趙小琪，黃英，楊明華，潘洪彬，趙素梅

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真核表達(dá)載體pIRES2-AcGFP1-PLIN2的構(gòu)建及其在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中的表達(dá)

趙小琪，黃英，楊明華，潘洪彬，趙素梅通信作者

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201）

構(gòu)建pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表達(dá)載體，并觀察其在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染狀況。采用分子克隆技術(shù)，將PLIN2基因連接到pMD18-T載體中做Ⅰ/I雙酶切，將酶切產(chǎn)物回收并將雙酶切后的目的片段與pIRES2-AcGFP1載體連接，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并提取pIRES2-AcGFP1-PLIN2陽性重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到3T3-L1前脂肪細(xì)胞，顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。本研究成功克隆出了PLIN2基因，同時(shí)成功構(gòu)建了pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表達(dá)載體，并在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中成功表達(dá)，于顯微鏡下觀察到綠色熒光，試驗(yàn)為進(jìn)一步研究PLIN2基因?qū)χ炯?xì)胞的調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

烏金豬；PLIN2基因；真核表達(dá)載體

脂滴相關(guān)蛋白存在于脂滴表面，這些蛋白調(diào)節(jié)著脂滴中脂肪的合成與分解代謝。其中，PAT 家族是最重要的脂滴相關(guān)蛋白，脂肪分化相關(guān)蛋白（perilipin 2，PLIN2）屬于PAT家族成員之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，PLIN2基因可促進(jìn)脂滴的形成，同時(shí)能通過阻礙脂肪細(xì)胞甘油三酯水解酶（ATGL）與脂滴表面接觸實(shí)現(xiàn)屏障功能[2]。豬是研究脂肪代謝最佳的模式動(dòng)物之一，構(gòu)建豬PLIN2基因的真核表達(dá)載體對(duì)研究脂肪細(xì)胞內(nèi)脂類代謝機(jī)制具有重要作用。

本研究通過分子克隆技術(shù)，克隆了烏金豬PLIN2基因，成功構(gòu)建了pIRES2-AcGFP1- PLIN2真核表達(dá)載體，并在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中成功表達(dá)，為進(jìn)一步研究PLIN2基因?qū)χ炯?xì)胞的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選擇健康、胎次相近、體重達(dá)100 kg的烏金豬6頭，公母各半，屠宰，取背最長肌相同部位的肌肉于-80 ℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；TRIzol總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶、pMD18-T Vector、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自大連寶生物工程有限公司；3T3-L1前脂肪細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；pIRES2- AcGFP1表達(dá)載體由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)版納微型豬實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.2 總RNA的提取

豬背最長肌中總RNA的提取采用TRIzol法。同時(shí)，用紫外-可見分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測其濃度和純度。

1.3 PCR引物設(shè)計(jì)

參考GenBank中豬的PLIN2基因序列，采用DNASTAR軟件進(jìn)行比對(duì)，然后使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，上、下游引物分別加入I和I酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

表1 目的基因的引物序列、產(chǎn)物長度及登錄號(hào)

1.4 PLIN2基因的克隆和鑒定

取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系（總體積為20 μL）：0.5 mmol/L dNTP 2 μL，12 μmol/L隨機(jī)引物2 μL，10 U反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV RTase）1 μL，20 U RNA酶抑制劑（RNase inhibitor）0.5 μL，5 ×RT Buffer（含250 mmol/L Tris-HCl pH值8.3，50 mmol/L DTT，250 mmol/L KCl，50 mmol/L MgCl2，2.5 mmol/L Spermidine）4 μL，RNase-free Water加至20 μL。先加RNA模板，隨機(jī)引物和dNTP，70 ℃變性5 min，立即置于冰上冷卻，然后加其余試劑，37 ℃反應(yīng)60 min，95 ℃滅活5 min。反轉(zhuǎn)錄的cDNA -20 ℃保存，備用。

用膠回收試劑盒回收目的片段，連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB培養(yǎng)基平板，待長出菌落后經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑取白色單菌落，分別取PCR鑒定過的菌液提取重組質(zhì)粒，用Ⅰ/I雙酶切鑒定陽性菌液，酶切體系為：8 μL質(zhì)粒DNA，2 μL 10×buffer，1 μLⅠ，1 μLI，8 μL ddH2O，總體系為20 μL。

1.5 pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表達(dá)載體構(gòu)建

1.5.1 PLIN2目的基因片段的制備

將上述陽性克隆的菌液進(jìn)行活化搖菌，擴(kuò)大培養(yǎng)，然后提取pMD18-T-PLIN2質(zhì)粒，酶切鑒定后回收目的條帶，步驟同PLIN2基因克隆。

