīng)判斷與生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與線蟲品系

DON、AFB1和ZEN均購于Sigma-Aldrich公司(美國)，純度均≥98%。先將DON、AFB1和ZEN粉末分別溶于超純水、二甲基亞砜(DMSO，購于美國Sigma-Aldrich公司，純度≥99.9%)和無水乙醇(購于美國Sigma-Aldrich公司，純度≥99.9%)，制備成濃度為10 mg·mL-1的儲備液并避光存于-20 ℃。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用K-medium(2.36 g KCl, 3.00 g NaCl, 1 000 mL dH2O)稀釋成工作液，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

野生型Bristol品系線蟲(N2)和大腸桿菌菌株(OP50)均購于國際線蟲遺傳中心(CaenorhabditisGenetics Center/CGC)。所有實(shí)驗(yàn)用線蟲均為雌雄同體型。以線蟲標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法[29]為依據(jù)，將線蟲培養(yǎng)于以O(shè)P50作為食物源的固體線蟲生長培養(yǎng)基(NGM)上，其配制方法參照Brenner法[30]。選用L-broth[23]液體培養(yǎng)基對OP50進(jìn)行培養(yǎng)，作為線蟲暴露實(shí)驗(yàn)的食物源。所有線蟲培養(yǎng)均在20 ℃條件下進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 線蟲準(zhǔn)備

首先，向裝有孕期成蟲和及其蟲卵的NGM中加入適量K-medium，用L型玻璃涂布棒將其從NGM上刮下并收集到15 mL離心管中，3 000 r·min-1離心7 min，棄上清。然后，向沉淀中加入7 mL裂解液(8 mol·mL-1NaOH∶NaClO = 5∶1,V/V)[31]，靜置7 min，再3 000 r·min-1離心7 min，棄上清。隨后，加入12 mL K-medium輕輕混勻后3 000 r·min-1離心7 min，棄上清，重復(fù)此操作一次。最后，將沉淀接種到NGM上培養(yǎng)(20 ℃)。實(shí)驗(yàn)所用線蟲均為雌雄同體型。

1.2.2 線蟲生長發(fā)育測定

通過測定線蟲的身長(頭部-尾末)來衡量線蟲的生長發(fā)育情況。將同步化(L1/L2)的N2幼蟲從培養(yǎng)板中轉(zhuǎn)移到含有1 mL/孔特定毒素濃度和充足食物的12孔培養(yǎng)板中。每孔大約含有30～50條L1/L2期的線蟲，并放在belly button?振動器上低速搖晃，20 ℃。分別在24 h和48 h，用K-medium潤洗線蟲2次，再用10%福爾馬林固定。5 min后，將線蟲轉(zhuǎn)移到玻璃皿上，在連有數(shù)碼相機(jī)和Image-Pro?Express軟件程序的顯微鏡(Olympus SZX9)下觀察拍照。對照組和各劑量實(shí)驗(yàn)組均不少于20只線蟲，3組平行試驗(yàn)。

1.2.3 線蟲生殖能力測定

線蟲生殖能力通過后代數(shù)目來評價(jià)。本實(shí)驗(yàn)參照Dhawan 72小時(shí)法[31]，改良后簡述如下：將同步化(L1/L2)的N2幼蟲轉(zhuǎn)移到含有充足食物源的新NGM上，20 ℃培養(yǎng)直到L4末期。然后，挑出一只L4末期的線蟲放入裝有特定濃度毒素和充足食物(1 mL/孔)的12孔板中，放在振動器上低速搖晃，20 ℃培養(yǎng)72 h，各濃度3次平行試驗(yàn)。72 h后，在顯微鏡下記錄每孔里所有階段的線蟲數(shù)(不含蟲卵)。

1.2.4 毒素聯(lián)合毒性的Chou-Talalay評價(jià)方法

本實(shí)驗(yàn)采用Chou-Talalay法評價(jià)多種毒素共同存在時(shí)的聯(lián)合毒性類型[32]。該方法是基于中效原理和等效線原理，能可視化評估待測混合物中不同毒素間的相互作用。該計(jì)算模型要求混合物中各組分按固定比率混合，本實(shí)驗(yàn)混合比率為：AFB1∶DON∶ZEN = 1∶40∶5。在等輻射分析中，相互作用指數(shù)(CI)常在酶、細(xì)胞和動物體系中作為確定作用類型的指標(biāo)[32-33]。CI值可通過下列公式計(jì)算：

表1 聯(lián)合毒性分類標(biāo)準(zhǔn)及其相應(yīng)符號Table 1 Descriptions and symbols of the degrees of combined toxicity grading

注： 聯(lián)合毒性的等級分類及其相應(yīng)的符號均依據(jù)Chou所建立的理論[32]。Note: The degrees of combined toxicity and corresponding symbols were according to the theory build by Chou[32].

