孫妍，董學(xué)旺，魏俊利，薛淑霞

?

蝦肝腸胞蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）的建立

孫妍，董學(xué)旺，魏俊利，薛淑霞通信作者

（天津市水生動物疫病預(yù)防控制中心，天津 300221）

為建立一種快速檢測蝦肝腸胞蟲（EHP）的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP），根據(jù)GenBank中登錄的EHP-SSU基因序列設(shè)計(jì)6條特異性引物，成功建立了EHP-LAMP檢測方法。該方法檢出限為3.71個質(zhì)?？截?μL，并且與蝦其他常見病毒病的病原（WSSV、IHHNV、CMNV）均無交叉反應(yīng)。采用LAMP方法和常規(guī)PCR方法對30份具有典型EHP感染癥狀的對蝦樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：LAMP和PCR方法的陽性檢出率均為100%。結(jié)果表明，建立的EHP-LAMP方法具有高靈敏度、高特異性、高準(zhǔn)確度的優(yōu)點(diǎn)，為對蝦肝腸胞蟲的快速早期診斷奠定基礎(chǔ)。

對蝦；肝腸胞蟲；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；檢測

蝦肝腸胞蟲（, EHP）又稱腸胞蟲，屬于微孢子蟲，于2009年在泰國養(yǎng)殖的生長緩慢的斑節(jié)對蝦（）中首次被分離和命名[1]，主要感染南美白對蝦（）、中國對蝦（）、斑節(jié)對蝦（）等重要養(yǎng)殖對蝦，是近幾年新發(fā)現(xiàn)的寄生于對蝦肝胰腺組織的新病原。早期感染EHP的對蝦一般不會立即出現(xiàn)死亡，也沒有明顯的癥狀，仍然可以正常攝食，且體色正常，使得該病很難在養(yǎng)殖前期發(fā)現(xiàn)，通常養(yǎng)殖30～45 d后才會出現(xiàn)生長緩慢或生長停滯的癥狀[2-3]，且EHP的感染會導(dǎo)致對蝦消瘦，大小和重量不均[4]，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。因此，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中也將患病蝦稱作“老頭蝦”。自2013年以來，我國廣東、浙江、江蘇、遼寧、天津等地區(qū)的南美白對蝦苗種和養(yǎng)殖蝦的EHP陽性檢出率逐年升高，幾乎成為這些地區(qū)的主要流行病原[5-7]，嚴(yán)重影響了我國對蝦進(jìn)出口貿(mào)易和對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，建立快速、有效、準(zhǔn)確的檢測方法對及時發(fā)現(xiàn)EHP攜帶和感染對蝦、減少病原傳播擴(kuò)散有積極意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是Notomi等[8]創(chuàng)建的另一種形式的核酸擴(kuò)增技術(shù)，針對靶基因的6個不同區(qū)域，同時使用3對引物對靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能完成擴(kuò)增反應(yīng)。因此，LAMP的特異性和敏感性均比PCR 高。LAMP僅要求一臺可調(diào)的恒溫水浴鍋等類似的簡單儀器，不苛求昂貴的儀器設(shè)備，能在60 min內(nèi)完成反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物無需電泳分析，直接肉眼觀察，操作簡單，非專業(yè)技術(shù)人員同樣可以完成檢測，更適合于基層或現(xiàn)場快速診斷。目前，該技術(shù)已應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)各個領(lǐng)域，對蝦白斑綜合癥病毒和傳染性皮下及造血組織壞死病毒的LAMP快速檢測方法也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)[9-10]。本研究擬建立EHP-LAMP可視化快速檢測方法，為EHP的苗種檢疫、生產(chǎn)監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查分析提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要的試驗(yàn)材料和儀器設(shè)備

