陳玉禮 韋紅玉 唐華英 趙麗娟 曾怡

【摘要】 目的 明確幽門螺桿菌表型與毒力的相關性，掌握幽門螺桿菌的生物學特征，為臨床快速了解幽門螺桿菌的毒力并通過減毒方法防治幽門螺桿菌提供實驗依據(jù)。方法 配制含有合適濃度的甲硝唑培養(yǎng)液，用倍比稀釋法使培養(yǎng)液中甲硝唑的濃度為0 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml、32 μg/ml，分別培養(yǎng)幽門螺桿菌，誘導幽門螺桿菌的形態(tài)發(fā)生球形變，然后用革蘭染色鏡下觀察培養(yǎng)12 h、24 h、48 h時在不同抗生素濃度下幽門螺桿菌形態(tài)學的變化，并用Real-time PCR法檢測不同形態(tài)學下其細胞毒素相關基因A（CagA）和空泡毒素基因（VacA）毒力基因的表達。結(jié)果 培養(yǎng)12 h時幽門螺桿菌的形態(tài)未發(fā)生變化；當培養(yǎng)24 h時在16 μg/ml、32 μg/ml濃度抗生素下，一部分幽門螺桿菌由螺旋狀變成了短桿狀；培養(yǎng)48 h時在16 μg/ml、32 μg/ml濃度抗生素下，幽門螺桿菌幾乎全部變成了圓球狀，其他抗生素濃度下的幽門螺桿菌沒有形態(tài)學變化，且球形變時幽門螺桿菌的CagA和VacA表達下降。結(jié)論 幽門螺桿菌表型與毒力有密切的關系，抗生素能誘導幽門螺桿菌發(fā)生形態(tài)學變化且球形變的幽門螺桿菌毒力下降。

【關鍵詞】 幽門螺桿菌；抗生素；表型；毒力變化

中圖分類號：R378 文獻標識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2018.03.003

【Abstract】 Objective To clarify relationship between the phenotype and virulence of Helicobacter pylori and to grasp the biological characteristics of Helicobacter pylori，so as to provide experimental evidence for the clinical understanding of the virulence of Helicobacter pylori and the prevention and treatment of it by detoxification.Methods Metronidazole medium containing suitable concentration was prepared.The concentration of metronidazole in the culture medium was 0 μg/ml，2 μg/ml，4 μg/ml，8 μg/ml，16 μg/ml，32 μg/ml by double dilution method，and they were respectively used to culture Helicobacter pylori.The morphology of Helicobacter pylori was induced to be spherical.And then，the morphological changes of Helicobacter pylori at different concentrations of antibiotics were observed under Gram staining microscope at 12 h，24 h and 48 h.In addition，the expression of cytotoxin associated gene（CagA） and vacuolating cytotoxin gene A（VacA） under different morphology were detected by real time PCR.Results The morphology of Helicobacter pylori did not change when culturing for 12 h，while some Helicobacter pylori changed from spiral to short rod under concentrations of 16 g/ml and 32 g/ml when culturing for 24 h.When culturing for 48 h，almost all of the Helicobacter pylori became globular at the concentration of 16 μg/ml and 32 μg/ml，but no morphological changes were found in other concentrations of antibiotics.Furthermore，the expression of CagA and VacA genes in Helicobacter pylori decreased during globular change.Conclusion The phenotype of Helicobacter pylori is closely related to its virulence.Antibiotics can induce morphological changes of Helicobacter pylori and decrease the virulence of the globular Helicobacter pylori.

【Key words】 Helicobacter pylori；antibiotics；phenotype；virulence change

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，Hp）與人體胃、十二指腸疾病密切相關，也是胃癌演變的始動因子之一。目前Hp在全世界感染率超過50%，一些不發(fā)達地區(qū)甚至可超過80%[1]。1994年世界衛(wèi)生組織（WHO）已將Hp列為第一類生物致癌因子，2012年2月中國疾病預防控制中心對2008年中國的癌癥死亡人數(shù)進行報道，其中因為胃癌死亡73.6萬例，在惡性腫瘤死亡率中排第二位，可見Hp嚴重危害人類健康。細胞毒素相關基因A（CagA）是CagA PAI中主要的毒力基因，編碼的CagA蛋白分子量為120～145 kDa，其5端長約900個氨基酸，為保守區(qū)，3端由若干不等的重復序列組成，為可變區(qū)[2]。另外，分子流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)空泡毒素基因（VacA）也是主要的致病因子，CagA+/VacA+的Hp患者消化道潰瘍和胃癌的發(fā)生率明顯升高[3]。有學者提出Hp感染復發(fā)可能與細菌的球形變有關，并推測球形Hp可潛伏在機體中，當機體內(nèi)環(huán)境適合Hp生長繁殖時便可引起疾病的再次發(fā)作[4]。那么伴隨著Hp的形態(tài)變化，其毒力將會如何改變？ 這種改變是表型的變化抑或是基因的變化呢？本研究通過采用抗生素的誘變作用，使Hp發(fā)生球形變，明確幽門螺桿菌表型與毒力的相關性，掌握幽門螺桿菌的生物學特征，為臨床快速了解幽門螺桿菌的毒力并通過減毒方法防治幽門螺桿菌提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料