1.5.2 PLIN2基因片段與pIRES2-AcGFP1質(zhì)粒的重組連接和鑒定

將PLIN2基因片段連接到pIRES2-AcGFP1質(zhì)粒，連接產(chǎn)物使用DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂平板，藍(lán)白斑篩選。分別取PCR驗(yàn)證過的菌液提取pIRES2-AcGFP1-PLIN2重組質(zhì)粒，用雙酶切鑒定陽性菌液，酶切體系同PLIN2基因克隆，最后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.6 pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表達(dá)載體在3T3-L1前脂肪細(xì)胞中的表達(dá)

1.6.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)

培養(yǎng)條件：加入DMEM完全培養(yǎng)液，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。將長到90 %左右匯合的細(xì)胞中的舊培養(yǎng)基吸棄，然后加入胰酶消化。待細(xì)胞消化充分后，加入適量的完全培養(yǎng)液，離心（1 000 r/min，5 min）棄上清液，加入DMEM完全培養(yǎng)液后以5×104個(gè)/mL的密度接種，37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)24 h進(jìn)行傳代；重復(fù)此步驟再傳代。以2.2×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度進(jìn)行接種，使其在培養(yǎng)大約16 h后，細(xì)胞融合度達(dá)到80 %。

1.6.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期研究優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件：采用pIRES2-AcGFP1- PLIN2質(zhì)粒和Lipofectamine 2000脂質(zhì)體試劑盒，并按其推薦的質(zhì)粒：脂質(zhì)體為0.8 μg/2.0 μL，以80 %細(xì)胞融合度進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染18 h，在轉(zhuǎn)染結(jié)束后采用熒光顯微攝影，觀察轉(zhuǎn)染情況。

2 結(jié)果

2.1 肌肉組織總RNA的提取

采集烏金豬背最長肌，提取總RNA，取2 μL在1.5 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測mRNA的完整性（圖1）。

圖1 總RNA的提取

由圖1可知，各泳道點(diǎn)樣孔沒有殘留，28 S和18 S條帶清晰，且28 S和18 S灰度比約2∶1，無拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)，表明RNA無降解，質(zhì)量可靠，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 PCR擴(kuò)增及質(zhì)粒酶切

通過RT-PCR技術(shù)，得到了烏金豬1 412 bp PLIN2基因的全編碼區(qū)目的片段（圖2）。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小與目的片段大小相同。經(jīng)過克隆后，將所提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切鑒定克隆的目的片段為PLIN2基因（圖3）。

圖2 PCR擴(kuò)增PLIN2基因

注：M為DL 2000；1為擴(kuò)增的PLIN2基因

圖3 pMD18-T-PLIN2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

注：M為DL 2000；1為提取的pMD18-T-PLIN2重組質(zhì)粒；2為重組質(zhì)粒的雙酶切

2.3 pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表達(dá)載體構(gòu)建

2.3.1 提取PLIN2基因目的片段

通過提取重組質(zhì)粒pMD18-T-PLIN2，應(yīng)用PCR方法，得到烏金豬1 412 bp PLIN2基因的全編碼區(qū)目的片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小與目的片段大小相同（圖4）。

圖4 PLIN2基因目的片段

注：M為DL 2000；1為PCR擴(kuò)增PLIN2 基因片段

2.3.2 pIRES2-AcGFP1-PLIN2重組質(zhì)粒的鑒定

PLIN2基因與表達(dá)載體pIRES2-AcGFP1連接轉(zhuǎn)化后，提取的質(zhì)粒經(jīng)I和I雙酶切得到1 412 bp片段（圖5）。測序結(jié)果用DNAstart軟件與NCBI進(jìn)行比對(duì)，相似性為100 %。

圖5 pIRES2-AcGFP1-PLIN2重組質(zhì)粒酶切鑒定

注：M為DL 2000；1為pIRES2-AcGFP1-PLIN2重組質(zhì)粒；2為pIRES2-AcGFP1-PLIN2的雙酶切

2.4 轉(zhuǎn)染后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)

重組質(zhì)粒pIRES2-AcGFP1-PLIN2轉(zhuǎn)染3T3- L1細(xì)胞，細(xì)胞融合度達(dá)80%，轉(zhuǎn)染18 h后細(xì)胞生長情況、轉(zhuǎn)染效果見圖6。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量少于空白對(duì)照組，且在實(shí)驗(yàn)組中檢測到綠色熒光，說明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。

圖6 細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)染效果圖（×10）

注：左邊為普通光源下的細(xì)胞圖片；右邊為熒光下的圖片。其中，a、c為細(xì)胞圖，b、d為熒光圖；a、b為對(duì)照組，c、d為實(shí)驗(yàn)組