采自天津市東麗區(qū)某養(yǎng)殖場的南美白對蝦樣品，具有典型的EHP感染癥狀，經(jīng)PCR檢測[11]并測序后確認(rèn)為EHP感染，由本實(shí)驗(yàn)室保存；經(jīng)檢測未感染EHP的對蝦基因組、僅感染對蝦白斑病毒（WSSV）的對蝦基因組、僅感染對蝦皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）的對蝦基因組、僅感染偷死野田村病毒（CMNV）的對蝦RNA均由本單位病原檢測室提供；海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生物；10 mmol/L dNTP、質(zhì)粒提取試劑盒均購自大連寶生物（TakaRa）；Bst DNA聚合酶（NEB）、鈣黃綠素染料（北京藍(lán)譜）、甜菜堿（Sigma）。PCR儀（ABI）、凝膠成像系統(tǒng)（Biometra）、金屬浴（天根生物）、離心機(jī)（Sigma）、電泳儀（北京六一）。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank發(fā)布的EHP基因序列及相關(guān)文獻(xiàn)資料，選取EHP-SSU（登錄號：FJ496356.1）為靶基因，按照LAMP引物設(shè)計(jì)原則，使用在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer version 5（http:// primerexplorer.jp/e）設(shè)計(jì)6條引物（表1），分別為外引物F3/B3，內(nèi)引物FIP/BIP和環(huán)引物L(fēng)F/LB，引物由上海生工合成。

表1 EHP-LAMP引物序列表

1.2.2 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

按照海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取感染EHP對蝦的基因組DNA，作為LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的模板。EHP-LAMP的基礎(chǔ)反應(yīng)體系（25 μL）：2.5 μL 10×DNA聚合酶buffer，3.5 μL 10 mmol/L dNTP，1.5 μL 100 mmol/L MgSO4，0.4 μL 100 μmol/L FIP，0.4 μL 100 μmol/L BIP，0.2 μL 100 μmol/L LF，0.2 μL 100 μmol/L LB，0.05 μL 100 μmol/L F3，0.05 μL 100 μmol/L B3，8 UnitsDNA聚合酶，1 μL鈣黃綠素染料，3 μL 5 mol/L甜菜堿，滅菌水適量，2 μL模板。基礎(chǔ)反應(yīng)條件：63 ℃ 60 min，80 ℃ 10 min。為了能得到最佳擴(kuò)增效果，在基礎(chǔ)反應(yīng)體系上對其可能影響較大的試劑，如甜菜堿、dNTP、MgSO4、DNA聚合酶等的用量及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系的靈敏度試驗(yàn)

將用于EHP-LAMP引物設(shè)計(jì)的SSU基因序列與pUC57載體連接，構(gòu)建SSU-pUC57質(zhì)粒，質(zhì)粒構(gòu)建工作由上海生工完成。利用質(zhì)粒提取試劑盒提取SSU-pUC57質(zhì)粒，利用核酸檢測儀測定所提取質(zhì)粒的初始濃度，根據(jù)公式：質(zhì)?？截悢?shù)/μL＝質(zhì)粒濃度（g/μL）/質(zhì)粒分子量×阿佛加德羅常數(shù)，計(jì)算出SSU-pUC57質(zhì)?？截悢?shù)為3.71×109，用滅菌水按10倍遞進(jìn)稀釋法將質(zhì)粒稀釋至3.71個質(zhì)粒拷貝/μL，取2 μL各濃度稀釋液分別進(jìn)行LAMP和PCR擴(kuò)增（以F3/B3為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物大小為191 bp），比較兩種方法的最低檢測量。

1.2.4 LAMP反應(yīng)體系的特異性試驗(yàn)

將本單位病原檢測室提供的僅感染W(wǎng)SSV的對蝦基因組、僅感染IHHNV的對蝦基因組、僅感染CMNV的對蝦RNA（反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板）以及感染EHP的對蝦基因組，及同時設(shè)陰性對照和陽性對照（SSU-pUC57質(zhì)粒），按照上述建立的LAMP方法進(jìn)行EHP-LAMP檢測體系的特異性分析。