菌株是26695標準菌株，由本實驗所保存，馬血清、革蘭染色試劑盒、CO2產(chǎn)氣袋、腦心浸液培養(yǎng)基、提取RNA試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購自卓一生物技術(shù)有限公司。實驗用的儀器有：高速冷凍離心機、渦旋振蕩器、普通PCR擴增儀、電子天平、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、電子顯微鏡、超凈工作臺、超純水機、超低溫冰箱。

1.2 方法

1.2.1 幽門螺桿菌液體培養(yǎng)基（腦心浸液培養(yǎng)基）配制

腦心浸液培養(yǎng)基按照說明配制，高壓滅菌冷卻后，每100 ml的培養(yǎng)基中加入5～10 ml的馬血清，放入4℃冰箱備用。

1.2.2 用倍比稀釋法配制含有不同濃度甲硝唑的幽門螺桿菌培養(yǎng)基

稱取適量的甲硝唑，用配制好的腦心浸液培養(yǎng)基溶解成甲硝唑濃度為32 μg/ml的培養(yǎng)液，然后對此溶液進行2倍的倍比稀釋：用滅菌1 ml吸管吸取上述配制好的32 μg/ml抗生素溶液5 ml，沿管壁徐徐注入含有5 ml腦心浸液培養(yǎng)基試管中，輕搖混勻，記為16 μg/ml稀釋度含抗生素培養(yǎng)液。另取滅菌1 ml吸管，按照上述操作方法，進行2倍遞增稀釋。如此每遞增稀釋一次，即換用1支1 ml滅菌吸管，依次稀釋至2 μg/ml稀釋度含抗生素培養(yǎng)液，最終配制成0 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、16 μg/ml、32 μg/ml，6組不同濃度甲硝唑的幽門螺桿菌培養(yǎng)基。

1.2.3 在不同濃度甲硝唑的培養(yǎng)基下培養(yǎng)后革蘭染色鏡下幽門螺桿菌的形態(tài)學變化

將等量標準菌株菌液分別接種到含有不同濃度的甲硝唑的培養(yǎng)液中，然后置于微需氧的環(huán)境中（10%CO2、5%O2、85%N2），分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后進行革蘭染色，并放在鏡下觀察幽門螺桿菌形態(tài)。

革蘭染色鏡檢步驟：（1）涂片：用接種環(huán)取兩環(huán)培養(yǎng)的菌液，放到潔凈的玻片上劃線的區(qū)域，均勻涂開，盡量涂薄，自然干燥。（2）固定：將玻片用夾子夾著在酒精燈火焰上方2～3 cm處，來回3遍，以固定菌體在玻片上。（3）初染：菌體區(qū)域滴加龍膽紫溶液，輕輕晃動玻片使其全部覆蓋菌體區(qū)域，染液停留1 min，用自來水輕輕沖洗玻片，并盡量瀝干水分。（4）媒染：在菌體區(qū)域滴加碘溶液使其覆蓋全部菌體區(qū)域，染液停留1 min左右，用自來水輕輕沖洗玻片，瀝干水分。（5）脫色：在菌體區(qū)域滴加95%酒精溶液使其覆蓋全部菌體區(qū)域，停留30 s左右，用自來水輕輕沖洗玻片，瀝干水分。（6）復染：在菌體區(qū)域滴加沙黃溶液使其覆蓋全部菌體區(qū)域，停留1～2 min，用自來水輕輕沖洗玻片，瀝干水分，并自然干燥。（7）觀察：待標本干燥后置于光學顯微鏡下，觀察細菌的染色特征以及形態(tài)特征。

1.2.4 Real-time PCR檢測幽門螺桿菌不同形態(tài)下毒力因子的表達

將螺桿狀的幽門螺桿菌和圓球狀的幽門螺桿菌按照提取RNA試劑盒說明書步驟分別提取總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA進行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用Real-time PCR SYBR GreenⅠ法檢測幽門螺桿菌相關基因（CagA和VacA）表達。其qPCR反應的引物設計、反應體系的配制及反應程序見表1～表3。

