毛晴，陳豐，梁建，劉軍鋒，呂愛軍，胡秀彩，郭永軍，邢克智，孫敬鋒

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菲律賓蛤仔中一株枯草芽胞桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特征研究

毛晴1，陳豐1，梁建1，劉軍鋒2，呂愛軍1，胡秀彩1，郭永軍1，邢克智1，孫敬鋒1，通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2. 天津市漁生堂生物技術(shù)有限公司，天津 300404）

從健康菲律賓蛤仔（）肝胰臟中分離純化出一株細菌，命名為G6，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性、16S rDNA序列測定、系統(tǒng)發(fā)育分析等方法鑒定為枯草芽孢桿菌（）。然后對其生長曲線、耐高溫、耐酸性、耐膽鹽等生物學(xué)特征進行研究。結(jié)果表明，G6菌株生長期較長，在26～34 h進入穩(wěn)定期，具有較強的耐高溫、耐酸性、耐膽鹽等特性。本研究為枯草芽孢桿菌G6菌株作為水產(chǎn)動物益生菌菌株的開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

菲律賓蛤仔；枯草芽孢桿菌；分離；鑒定；生長特性；耐受性

近年來，隨著人們對食品安全和生態(tài)環(huán)境的高度重視，尋求無毒副作用、無藥物殘留的微生態(tài)飼料添加劑已成為研究熱點[1]。人們在養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐過程中證明，益生菌的應(yīng)用可提高養(yǎng)殖動物生長率、成活率和免疫力。益生菌作為一種綠色環(huán)保的新型飼料添加劑[2]，是代替抗生素和化學(xué)藥物防治水產(chǎn)動物病害的最佳選擇，逐步被水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)認可和推廣。

枯草芽孢桿菌（）是最常用、最具特色的一類芽孢桿菌，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用研究較多，該菌對養(yǎng)殖動物和人無病原性、毒性及毒副作用，易于生產(chǎn)和保存[3]，并且在自然界分布廣泛, 國內(nèi)外均允許將其用于飼料添加劑[4]。但目前現(xiàn)行的大多數(shù)枯草芽孢桿菌仍然來自于畜禽微生態(tài)制劑，部分商業(yè)化產(chǎn)品中菌株來源標(biāo)示不明確。而益生菌菌株往往具有宿主特異性，因此適用于畜禽的微生態(tài)制劑未必能在水產(chǎn)動物體內(nèi)有效定植[5]。從宿主本身篩選出的土著微生物可以很好地適應(yīng)環(huán)境，更高效地抑制病原菌[6]。研制水產(chǎn)飼用益生菌添加劑的方法是用水產(chǎn)動物體內(nèi)正常微生物群的成員，經(jīng)過選種和人工培養(yǎng)，制成活菌制劑，然后再使其在腸道定植，發(fā)揮生理作用[7]。目前，研究者從不同水產(chǎn)動物如黃顙魚[8]、斜帶石斑魚[9]腸道中分離到枯草芽孢桿菌，結(jié)果均表明，枯草芽孢桿菌的抗逆性及在消化道中的穩(wěn)定性均強于其他益生菌，并對動物生長起到促進作用，具有開發(fā)成微生態(tài)制劑的潛力。但目前未見從貝類中分離枯草芽孢桿菌的有關(guān)報道。

從健康菲律賓蛤仔（）肝胰臟中分離純化出一株細菌，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性、16S rDNA序列測定、系統(tǒng)發(fā)育分析等方法鑒定為枯草芽孢桿菌。然后對其生長曲線、耐高溫、耐酸性、耐膽鹽等生物學(xué)特征進行研究。本研究為分離自菲律賓蛤仔肝胰臟中的枯草芽孢桿菌菌株作為水產(chǎn)動物益生菌的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1 材料

20只健康2齡菲律賓蛤仔（）取自天津市某貝類養(yǎng)殖基地。

1.2　菌株分離

菲律賓蛤仔體表用75%酒精棉球消毒，解剖并取其肝胰臟，用無菌生理鹽水反復(fù)沖洗后，加入1 mL預(yù)冷的無菌生理鹽水，充分勻漿，1 200 r/min，離心2 min，取上清液按10倍稀釋法稀釋。取原液、10-1、10-2三個稀釋度的樣品各100 μL，進行MRS培養(yǎng)基（蛋白胨10 g、牛肉浸粉5 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸氫二銨2 g、乙酸鈉5 g、硫酸錳0.05 g、瓊脂15 g、吐溫80 1 mL、蒸餾水1 L）平板涂布，每個稀釋梯度涂布3個平板，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。

