魏曉勇，葉子明，周瑜，秦超

(1武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430060；2廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤(IA)破裂所導(dǎo)致的蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)是一種極為兇險(xiǎn)的腦血管疾病，是腦卒中主要亞型之一[1]。研究[2]表明，人群中有2%～5%患有無(wú)癥狀性IA，其中約1/4的IA患者會(huì)發(fā)生SAH。約50%動(dòng)脈瘤相關(guān)蛛網(wǎng)膜下腔出血(aSAH)患者死亡，另有25%遺留嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙[3]。目前認(rèn)為種族、性別、遺傳及一些獲得性因素是IA形成和發(fā)展的危險(xiǎn)因素。Alg等[4]發(fā)現(xiàn)，rs6841581是與IA相關(guān)性最穩(wěn)定的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)之一。rs6841581位于常染色體4q31.23，在血管內(nèi)皮素受體A(EDNRA)基因轉(zhuǎn)錄子(NM001957.3)5′端調(diào)節(jié)功能區(qū)域內(nèi)。由于疾病易感基因在不同地域和種群間可能具有遺傳差異，故仍需要對(duì)在不同種群中進(jìn)行相關(guān)研究。目前，尚未見(jiàn)有EDNRA基因及其相關(guān)SNP位點(diǎn)與廣西壯族IA相關(guān)性研究報(bào)道。本研究采用PCR-RFLP方法檢測(cè)87例廣西壯族囊狀I(lǐng)A患者和111例健康查體對(duì)照者的EDNRA基因rs6841581位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布，并對(duì)其進(jìn)行比較。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年11月～2015年10月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的囊狀I(lǐng)A患者87例(觀察組)，男31例，女56例；年齡(58.76±12.28)歲。均經(jīng)全腦血管數(shù)字減影造影(DSA)檢查確診。單發(fā)IA患者70例，多發(fā)IA患者(IA數(shù)量≥2個(gè))17例；共計(jì)107個(gè)囊狀I(lǐng)A，其中位于頸內(nèi)動(dòng)脈48個(gè)、后交通動(dòng)脈25個(gè)、大腦中動(dòng)脈13個(gè)、大腦前動(dòng)脈5個(gè)、前交通動(dòng)脈12個(gè)、基底動(dòng)脈4個(gè)。另選111例健康體檢者作對(duì)照(對(duì)照組)，男45例，女66例；年齡(61.58±8.46)歲。均同期MRA排除IA。所有入選對(duì)象均來(lái)自廣西壯族，同時(shí)排除顱內(nèi)梭形動(dòng)脈瘤、夾層動(dòng)脈瘤、腦動(dòng)靜脈畸形。此研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有調(diào)查及抽血均獲患者及家屬同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 EDNRA基因rs6841581位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè) ①DNA提?。撼槿∷醒芯繉?duì)象外周靜脈血5 mL，使用磁珠法手工核酸提取試劑盒(Xiamen Zeesan Biotech Co.Ltd)提取外周血有核細(xì)胞DNA。②PCR擴(kuò)增：1.引物設(shè)計(jì)：根據(jù)NCBI提供的DNA序列，由上海生物工程公司設(shè)計(jì)合成PCR引物。PCR特異性擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為408 bp。2.PCR反應(yīng)體系組成：Template 1 μL(第一輪為基因組DNA，第二輪為首輪PCR產(chǎn)物)，2×Es Taq MasterMix 10 μL，Primer F 0.5 μL，Primer R 0.5 μL，ddH2O 8 μL混勻，3 000 r/min瞬時(shí)離心后PCR儀擴(kuò)增。3.巢式PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃、5 min，隨后進(jìn)行第一輪循環(huán)20個(gè)周期，第二輪循環(huán)35個(gè)周期的變性94 ℃、30 s，復(fù)性60 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，再延伸72 ℃、10 min。4.PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)：使用1%瓊脂糖凝膠(Agarose LE)置于0.5×TBE電泳液在100 V恒壓下水平電泳30 min，檢測(cè)是否有特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物。③RFLP分析：取PCR產(chǎn)物0.5 μL，10×Buffer R 1 μL，Eco72Ⅰ內(nèi)切酶(10 U/μL)0.5 μL，ddH2O 8 μL，混勻，3 000 r/min瞬時(shí)離心，37 ℃、15 min，80 ℃、10 min酶切。取5 μL酶切產(chǎn)物加入2%瓊脂糖凝膠加樣孔中，置于0.5×TBE電泳液并在120 V恒壓下水平電泳30 min后取出，放置在紫外光凝膠成像系統(tǒng)下觀察帶型。④DNA測(cè)序檢驗(yàn)：從受試對(duì)象中隨機(jī)抽取AA、AG、GG三種基因型各15例PCR產(chǎn)物樣本，使用Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序檢驗(yàn)(3730XL測(cè)序儀)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用Pearson′sχ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率法檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR-RFLP反應(yīng)產(chǎn)物電泳及基因型判定 PCR產(chǎn)物在紫外光凝膠成像系統(tǒng)下顯示為408 bp的單一條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)Eco72Ⅰ限制性內(nèi)切酶消化后，電泳檢測(cè)結(jié)果為rs6841581純合子型(G/G)顯示為252、156 bp兩根條帶。純合子型(A/A)顯示為408 bp一根條帶。雜合子型(A/G)顯示為408、252、156 bp三根條帶。隨機(jī)選取三型PCR產(chǎn)物各10份行Sanger雙脫氧鏈終止法DNA測(cè)序，結(jié)果與PCR-RFLP基因型判定一致。雜合子(A/G)基因型在該SNP位點(diǎn)顯示為A/G雙峰。