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

原始數(shù)據(jù)有Excel進(jìn)行分析處理，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，圖表中的結(jié)果均以對照組的百分比(%)表示。EC50由SPSS 21統(tǒng)計(jì)軟件中Probit回歸函數(shù)擬合得出，聯(lián)合毒性類型由Chou-Talalay方法進(jìn)行評價(jià)得出。采用t-test法評價(jià)實(shí)驗(yàn)組與對照組是否存在顯著性差異，one-way ANOVA法及Bonferroni檢測(SPSS 21)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間比較和差異顯著性檢驗(yàn)(P< 0.05、P< 0.01、P< 0.001)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 AFB1、DON和ZEN均對線蟲的生長發(fā)育和生殖能力產(chǎn)生劑量-效應(yīng)毒性

我國食品中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)GB2761—2011規(guī)定：谷物及其制品中，AFB1、DON和ZEN的限量需分別≤ 20、1 000、60 μg·kg-1。鑒于物種差異和不同暴露類型等因素存在，為獲得更能反映現(xiàn)實(shí)生活中的暴露水平，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)通常需考慮不確定/安全系數(shù)(100～1 000倍)[34]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用：20 mg·L-1AFB1、800 mg·L-1DON和100 mg·L-1ZEN(預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)ZEN濃度為60 mg·L-1時(shí)對線蟲體長作用效果不理想)作為高劑量組(不確定系數(shù)=1 000)；10 mg·L-1AFB1、400 mg·L-1DON和50 mg·L-1ZEN作為中劑量組(1/2高劑量組濃度)；2 mg·L-1AFB1、80 mg·L-1DON和10 mg·L-1ZEN作為中劑量組(1/10高劑量組濃度)。分別對線蟲進(jìn)行染毒，并在24 h和48 h測定線蟲體長的變化量，72 h測定線蟲的產(chǎn)卵量。AFB1、DON和ZEN對線蟲生長發(fā)育和生殖能力的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)見表2。結(jié)果顯示，AFB1隨著暴露時(shí)間的增長，毒素對生長發(fā)育的抑制作用隨之增強(qiáng)(EC50-24 h =9.49 mg·L-1> EC50-48 h =5.10 mg·L-1)，DON則與之相反(EC50-24 h =476.42 mg·L-1< EC50-48 h =1 309.38 mg·L-1)，而ZEN并無明顯變化(EC50-24 h =56.69 mg·L-1≈ EC50-48 h =55.31 mg·L-1)。此外，各暴露組均與其對應(yīng)的對照組存在顯著性差異，且隨著AFB1、DON和ZEN暴露劑量的增加，對線蟲的生長發(fā)育和生殖能力的抑制作用呈顯著的劑量-效應(yīng)正相關(guān)性(圖1)。

2.2 AFB1、DON和ZEN對線蟲的聯(lián)合毒性類型由毒素的組合及暴露劑量共同決定

由圖1可見，各模型組均隨著暴露劑量的增加，毒作用也相應(yīng)增強(qiáng)，存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。其中，AFB1+DON和AFB1+ZEN分別與AFB1、DON和ZEN的單一暴露相比，對線蟲生長及其產(chǎn)卵量的抑制作用明顯增強(qiáng)，而DON+ZEN則出現(xiàn)毒性顯著性減弱的趨勢。AFB1+DON+ZEN則因暴露劑量的不同，僅在暴露24 h時(shí)對線蟲體長存在顯著性毒性增強(qiáng)作用，而在48 h時(shí)低、高濃度時(shí)，與AFB1單一暴露結(jié)果相似；對線蟲繁殖能力僅與DON和高濃度ZEN單一暴露時(shí)存在顯著性毒性增強(qiáng)。對此，為了能客觀定義混合物的聯(lián)合毒性類別，本實(shí)驗(yàn)采用Chou-Talalay模型及其相應(yīng)程序進(jìn)行評價(jià)(表3～5)。