3 討論

脂滴是甘油三酯或膽固醇酯等中性脂質(zhì)的主要儲(chǔ)存場所，其表面分布有許多蛋白質(zhì)分子[3-7]。脂肪分化相關(guān)蛋白（PLIN2）位于脂滴表面，能促進(jìn)脂滴的形成，是一種重要的脂滴相關(guān)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠成纖維母細(xì)胞中外源性過表達(dá)PLIN2基因，可以顯著增加細(xì)胞內(nèi)脂滴的大小和數(shù)量[8-9]。在3T3-L1前脂肪細(xì)胞早期分化階段，PLIN2基因最先出現(xiàn)于脂滴表面，并隨著細(xì)胞成熟分化逐漸增加[10]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，PLIN2基因的mRNA在培養(yǎng)的前脂肪細(xì)胞中顯著表達(dá)[11-12]，但在脂肪細(xì)胞分化過程中表達(dá)量不斷降低，因此在成熟脂肪細(xì)胞中未檢測到PLIN2[13]。PLIN2基因?qū)ωi脂肪細(xì)胞內(nèi)脂類代謝的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步探索，因此，構(gòu)建PLIN2基因的真核表達(dá)載體，有助于進(jìn)一步了解PLIN2基因的功能。

在體內(nèi)研究前脂肪細(xì)胞的分化增殖過程非常困難，目前脂肪細(xì)胞增殖分化及調(diào)控主要應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)模型進(jìn)行研究。而原代分離培養(yǎng)的豬脂肪細(xì)胞增殖速度慢，貼壁少，易自分化成脂滴，而且傳代后細(xì)胞容易變形，因此，目前進(jìn)行豬脂類代謝調(diào)控相關(guān)研究，廣泛使用的是鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞[14-16]。

目前研究證實(shí)，在篩選克隆表達(dá)或分析啟動(dòng)子和增強(qiáng)子時(shí)，GFP是一個(gè)理想的報(bào)告基因。AcGFPI是野生型蛋白的熒光突變體，在氨基酸水平上與GFP的同源性高達(dá)94 %。它具有進(jìn)行人類密碼子優(yōu)化的開放閱讀框，這不僅提高了AcGFPI mRNA的轉(zhuǎn)化效率，也提高了它在高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)水平[17-18]。本試驗(yàn)選用pIRES2-AcGFP1載體，首先是因?yàn)樗钦婧吮磉_(dá)載體，其次還因?yàn)闃?gòu)建該載體的方法簡便，轉(zhuǎn)染后可以直接在熒光顯微鏡下觀察有無綠色熒光，直觀地了解轉(zhuǎn)染效率。因此，構(gòu)建的pIRES2- AcGFP1-PLIN2重組載體，能夠更加高效地感染細(xì)胞，以便于從整體上了解PLIN2基因的功能。同時(shí)，PLIN2基因被整體地插入細(xì)胞中，能夠穩(wěn)定表達(dá)，不會(huì)在分化和傳代的過程中丟失。

本試驗(yàn)成功克隆了PLIN2基因，同時(shí)成功構(gòu)建了pIRES2-AcGFP1-PLIN2真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)入3T3-L1細(xì)胞中成功表達(dá)，為進(jìn)一步研究PLIN2基因?qū)χ炯?xì)胞的調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：張愛婷

Construction of eukaryotic expression plasmid pIRES2-AcGFP1- PLIN2 and its expression in 3T3-L1 preadipocytes

ZHAO Xiao-qi, HUANG Ying, YANG Ming-hua, PAN Hong-bin, ZHAO Su-meiCorresponding Author

（Key Lab of Agricultural Animal Nutrition and Feed Science, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China）

The eukaryotic expression plasmid pIRES2-AcGFP1-PLIN2 was constructed and its transfection status in 3T3-L1 preadipocytes was observed. The PLIN2 gene was cloned into pMD18-T vector and digested byI/I. The digested product was digested and then ligated into pIRES2-AcGFP1 vector and transformed into DH5α competent cells, and pIRES2-AcGFP1-PLIN2 positive recombinant plasmid was extracted and transfected into 3T3-L1 preadipocytes. The Transfection condition was observed by microscope. The PLIN2 gene was successfully cloned. At the same time, the eukaryotic expression plasmid pIRES2-AcGFP1-PLIN2 was successfully constructed and expressed in 3T3-L1 preadipocytes. The green fluorescence was observed under the microscope, which laid the foundation for further studying the regulation mechanism of PLIN2 gene on adipocytes.

Wujin pig; PLIN2 gene; eukaryotic expression plasmid

S811.3

A

1008-5394（2018）02-0055-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.02.014

2018-03-26

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31760645，31260592，31060331）

趙小琪（1993－），男，碩士在讀，主要從事動(dòng)物分子營養(yǎng)與代謝調(diào)控方面的研究。E-mail：583478872@qq.com。

趙素梅（1974－），女，教授，博士，主要從事動(dòng)物分子營養(yǎng)與代謝調(diào)控方面的研究。E-mail：zhaosm2009@126.com。