2.2 兩組基因型和等位基因頻率分布 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩組基因型和等位基因頻率分布(例)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3 兩組不同性別入選對(duì)象基因型和等位基因頻率分布 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 兩組不同性別入選對(duì)象基因型和等位基因頻率分布(例)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.4 觀察組IA單發(fā)、多發(fā)者基因型和等位基因頻率分布 結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，單發(fā)IA和多發(fā)IA EDNRA基因rs6841581位點(diǎn)的基因型、等位基因頻率分布比較無(wú)顯著性差異。

表3 觀察組IA單發(fā)、多發(fā)者基因型和等位基因頻率分布(例)

3 討論

Vernooij等[5]認(rèn)為，IA具有明顯的家族聚集性，超過(guò)20%IA患者具有家族史。Brown等[6]使用MRA篩查報(bào)告家族性IA患者一、二級(jí)親屬中IA患病風(fēng)險(xiǎn)為8.7%～13.0%，遠(yuǎn)高于普通人群患病率。許多遺傳性結(jié)締組織病，包括常染色體顯性遺傳多囊腎疾病、Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病、馬凡綜合征等也與IA形成有關(guān)[7]。根據(jù)IA家族聚集性特點(diǎn)及其與遺傳性結(jié)締組織病的聯(lián)系，可推斷遺傳因素在IA發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能扮演重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組EDNRA基因rs6841581位點(diǎn)三種基因型(AA/AG/GG)頻率及等位基因(A/G)頻率分布與對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在隱性遺傳模式下純合子GG基因型在觀察組中的頻率顯著高于對(duì)照組，提示EDNRA基因rs6841581位點(diǎn)可能與廣西壯族人群IA相關(guān)，純合子GG基因型可能是易感基因型。

以往文獻(xiàn)報(bào)道，不同地區(qū)、種群間aSAH發(fā)病率存在顯著差異。研究[8]認(rèn)為，中國(guó)北京漢族人群發(fā)病率較低(2.0/10萬(wàn))。文獻(xiàn)[9]報(bào)道，芬蘭和日本是aSAH高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率分別為19.7/10萬(wàn)和22.7/10萬(wàn)。荷蘭、芬蘭和日本人群GWAS研究均證實(shí)EDNRA基因rs6841581位點(diǎn)與IA相關(guān)，且等位基因G為易感基因[10]。EDNRA基因與中國(guó)漢族人群散發(fā)IA相關(guān)性研究也表明，rs6841581等位基G攜帶者患IA風(fēng)險(xiǎn)較等位基因A高，純合子GG攜帶者患病風(fēng)險(xiǎn)是純合子AA的2.85倍[11]。IA的組織學(xué)特點(diǎn)主要為動(dòng)脈血管壁的局部完整性受損，包括血管內(nèi)皮功能異常、內(nèi)膜增生、細(xì)胞成分的消亡及細(xì)胞外基質(zhì)的紊亂等[12]。血管內(nèi)皮素是血管壁損傷后組織重塑過(guò)程中的強(qiáng)烈收縮劑。EDNRA是一種主要存在于血管平滑肌細(xì)胞，包括腦血管、心臟、腎臟及神經(jīng)元等在內(nèi)的G蛋白偶聯(lián)受體，具有調(diào)節(jié)內(nèi)皮素主要的同工型-EDN1的血管收縮及有絲分裂的作用。EDNRA通過(guò)加快細(xì)胞周期進(jìn)程和增殖來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)皮素1的有絲分裂效應(yīng)。血管內(nèi)皮素信號(hào)在血管壁受損的地方被迅速激活可能有利于促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)損傷?；蚬δ苎芯勘砻?，EDNRA基因rs6841581位點(diǎn)的等位基因G可使EDNRA基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)[13]。EDNRA轉(zhuǎn)錄下調(diào)可抑制EDN信號(hào)，干擾血管損傷的修復(fù)過(guò)程，限制血管祖細(xì)胞的活動(dòng)而導(dǎo)致修復(fù)缺陷，進(jìn)而可能促使IA形成和發(fā)展[10]。