挑取單菌落劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g、瓊脂粉18 g、蒸餾水1 L），在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，重復(fù)劃線接種培養(yǎng)2～3 次，得到純的菌株，進行染色鏡檢。挑取革蘭氏染色陽性的一株，進行編號，命名為G6。再將純化后的菌株用40%甘油和LB液體培養(yǎng)基1∶1制成菌懸液，保藏于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3　生理生化特征

利用微生物生化鑒定管（杭州微生物試劑有限公司）進行生理生化特征研究，結(jié)果判定依據(jù)參考《伯杰細菌鑒定手冊》[10]及《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]。

1.4　16S rDNA序列測定

用水煮法[12]提取菌株G6的總DNA作為模板。用通用引物進行16S rDNA序列的PCR擴增。其中正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′；反向引物為1492R：5′-TACGGCTACC TTGTT ACGACTT-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系（25 μL）包括d NTP Mixture 10 μL，引物 27F 1 μL，引物 1492R 1 μL，模板 DNA 2 μL，超純水11 μL。PCR擴增條件為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃，1 min，55 ℃，1 min , 72 ℃，1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1％瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下觀察，將有目標(biāo)條帶的 PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測得的序列使用Chromas 2.22軟件處理，通過DNAMAN 6.0進行拼接后，登錄GenBank（http://www.ncbi. nlm. nih.gov/），對于菌株 16S rDNA 測序的結(jié)果，利用Blast功能進行序列比對，并選取相似性較高的菌株，使用Mega 5軟件采取Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.5　生長曲線

將菌株G6的活化液按5 %的接種量接入至新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)。在600 nm波長下每2 h測定一次菌液值，30 h以后，每4 h測定一次，共持續(xù)50 h。

1.6　耐受性

1.6.1 耐酸性試驗

參考楊鋒等[13]的方法進行耐酸性試驗。

試驗1：將G6菌液按5% 接種量分別接種于pH為 2、3、4的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，在600 nm波長下分別測定生長至2 h和6 h菌液的值，將pH為7的液體培養(yǎng)基作為對照組。

試驗2：按5%的接種量將G6菌液分別接種到pH 為4、5、6、7、8的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)30 h，在600 nm波長下每2 h測定一次菌液的值。

1.6.2 耐高溫試驗

將37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后的G6菌液，按5%的接種量接種在2 mL的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，重新37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h后取出，在70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃中分別水浴5 min、15 min，然后冷卻取出菌液，在600 nm波長下測定菌液值，即為菌液初始值。然后將菌液放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，在600 nm波長下測定菌液值。沒有經(jīng)過熱處理的菌液恒溫37 ℃培養(yǎng)作為對照。

1.6.3 耐膽鹽試驗

取G6菌株培養(yǎng)液按 5% 接種量分別接種于10 mL 質(zhì)量濃度為0%、0.03%、0.10%、0.20%和0.30%的膽鹽溶液中，0 h計數(shù)作對照，37 ℃培養(yǎng)24 h后，在600 nm波長下測定菌液值。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

G6菌株的菌落呈圓形，略粗糙，表面有褶皺，稍帶光澤，乳白色（近蠟狀顏色）；光學(xué)顯微鏡下顯示菌株G6革蘭氏染色呈陽性，染色均勻，呈短鏈狀排列，單個菌體呈桿狀。

2.2　生理生化特征

菌株G6的生化特征見表1，V-P反應(yīng)呈陽性，能利用葡萄糖、木糖產(chǎn)酸，能水解淀粉和還原硝酸鹽等。對照《伯杰細菌鑒定手冊》《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的生理生化特征，初步鑒定菌株G6為枯草芽孢桿菌（）。