1.2.5 臨床樣品的檢測

同時利用本研究建立的EHP-LAMP檢測技術(shù)和PCR方法，分別對挑選出的30尾具有典型感染EHP癥狀的對蝦進(jìn)行檢測，并將這兩種方法得到的結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 EHP-LAMP的優(yōu)化結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果綜合分析發(fā)現(xiàn)，甜菜堿、MgSO4和dNTP的加入量對EHP-LAMP反應(yīng)體系的擴(kuò)增效率影響較大。最終確定EHP-LAMP的最佳反應(yīng)體系為：2.5 μL 10×Bst DNA聚合酶buffer，2.5 μL 10 mmol/L dNTP，2 μL 100 mmol/L MgSO4，0.4 μL 100 μmol/L FIP，0.4 μL 100 μmol/L BIP，0.2 μL 100 μmol/L LF，0.2 μL 100 μmol/L LB，0.05 μL 100 μmol/L F3，0.05 μL 100 μmol/L B3，8 Units Bst DNA聚合酶，1 μL鈣黃綠素染料，1 μL 5 mol/L甜菜堿，2 μL模板滅菌水定容總體積至25 μL。反應(yīng)條件為：63 ℃ 40 min，80 ℃ 5 min。在此條件下，LAMP擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測及肉眼觀察反應(yīng)液顏色變化結(jié)果見圖1。

圖1 EHP-LAMP檢測結(jié)果

注：圖A為EHP-LAMP電泳檢測圖，其中，M為DNA marker，1為EHP陽性結(jié)果，2為EHP陰性結(jié)果；圖B為EHP-LAMP肉眼觀察結(jié)果，其中，1為EHP陽性結(jié)果，2為EHP陰性結(jié)果

2.2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

利用優(yōu)化條件后的EHP-LAMP和PCR檢測方法對不同稀釋倍數(shù)的模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示：LAMP檢測方法的檢出限為3.71個質(zhì)?？截?μL，PCR檢測方法的檢出限為371個質(zhì)?？截?μL，LAMP檢測方法的靈敏度高于PCR（圖2）。

圖2 EHP-LAMP靈敏度檢測結(jié)果

注：1為3.71×109；2為3.71×108；3為3.71×107；4為3.71×106；5為3.71×105；6為3.71×104；7為3.71×103；8為3.71×102；9為3.71×101；10為3.71；11為陰性對照

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

利用優(yōu)化條件后的EHP-LAMP反應(yīng)體系對含有WSSV、IHHNV、CMNV和EHP的對蝦基因組及SSU-pUC57質(zhì)粒進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：只有含有EHP對蝦基因組和SSU-pUC57質(zhì)粒出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，而含有WSSV、IHHNV和CMNV的對蝦基因組以及陰性對照檢測結(jié)果為陰性（圖3），表明建立的EHP-LAMP方法與對蝦其他常見病毒病的病原均無交叉反應(yīng)，特異性良好。

圖3 EHP-LAMP反應(yīng)體系特異性檢測結(jié)果

注：1為SSU-pUC57質(zhì)粒；2為含有EHP的對蝦基因組；3為含有WSSV的對蝦基因組；4為含有IHHNV的對蝦基因組；5為含有CMNV的對蝦cDNA；6為陰性對照

2.4 臨床樣品檢測結(jié)果

利用優(yōu)化條件后的EHP-LAMP和PCR方法分別對30份具有典型EHP感染癥狀的對蝦樣品進(jìn)行檢測，同時設(shè)立陽性和陰性對照。結(jié)果顯示：EHP-LAMP和PCR方法的陽性檢出率均為100%，其中5份樣品PCR檢測條帶較弱，為弱陽性。LAMP和PCR檢測結(jié)果見表2。