圖1 AFB1、DON和ZEN單一及聯(lián)合暴露下對線蟲生長發(fā)育和生殖能力的毒性作用注：體長比率由暴露組線蟲產(chǎn)卵數(shù)與對照組線蟲產(chǎn)卵數(shù)比較而得。橫坐標(biāo)中，A、D、Z、AD、AZ、DZ、ADZ分別代表AFB1、DON、ZEN、AFB1+DON、AFB1+ZEN、DON+ZEN和AFB1+DON+ZEN；AFB1、DON和ZEN在低/中/高劑量組中濃度分別為2/10/20、80/400/800和10/50/100 mg·L-1。所有暴露組與其對應(yīng)的對照組相比，均有顯著性差異，鑒于作圖方便，未在圖中標(biāo)注，在此說明。** P < 0.01，*** P < 0.001(AFB1單獨(dú)暴露與其聯(lián)合暴露組相比)；# # P < 0.01，# # # P < 0.001(DON單獨(dú)暴露與其聯(lián)合暴露組相比)；Δ Δ P < 0.01，Δ Δ Δ P < 0.001(ZEN單獨(dú)暴露與其聯(lián)合暴露組相比)。Fig. 1 Toxic effects of AFB1, DON and ZEN alone and their binary or tertiary mixtures on development and reproduction of C. elegansNote: The body length rate is obtained by the body length in treated group compared to control group. A, D, Z, AD, AZ, DZ, ADZ are the abbreviations of AFB1, DON, ZEN, AFB1+DON, AFB1+ZEN, DON+ZEN and AFB1+DON+ZEN, respectively. The lower/intermediate/higher doses of AFB1, DON and ZEN are 2/10/20, 80/400/800 and 10/50/100 mg·L-1. All mycotoxin-exposed groups are significantly different from its corresponding control groups, which are not shown in the figure due to the convenience of making clear and concise figures. ** P < 0.01, *** P < 0.001 (group of AFB1alone compared with its corresponding combined group); # # P < 0.01, # # # P < 0.001 (group of DON alone compared with its corresponding combined group); Δ Δ P < 0.01, Δ Δ Δ P < 0.001 (group of ZEN alone compared with its corresponding combined group).

表2 黃曲霉毒素B1(AFB1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEN)單一暴露下線蟲生長發(fā)育和生殖能力的EC50及其置信區(qū)間(95%)Table 2 EC50 with 95% confidence interval (CI) of aflatoxin B1(AFB1), deoxynivalenol (DON) and zearalenone (ZEN) alone on development and reproduction of C. elegans

注：由于最高劑量的DON仍不能引起超過50%的抑制作用，a表示數(shù)字均由擬合曲線估算得出，故存在較大偏差。Note: Because the inhibitory effects forC.eleganstreated with the highest concentration of DON are still lower than 50%,athe numbers are obtained by the fitting curve, and hence there is a large deviation.

表3 AFB1、DON和ZEN對線蟲生長(24 h)的聯(lián)合毒性作用Table 3 Combined toxic effect of AFB1, DON and ZEN on the growth (24 h) of C. elegans

注：聯(lián)合毒性的分級參見前文。Dm和m值被用來計(jì)算CI值，其對應(yīng)毒素混合物相互作用類型可參見表1。Dm、m和r分別代表中效計(jì)量、動力學(xué)順序和擬合函數(shù)的回歸系數(shù)；EC25、EC50和EC75值是指對體長產(chǎn)生25%、50%和75%抑制作用時(shí)的劑量。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，混合物中AFB1-DON-ZEN的比率均為1:40:5。本評估模型采用基于Chou-Talalay方法的CalcuSyn軟件。Note: The degrees of combined toxicity were graded as previously reported.Dmandmvalues are used for calculating the CI value which can be referred to Table 1 for the corresponding types of interactions. Here,Dm,mandrstand for median-effect dose, kinetic order and regression coefficient of the fitting function, and EC25, EC50and EC75values are the doses required to inhibit body length by the rate of 25%, 50% and 75% of the whole system. The ratio of AFB1-DON-ZEN is 1:40:5 used for the experimental design. CalcuSyn software based on the Chou-Talalay method was used for this assessment.

表4 AFB1、DON和ZEN對線蟲生長(48 h)的聯(lián)合毒性作用Table 4 Combined toxic effect of AFB1, DON and ZEN on the growth (48 h) of C. elegans

注：聯(lián)合毒性的分級參見前文。Dm和m值被用來計(jì)算CI值，其對應(yīng)毒素混合物相互作用類型可參見表1。Dm、m和r分別代表中效計(jì)量、動力學(xué)順序和擬合函數(shù)的回歸系數(shù)；EC25、EC50和EC75值是指對體長產(chǎn)生25%、50%和75%抑制作用時(shí)的劑量。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，混合物中AFB1-DON-ZEN的比率均為1:40:5。本評估模型采用基于Chou-Talalay方法的CalcuSyn軟件。由于最高劑量的DON仍不能引起超過50%的抑制作用，a數(shù)字為擬合曲線估算得出，故存在較大偏差。Note: The degrees of combined toxicity were graded as previously reported.Dmandmvalues are used for calculating the CI value which can be referred to Table 1 for the corresponding types of interactions. Here,Dm,mandrstand for median-effect dose, kinetic order and regression coefficient of the fitting function, and EC25, EC50and EC75values are the doses required to inhibit body length by the rate of 25%, 50% and 75% of the whole system. The ratio of AFB1-DON-ZEN is 1:40:5 used for the experimental design. CalcuSyn software based on the Chou-Talalay method was used for this assessment. Because the inhibitory effects forC.eleganstreated with the highest concentration of DON are still lower than 50%,athe numbers are obtained by the fitting curve, and hence there is a large deviation.