表1 菌株G6的生理生化特征

注：“＋”表示陽性結(jié)果，“－”表示陰性結(jié)果

2.3　16S rDNA 序列分析

菌株G6的16S rDNA PCR擴增的產(chǎn)物大小為1 445 bp（圖1），測得的序列通過拼接后，再將其16S rDNA序列上傳至NCBI中進行BLAST同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)與（KU179323.1）的同源性為99.93%，篩選7條同源性比較相近的序列和一條外類群的序列，建立比對模型，用Mega 5采取Neighbor-Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，利用bootstrap 生成1 000個自展數(shù)據(jù)集對進化樹進行可靠性分析。如圖2所示，菌株G6與菌株（KU179323.1和AJ276351.1）聚為一支。

圖1 菌株G6的 16S rDNA 基因擴增結(jié)果

注：M為Maker，G6為菌株G6

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.4　生長曲線

由枯草芽孢桿菌G6的生長曲線可見，其適應(yīng)期不明顯，很快進入對數(shù)增長期，0～4 h生長速率快，4～24 h生長速率減緩，但菌體濃度仍在增加。26～34 h 達到穩(wěn)定期，40 h后進入衰亡期（圖3）。

圖3 枯草芽孢桿菌G6的生長曲線

2.5　耐酸性試驗

2.5.1 枯草芽孢桿菌G6在pH 為2、3、4時，枯草芽孢桿菌仍可以緩慢增長（圖4A）。

2.5.2 枯草芽孢桿菌G6在pH 分別為4、5、6、7、8的溶液中培養(yǎng)30 h后，發(fā)現(xiàn)菌液600值一直呈上升趨勢，但在不同溶液中生長情況略有不同。在pH為5、6、7、8的溶液中生長較好（600值在0.6～2.0之間），在pH為4 的溶液中生長較差（600值在0.1～1.6之間）。初始pH為5、6、7、8的菌液，經(jīng)過20 h培養(yǎng)后，600值相近（圖4B）。

圖4 枯草芽孢桿菌G6的耐酸性

2.6　耐膽鹽試驗

枯草芽孢桿菌G6的耐膽鹽試驗結(jié)果顯示，在膽鹽為0.03%時，枯草芽孢桿菌生長最好，其次為0%、0.10%、0.20%、0.30%。在膽鹽為0.30%時，對菌株G6的生長抑制作用最明顯（圖5）。

圖5 枯草芽孢桿菌G6的耐膽鹽特性

2.7　耐高溫試驗

枯草芽孢桿菌G6的耐高溫試驗結(jié)果顯示，在70 ℃、80 ℃處理5 min、15 min后，培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)菌液600值高于37 ℃對照組（圖6 A，B）。在90 ℃、100 ℃處理5 min、15 min后，培養(yǎng)24 h，測得菌液600值低于37 ℃對照組（圖6 C，D）。在100 ℃處理15 min后的菌液初始600值與其培養(yǎng)24 h后的菌液600值接近，推測G6菌株在100 ℃處理15 min后失去活性（圖6D）。

圖6 枯草芽孢桿菌G6的耐高溫性

注：A為70 ℃處理，B為80 ℃處理，C為90 ℃處理，D為100 ℃處理

3 討論

從健康菲律賓蛤仔（）肝胰臟中分離純化出一株革蘭氏陽性細菌，命名為G6，對其進行形態(tài)學(xué)觀察及生理生化特性研究。生理生化試驗結(jié)果顯示G6菌株V-P反應(yīng)、明膠液化試驗呈陽性，能水解淀粉和還原硝酸鹽，并且可以利用葡萄糖、木糖產(chǎn)酸，實驗結(jié)果與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的生理生化特征基本一致，因此初步鑒定該菌株為枯草芽胞桿菌。但因枯草芽孢桿菌與蠟樣芽孢桿菌生理生化相似度較高，常規(guī)的生化指標(biāo)測定只能進行初步判定，并且較難得到正確的鑒定。所以，為進一步確定該菌株，決定采用分子鑒定法。由于16S rDNA基因序列長度適中，遺傳信息豐富，既有保守區(qū)，也存在種間變異，適合進行細菌分類鑒定和系統(tǒng)發(fā)育進化分析[14]。所以，本研究采用16S rDNA基因序列分析對菌株G6的種屬進行進一步確認。結(jié)果表明，該菌株與枯草芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（KU179323.1）同源性高達99.93% ，在系統(tǒng)發(fā)育樹上與枯草芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（KU179323.1）和菌株（AJ276351.1）聚為一支，故進一步確認菌株G6 為枯草芽胞桿菌。