本研究顯示，觀察組女性基因型、等位基因頻率分布和對(duì)照組比較無(wú)顯著差異。觀察組男性等位基因G頻率顯著高于男性對(duì)照組，提示SNPrs6841581等位基因G與廣西壯族人群男性IA患者相關(guān)。Nguyen等[14]流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，女性IA患病率高于男性，認(rèn)為女性是IA的主要危險(xiǎn)因素之一。女性患者動(dòng)脈瘤擴(kuò)大的風(fēng)險(xiǎn)是男性的1.26倍[15]。在不同年齡段中，女性aSAH患者發(fā)病率均高于男性，女性占IA相關(guān)SAH患者的比重也隨年齡增高而增大，女性易感IA的原因可能與內(nèi)分泌等因素有關(guān)，性激素受體在血管內(nèi)廣泛存在，除直接作用外還可能通過(guò)對(duì)脂肪代謝和凝血功能的影響產(chǎn)生作用。女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平下降， 可使組織內(nèi)膠原蛋白含量降低， 從而導(dǎo)致血管壁強(qiáng)度降低，在血流作用下促使局部血管壁擴(kuò)張而形成IA。由于女性額外具有的IA風(fēng)險(xiǎn)，使得 SNPrs6841581等位基因G作用對(duì)女性IA形成和發(fā)展的影響比重降低。這也可能是導(dǎo)致本研究中女性IA患者多于男性，而女性與SNPrs6841581相關(guān)關(guān)系卻呈陰性結(jié)果的原因。

本研究觀察組中多發(fā)IA患者17例，占IA患者總?cè)藬?shù) 19.5%，低于文獻(xiàn)[16]報(bào)道的27.9%。多發(fā)IA常分布在兩側(cè)腦動(dòng)脈，特別是在兩側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈及大腦中動(dòng)脈上。多發(fā)IA的年破裂率為 6.8%，而單發(fā)IA的年破裂率僅為1．9%。學(xué)者認(rèn)為多發(fā)性顱內(nèi)動(dòng)脈動(dòng)脈瘤在青少年IA患者中更為常見(jiàn)，相對(duì)于單發(fā)IA，多發(fā)IA可能與家族性IA及先天血管發(fā)育不良性IA更為相關(guān)[17]。兩種不同IA亞型特征提示它們的形成和發(fā)展機(jī)制以及易感基因位點(diǎn)多態(tài)性可能存在差異。本研究對(duì)單發(fā)IA患者和多發(fā)IA患者兩個(gè)亞組的EDNRA基因rs6841581位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布進(jìn)行了相互比較，未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)基因型和等位基因頻率在兩個(gè)IA患者亞組間有顯著性差異。造成這種結(jié)果的原因，可能由于IA是一種復(fù)雜基因遺傳病，EDNRA基因rs6841581位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布對(duì)廣西壯族IA人群的單、多發(fā)IA分型影響較小，也可能是由于總體樣本量偏少且分組后兩個(gè)IA亞組的人數(shù)較為懸殊，造成了統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差。EDNRA基因rs6841581位點(diǎn)多態(tài)性與單發(fā)IA和多發(fā)IA亞組分型的關(guān)系還需進(jìn)一步研究。

總之，廣西壯族人群IA患者存在EDNRA基因rs6841581位點(diǎn)多態(tài)性，GG基因型可能是IA的易感基因型。