從表3和表4可知，在低劑量(EC25)短時(shí)間(24 h)內(nèi)，混合物AFB1+DON對線蟲的生長發(fā)育表現(xiàn)出加和作用，隨著暴露濃度(EC50/EC75)的增加和/或暴露時(shí)間(48 h)的延長，AFB1+DON則對線蟲表現(xiàn)出協(xié)同作用。但在本實(shí)驗(yàn)中，混合物DON+ZEN對線蟲均表現(xiàn)出拮抗作用，且隨著暴露濃度和暴露時(shí)間的增加，拮抗作用增強(qiáng)。另外，混合物AFB1+ZEN在24 h時(shí)，對線蟲的聯(lián)合毒性類型在EC25、EC50和EC75時(shí)分別為弱拮抗作用、近似加和作用和弱協(xié)同作用，但在48 h時(shí)，則由一般協(xié)同作用(EC25)變?yōu)槿鯀f(xié)同作用(EC50、EC75)。最后，混合物AFB1+DON+ZEN對線蟲的生長發(fā)育除在EC50-24 h和EC75-24 h表現(xiàn)出毒性增強(qiáng)外，其他均為(極弱-弱-一般)拮抗作用。

表5列出了真菌毒素混合物對線蟲繁殖能力的聯(lián)合毒性類型。其中，混合物AFB1+DON在EC25暴露時(shí)表現(xiàn)為加和作用，隨著濃度的增加，則變?yōu)槿鯀f(xié)同作用?；旌衔顰FB1+ZEN則由弱拮抗作用(EC25)變?yōu)闃O弱協(xié)同作用(EC50)再到一般協(xié)同作用(EC75)。相反地，混合物DON+ZEN和混合物AFB1+DON+ZEN則對線蟲的繁殖能力分表變現(xiàn)強(qiáng)拮抗作用和一般拮抗作用。

3 討論(Discussion)

本實(shí)驗(yàn)旨在評價(jià)3種最為常見的真菌毒素(DON、AFB1和ZEN)共同存在時(shí)的聯(lián)合毒性及其毒作用類型。研究表明，單獨(dú)作用時(shí)，AFB1對線蟲的毒性作用最強(qiáng)，DON最弱。此外，采用Chou-Talalay模型分析毒素混合物對線蟲的毒性作用情況，得到混合物中毒素間的相互作用類型?；旌衔顰FB1+DON和混合物DON+ZEN較為一致地分別表現(xiàn)出加和/協(xié)同作用和拮抗作用。而混合物AFB1+ZEN和混合物AFB1+DON+ZEN則會因暴露濃度、暴露時(shí)間和檢測指標(biāo)的不同，表現(xiàn)出不同的聯(lián)合毒性類型。

由表2可知，AFB1分別在5.10(95%CI = 2.17～8.30)和2.32(1.57～4.09) mg·L-1時(shí)對線蟲的體長-48 h和產(chǎn)卵數(shù)造成50%的抑制作用?，F(xiàn)已有報(bào)道表明，在4 218份農(nóng)產(chǎn)品樣本中，AFB1的檢出最大值可高達(dá)1 563 μg·kg-1 [7]，這表明真菌毒素在環(huán)境中的高暴露風(fēng)險(xiǎn)對人體健康安全存在著潛在威脅，同時(shí)為評價(jià)聯(lián)合毒性強(qiáng)弱的劑量設(shè)定提供了理論依據(jù)，為加強(qiáng)開展聯(lián)合毒性風(fēng)險(xiǎn)暴露評估提出了現(xiàn)實(shí)要求。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，隨著暴露時(shí)間的增加，AFB1對線蟲的生長抑制作用增強(qiáng)，而DON呈減弱趨勢，ZEN則維持不變。這一現(xiàn)象可能與不同毒素在線蟲體內(nèi)的毒性動力學(xué)和生物轉(zhuǎn)化關(guān)系密切。因此，暴露時(shí)間可作為另一顯著影響因素，同暴露劑量一起影響目標(biāo)毒素對線蟲的毒性作用，即具有劑量-時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。

聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，混合物AFB1+DON對線蟲表現(xiàn)出毒性增強(qiáng)，即協(xié)同作用和加和作用(僅在EC25時(shí)對24 h-體長和產(chǎn)卵數(shù))。該結(jié)果與已有報(bào)道(細(xì)胞模型、斑馬魚和小鼠模型)基本一致[16-17,35-36]。

表5 AFB1、DON和ZEN對線蟲產(chǎn)卵數(shù)的聯(lián)合毒性作用Table 5 Combined toxic effect of AFB1, DON and ZEN on the brood size of C. elegans

注：聯(lián)合毒性的分級參見前文。Dm和m值被用來計(jì)算CI值，其對應(yīng)毒素混合物相互作用類型可參見表1。Dm、m和r分別代表中效計(jì)量、動力學(xué)順序和擬合函數(shù)的回歸系數(shù)；EC25、EC50和EC75值是指對產(chǎn)卵數(shù)產(chǎn)生25%、50%和75%抑制作用時(shí)的劑量。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，混合物中AFB1-DON-ZEN的比率均為1:40:5。本評估模型采用基于Chou-Talalay方法的CalcuSyn軟件。Note: The degrees of combined toxicity were graded as previously reported.Dmandmvalues are used for calculating the CI value which can be referred to Table 1 for the corresponding types of interactions. Here,Dm,mandrstand for median-effect dose, kinetic order and regression coefficient of the fitting function, and EC25, EC50and EC75values are the doses required to inhibit brood size by the rate of 25%, 50% and 75% of the whole system. The ratio of AFB1-DON-ZEN is 1:40:5 used for the experimental design. CalcuSyn software based on the Chou-Talalay method was used for this assessment.

這可能是由于AFB1的代謝產(chǎn)物與DNA結(jié)合，引起p53基因改變，對蛋白合成造成影響[37-38]。同時(shí)，DON作為RNA、DNA和蛋白合成的潛在抑制因子，可進(jìn)入細(xì)胞與核糖體60S亞基結(jié)合，干擾肽基轉(zhuǎn)移酶的活性，也抑制蛋白質(zhì)的合成[39]。因此，DON和AFB1共同存在時(shí)，增加了各自原有的毒性，使聯(lián)合毒性明顯增強(qiáng)。由此表明，毒素混合物可通過共同和/或不同的通路進(jìn)行相互作用，從而改變毒性強(qiáng)弱。然而，混合物AFB1+ZEN則因暴露濃度和時(shí)間的不同，表現(xiàn)出不同的聯(lián)合毒性類型。例如，AFB1+ZEN在EC25時(shí)，對體長(24 h)和產(chǎn)卵量均產(chǎn)生拮抗作用，而隨著暴露劑量的增加(EC50和EC75)，則產(chǎn)生加和作用或協(xié)同作用。而在48 h時(shí)，則均產(chǎn)生協(xié)同作用。這可能源于共存的毒素改變了原有毒代動力學(xué)和/或生物轉(zhuǎn)化。Gillesby和Zacharewski[40]曾報(bào)道，ZEN可通過與之相結(jié)合的受體與AFB1功能團(tuán)上的呋喃相互作用，暗示ZEN可阻礙AFB1與其靶位點(diǎn)結(jié)合，從而使毒性減弱。相反，混合物DON+ZEN則變現(xiàn)為拮抗作用，這一結(jié)果與成年豬模型結(jié)果相反[41]，但與斑馬魚模型中結(jié)論一致[17]。此外，混合物AFB1+DON+ZEN對線蟲的生長發(fā)育在24 h暴露時(shí)，由弱拮抗作用(EC25)變?yōu)榧雍妥饔?EC50)再變?yōu)橐话慵雍妥饔?EC75)，而在48 h暴露時(shí)，則由極弱拮抗作用逐步變?yōu)橐话戕卓钩勺饔?；對線蟲的繁殖能力則毒性強(qiáng)弱較為穩(wěn)定。這一現(xiàn)象可推測是因受到3種毒素在不同濃度和時(shí)間的共同作用和綜合影響，以及檢測指標(biāo)的不同，導(dǎo)致其聯(lián)合作用類型較為復(fù)雜。因此，對多種毒素間的相互作用及機(jī)理仍有待進(jìn)一步深入研究，這不僅有助于豐富毒素領(lǐng)域的研究廣度和深度，更對今后相關(guān)政策的制定以及有關(guān)公共衛(wèi)生的決策具有科學(xué)的指導(dǎo)作用。