生長特性研究結(jié)果表明，菌株G6的生長曲線適應(yīng)期不明顯，直接進入對數(shù)增長期，且進入穩(wěn)定期的時間較長。這可能是由于測定生長曲線時所用接種菌液為枯草芽孢桿菌G6的活化液，所以在測定的生長曲線上沒有顯示出適應(yīng)期。

耐受性結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌G6在強酸條件下生長情況較差，在弱酸性和中性環(huán)境中生長旺盛，此結(jié)果與楊鋒等[13]的實驗結(jié)果基本一致。耐高溫試驗結(jié)果顯示，菌株G6具有較好的耐高溫特性，但在100 ℃處理15 min后可以使其死亡。另外，經(jīng)過70 ℃、80 ℃處理后的菌液在常溫培養(yǎng)后，菌液濃度與對照組相比不減反增，推測可能是高溫激活了枯草芽孢桿菌中的芽孢，促進芽孢萌發(fā)，從而導(dǎo)致枯草芽孢桿菌的繁殖速度加快[10]。研究菌株G6膽鹽耐受性的目的在于檢測枯草芽孢桿菌是否具有潛在的益生特質(zhì)。因為細菌在腸道中存活和增殖必須能夠耐受一定濃度的膽鹽環(huán)境，才可以保持足夠的活菌數(shù)，從而發(fā)揮益生作用。本次耐膽鹽試驗結(jié)果顯示，菌株G6在膽鹽濃度為0.03%的情況下生長情況最好，之后隨著膽鹽濃度增加，抑制生長作用增大，但是在0.30%的膽鹽濃度下，菌株G6仍可繼續(xù)存活增殖，說明G6具備較高的膽鹽耐受性。此結(jié)果與鐘羅華等[15]報道的豬源芽孢桿菌的耐膽鹽特性基本一致。Spinosa等[16]和吳正存等[17]認為，耐膽鹽的菌株能夠更好地適應(yīng)腸道環(huán)境，更容易增殖生長。因此推測，枯草芽孢桿菌G6能夠適應(yīng)水產(chǎn)動物腸道環(huán)境，具有潛在的益生特性，但這還需要進一步的實驗驗證。

用將益生菌應(yīng)用于養(yǎng)殖水體或作為飼料添加劑的方法來提高水生動物的自身免疫力并促進其生長，對促進生態(tài)健康水產(chǎn)養(yǎng)殖具有實際意義。本研究首次從菲律賓蛤仔中分離到枯草芽孢桿菌，相關(guān)生物學(xué)特征研究結(jié)果將對其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：張愛婷

Isolation, identification and biological characteristics of afrom

MAO Qing1, CHEN Feng1, LIANG Jian1, LIU Jun-feng2, Lü Ai-jun1, HU Xiu-cai1, GUO Yong-jun1, XING Ke-zhi1, SUN Jing-feng1, Corresponding Author

（1.Tianjin Key Lab of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Yushengtang Biotechnology Co. Ltd., Tianjin 300404, China）

A bacterium strain was isolated and purified from the hepatopancreas of healthyand named G6. This bacterium strain was identified asaccording to the results of morphological observation, physiological and biochemical characteristics, 16S rDNA sequence, and phylogenetic analysis. Its biological characteristics were studied, including growth curve, resistance to high temperature, acid, and bile salt. Results showed that the strain G6 had a long growth period and a stationary phase from 26 to 34 h and was resistant to high temperature, acid, and bile salt. This report provided a scientific base for application of G6 as the probiotic for aquatic animals.

;; isolation; identification; growth characteristics; resistance

S917.4

A

2018-01-04

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-48）；天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊項目（ITTFRS2017009，ITTFRS2017013）；天津市北辰區(qū)科技創(chuàng)新專項項目（KJCX-XDZ-KTP-2016-005）

毛晴（1996-），女，本科在讀，研究方向為水產(chǎn)養(yǎng)殖。E-mail：mq_9117@163.com。

孫敬鋒（1976-），男，教授，博士，研究方向為水產(chǎn)動物病害及免疫學(xué)。E-mail：sun_jf@163.com。

1008-5394（2018）02-0042-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.02.011