表2 LAMP和PCR檢測對蝦病樣的結(jié)果比較

3 討論

EHP屬于微孢子蟲，其個體小于細(xì)胞，很難通過顯微鏡觀察到，重癥感染的對蝦肝胰腺在常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色下也很難觀察到特征性病理變化[1]，而通過原位雜交則能顯示對蝦感染EHP后其肝胰腺小管上皮細(xì)胞中存在明顯雜交信號[12]，因此分子檢測是微孢子蟲的有效檢測手段。目前，相關(guān)EHP檢測方法主要包括實(shí)時熒光定量PCR法[13]、普通PCR法[14]、巢式PCR法[11]等，而這些檢測手段需要專業(yè)的技術(shù)操作人員在專業(yè)的分子實(shí)驗(yàn)室中才能完成。我國2013—2015年的養(yǎng)殖對蝦EHP攜帶情況調(diào)查數(shù)據(jù)顯示：EHP具有較高的陽性檢出率[15]，已經(jīng)成為導(dǎo)致對蝦生長緩慢的主要病原。EHP主要侵染蝦苗和幼蝦，且在感染早期沒有明顯癥狀，在購買苗種的時候很難引起人們的注意，嚴(yán)重影響了蝦農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收益。因此，建立一種快速、簡便、適用于實(shí)際生產(chǎn)的EHP檢測方法十分必要。本文根據(jù)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）原理，基于SSU基因設(shè)計(jì)6個引物，建立了快速檢測EHP的LAMP方法。該方法僅35～40 min即可達(dá)到反應(yīng)的平臺期；對反應(yīng)裝置要求較低，恒溫水浴鍋、金屬浴或PCR儀均能作為LAMP的恒溫反應(yīng)裝置，非常適用于生產(chǎn)一線使用；結(jié)果觀察簡單，反應(yīng)完畢用肉眼觀察反應(yīng)液的顏色變化即可判斷結(jié)果；特異性良好，與對蝦常見病毒均無交叉反應(yīng)；靈敏度是普通PCR方法的100倍。通過30份樣品的檢測結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，LAMP法與PCR法的檢測結(jié)果符合率為100%，PCR法檢測結(jié)果為弱陽性的樣品，LAMP法的檢測結(jié)果仍然為陽性，與其他陽性樣品的顯色并無差異，證明LAMP法的準(zhǔn)確率高且比PCR法更加靈敏。

EHP具有垂直傳播和水平傳播兩種感染方式，且與其他疾病的重要區(qū)別是EHP可通過同類間的殘食實(shí)現(xiàn)水平傳播[16]，這使得控制養(yǎng)殖池中的疾病擴(kuò)散變得尤為困難，截止目前，還沒有治療該疾病的藥物。因此養(yǎng)殖過程中需要認(rèn)真關(guān)注重要的易感染環(huán)節(jié)，從苗種檢測、飼料檢測、餌料控制、水體等方面控制EHP的傳播和發(fā)病。上述建立的EHP-LAMP法滿足了對蝦養(yǎng)殖中對EHP快速檢測的需要，為EHP的早期診斷及防控技術(shù)研究和效果評估等方面提供了技術(shù)支撐。

[1] Tourtip S，Wongtripop S，Stentiford G D，et al.sp. nov.（Microsporida: Enterocytozoonidae），a parasite of the black tiger shrimp（Decapoda: Penaeidae）：Fine structure and phylogenetic relationships[J]. J Invert Pathol，2009，102（1）：21-29.

[2] 駱云慧，石堅(jiān)，方磊，等. 蝦肝腸胞蟲TaqMan實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2016，46（7）：847-852.

[3] 施慧，許文軍，謝建軍，等. 舟山地區(qū)大棚凡納濱對蝦生長緩慢病因的調(diào)查分析[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2017，24（2）：387-394.

[4] 劉雅梅，邱亮，程東遠(yuǎn)，等. 檢出蝦肝腸胞蟲（）的凡納濱對蝦（）群體的體長和體重關(guān)系[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2017，38（4）：96-103.