2 結(jié)果

2.1 在不同時間不同濃度甲硝唑的作用下幽門螺桿菌的形態(tài)學變化

幽門螺桿菌在培養(yǎng)12 h時革蘭染色發(fā)現(xiàn)6組不同濃度的幽門螺桿菌的形態(tài)學沒有明顯的變化。如表4。幽門螺桿菌形態(tài)變?yōu)閳A球狀從多到少依次定為“++++”“+++”“++” “+”“ -”5個等級（每個+大約代表了25%的幽門螺桿菌球形變）；培養(yǎng)24 h時發(fā)現(xiàn)只有在32 μg/ml和16 μg/ml濃度下幽門螺桿菌開始有螺桿狀變成短桿狀，少部分變成了圓球狀。如表5。當培養(yǎng)48 h時發(fā)現(xiàn)在32 μg/ml和16 μg/ml濃度下幽門螺桿菌幾乎都變成圓球狀，而0 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml濃度幽門螺桿菌的形態(tài)學幾乎沒什么變化。如表6。圖1是螺桿狀幽門螺桿菌的革蘭染色圖片，圖2是抗生素誘導下螺桿狀幽門螺桿菌部分變成了短桿狀，圖3是在抗生素長時間的誘導下幽門螺桿菌由短桿狀變成了圓球形。

2.2 用Real-time PCR檢測不同形態(tài)下幽門螺桿菌的毒力因子的變化

Real-time PCR結(jié)果如圖4顯示，用甲硝唑誘導后變成圓球狀的幽門螺桿菌比誘導前螺旋狀態(tài)的幽門螺桿菌的毒力因子VacA和CagA降低。

3 討論

自從Hp被成功分離以來，世界各地對其基礎與臨床的研究日益深入。對于Hp球形體的活力和致病性存在兩種不同的看法，一種認為Hp球形體是一種退化、死亡的菌體，不具有感染力和致病性[5]；而另一種認為Hp從典型的螺旋桿狀到球形體的變化可能是對不利環(huán)境的一種短暫適應，當環(huán)境重新恢復至對Hp生長有利時，它有可能會恢復成可增殖的螺桿狀而重新致病[6]。本實驗采用6個濃度梯度甲硝唑溶液，作用于幽門螺桿菌標準菌株，誘導標準菌株的球形變，分別作用12 h、24 h、48 h后革蘭染色顯微鏡下觀察，可以看到螺旋狀、S形或海鷗狀等不規(guī)則的革蘭氏陰性彎曲桿菌。但是發(fā)現(xiàn)隨著甲硝唑濃度增加和培養(yǎng)時間的延長，顯微鏡下除了典型的彎曲桿菌，還可見球形的幽門螺桿菌，視野中混雜著不規(guī)則的桿狀和球形的幽門螺桿菌，直到最后完全球形變，說明了在不利于生長環(huán)境下，幽門螺桿菌發(fā)生了由螺桿狀逐漸變成短桿狀最后變成球形的變化，趨于穩(wěn)定，以適應環(huán)境的變化，并且毒力因子的表達量降低，進一步說明雖然抗生素能降低其毒力，但并未完全喪失其毒力，本實驗為臨床快速了解幽門螺桿菌的毒力并通過減毒方法防治幽門螺桿菌提供實驗依據(jù)，并為下一步當環(huán)境恢復到有利于Hp生長時，其形態(tài)學和毒力因子的變化打下了堅實的實驗基礎。

參 考 文 獻

[1] 張萬岱，胡伏蓮，蕭樹東，等.中國自然人群幽門螺桿菌感染的流行病學調(diào)查[J].現(xiàn)代消化及介入診療，2010，15（5）：265-270.

[2] 段秀杰，王文凱，邵世和，等.硒對幽門螺桿菌空泡毒素及其重組影響[J].中國公共衛(wèi)生，2008，24（7）：833-835.

[3] Bridge DR，Merrell DS.Polymorphism in the Helicobacter pylori CagA and VacA toxins and disease[J].Gut Microbes，2013，4（2）：101-117.

[4] Fernandes RM，Silva H，Oliveira R，et al.Morphological transition of Helicobacter pylori adapted to water[J].Future Microbiol，2017，12：1167-1179.

[5] Poursina F，F(xiàn)agri J，Mirzaei N，et al.Overexpression of spoT gene in coccoid forms of clinical Helicobacter pylori isolates[J].Folia Microbiol （Praha），2018，63（4）：459-465.

[6] Damasceno JPL，Rodrigues RP，Gonalves RC，et al.Anti-Helicobacter pylori Activity of Isocoumarin Paepalantine：Morphological and Molecular Docking Analysis[J].Molecules，2017，22（5）： pii：E786.