[5] 劉珍，張慶利，萬曉嬡，等. 蝦肝腸胞蟲（）實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的建立及對蝦樣品的檢測[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2016，37（2）：119-126.

[6] 王博雅，王力，劉美如，等. 凡納濱對蝦3種主要病毒和蝦肝腸胞蟲在遼寧地區(qū)的流行情況分析[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，32（2）：150-154.

[7] 陳祿芝，余霞艷，胡一丞，等. 粵西地區(qū)凡納濱對蝦蝦肝腸胞蟲、傳染性皮下和造血組織壞死病毒感染情況的初步調(diào)查[J]. 漁業(yè)研究，2016，38（4）：273-280.

[8] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Research，2000，28（12）：e63.

[9] 龐耀珊，謝芝勛，謝麗基，等. 對蝦白斑綜合癥病毒可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測技術(shù)的建立與應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，21（8）：1002-1008.

[10] 李紅梅，江曉，任春華，等. 對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒實(shí)時熒光LAMP檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)，2016，7（3）：307-313.

[11] Jaroenlak P，Sanguanrut P，Williams B A，et al. A nested PCR assay to avoid false positive detection of the microsporidian（EHP）in environmental samples in shrimp farms[J]. Plos One，2016，11（11）：e0166320.

[12] Tanga K F，Pantoja C R，Redman R M，et al. Development of in situ hybridization and PCR assays for the detection of（EHP），a microsporidian parasite infecting penaeid shrimp[J]. J Invertebr Pathol，2015，130：37-41.

[13] 張娜，謝艷輝，陳進(jìn)會，等. 蝦肝腸胞蟲Taqman熒光PCR方法的建立與應(yīng)用[J]. 中國動物檢疫，2017，34（10）：98-103.

[14] Rajendrana K V，Shivam S，Praveena P Eet al. Emergence of（EHP）in farmed（）in India[J]. Aquaculture，2016，454：272-280.

[15] 劉寶彬，楊冰，呂秀旺，等. 凡納濱對蝦（）傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）及蝦肝腸胞蟲（EHP）的熒光定量PCR檢測[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2017，3（2）：158-166.

[16] Tangprasittipap A，Jiraporn S，Chouwdee S，et al. The microsporidianis not the cause of white feces syndrome in whiteleg shrimp（）[J]. BMC Veterinary Research，2013，9（1）：139.

責(zé)任編輯：張愛婷

Establishment of a LAMP assay for detection of

SUN Yan, DONG Xue-wang, WEI Jun-li, XUE Shu-xiaCorresponding Author

（Tianjin Diseases Prevention and Control Center of Aquatic Animals, Tianjin 300221, China）

In order to develop a rapid method for detecting the(EHP), a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay was established for targetinggene with six specific primers following the optimization of the reaction. The results showed that the lowest limit detection of EHP-LAMP assay was 3.71 copies/μL, then its specificity was verified, and no cross-reactions was found for other shrimp pathogenic viruses including WSSV, IHHNV and CMNV. Moreover, 30 samples of shrimp with typical EHP infection symptoms were detected with the LAMP and PCR method, respectively. The results showed that the positive rates of LAMP and PCR were both 100%. In conclusion, the EHP-LAMP method is suitable for EHP early diagnosis with the advantages of high sensitivity, specificity and accuracy.

shrimp;(EHP); loop-mediated isothermal amplification (LAMP); detection

Q786；S917.4

A

2018-01-31

天津市農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項(xiàng)目（201502070）

孫妍（1985-），女，工程師，碩士，主要從事水產(chǎn)動物病害學(xué)方面研究。E-mail：sunyan19850409@aliyun.com。

薛淑霞（1979-），女，副研究員，博士，主要從事水產(chǎn)動物分子免疫學(xué)研究。E-mail：xueshuxia_79@126.com。

1008-5394（2018）02-0051-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.02.013