季 楊，梁小玉，易 軍，胡遠(yuǎn)彬

(四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610066)

干旱作為一種水量相對(duì)虧缺的自然現(xiàn)象，是限制植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量提高的主要逆境因子之一[1-2]。干旱脅迫下，抗氧化保護(hù)系統(tǒng)是植物抵御干旱脅迫最重要的機(jī)制之一，大量研究證明耐旱性強(qiáng)的鴨茅(DactylisglomerataL.)、白三葉(TrifoliumrepensL.)、黑麥草(LoliumperenneL.)等植物具有更強(qiáng)的抗氧化保護(hù)機(jī)制[3-5]，從而有效提高植物的耐旱性。同時(shí)，滲透調(diào)節(jié)也是植物抵御逆境脅迫，維持正常生命活動(dòng)不可或缺的重要生理機(jī)制[6]。Na+作為重要的無(wú)機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，高濃度的Na+能夠?qū)χ参镌斐甥}害，嚴(yán)重時(shí)能夠使植物發(fā)生質(zhì)壁分離而死亡[7]。越來(lái)越多的研究表明，低濃度的Na+對(duì)旱生植物抵御干旱脅迫發(fā)揮著積極的作用[8-9]。

目前，有關(guān)Na+提高植物抗旱性的研究主要集中在旱生植物中，而在中生植物中報(bào)道較少。鴨茅是溫帶叢生冷季禾本科牧草之一，因具有產(chǎn)量豐富、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、耐牧性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛推廣利用。然而，鴨茅喜溫暖和濕潤(rùn)氣候，耐旱性相對(duì)較差，干旱成為限制其潛力發(fā)揮的重要逆境因子。因此，本研究以敏感型鴨茅為材料，探討了無(wú)機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Na+參與干旱脅迫下鴨茅耐旱機(jī)制，為提高鴨茅的耐旱性奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為鴨茅敏感型材料“01998”。精選均勻飽滿種子，經(jīng)6%次氯酸鈉溶液消毒5 min后，用蒸餾水沖洗3～4次，播種在石英砂上并于24 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)芽，待發(fā)芽7 d后用Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，溫度設(shè)置為白天 22 ℃，夜晚15 ℃，相對(duì)含水量80%，光照300 μmol/(m2·s)，光—暗周期14 h—10 h。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

當(dāng)幼苗長(zhǎng)至3周齡時(shí)，幼苗分為4組：(1)CK(對(duì)照，Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液正常培養(yǎng)生長(zhǎng))；(2)NaCl+CK(在Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液中加入50 mmol/L的NaCl處理5 d后，更換為正常Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液)；(3)PEG(使用含有15% PEG-6000的Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水分脅迫處理)；(4)NaCl+PEG(在Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液中加入50 mmol/L的NaCl處理5 d后，更換為15% PEG-6000的Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水分脅迫)；每2 d更換1次處理液，9 d后取樣，分別測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，每個(gè)處理取4個(gè)重復(fù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

根系活力(root vitality)采用四氮唑法TTC還原法測(cè)定[10]；相對(duì)含水量(relative water content，RWC)采用烘干法測(cè)定[11]，相對(duì)含水量(%)=(鮮質(zhì)量-干質(zhì)量)/(飽和鮮質(zhì)量-干質(zhì)量)×100%；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[12]；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 活性采用核黃素-NBT 法測(cè)定[13]；過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)活性采用紫外吸收法測(cè)定；過(guò)氧化物酶(guaiacol peroxidase，POD) 活性測(cè)定用愈創(chuàng)木酚顯色法[14]；電解質(zhì)滲透率(electrolyte leakage，EL)采用電導(dǎo)儀測(cè)定[15]；游離脯氨酸(free proline)含量采用茚三酮比色法測(cè)定[16]；可溶性糖(soluble sugar)含量采用蒽酮乙酸乙酯比色法測(cè)定[16]；超氧陰離子(superoxide anion)產(chǎn)生速率和過(guò)氧化氫(H2O2)含量按照郝建軍等[17]和Uchida等[18]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

圖表用Excel軟件進(jìn)行繪制，利用SAS 8.1軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分脅迫下Na+對(duì)鴨茅葉片相對(duì)含水量和根系活力的影響

植物葉片相對(duì)含水量反映植物在逆境脅迫下的整體水分虧缺狀況。正常水分條件下添加外源NaCl對(duì)鴨茅葉片相對(duì)含水量較CK沒有顯著影響。15% PEG水分脅迫9 d后，鴨茅葉片相對(duì)含水量顯著下降，但在相同脅迫強(qiáng)度和脅迫時(shí)間下，PEG+NaCl葉片相對(duì)含水量較PEG處理顯著提高(圖1-A)。如圖1-B所示，4個(gè)處理的根系活力存在顯著差異，外源NaCl處理不僅顯著提高了水分脅迫下鴨茅根系活力，也提高了正常水分下鴨茅的根系活力。

2.2 水分脅迫下Na+對(duì)鴨茅葉片活性氧、丙二醛含量和電解質(zhì)滲透率的影響

從圖2可以看出，正常水分條件下，外源NaCl對(duì)鴨茅葉片內(nèi)活性氧成分、MDA含量和電解質(zhì)滲透率幾乎沒有任何影響，說(shuō)明低濃度NaCl對(duì)鴨茅生長(zhǎng)沒有造成脅迫傷害。鴨茅葉片內(nèi)活性氧成分、MDA含量和電解質(zhì)滲透率在水分脅迫條件下迅速增加，并顯著高于正常水分處理。其中，PEG處理和PEG+NaCl處理的超氧陰離子產(chǎn)生速率分別是對(duì)照CK的1.8、1.5 倍，H2O2含量分別是CK的3.2、2.5 倍，MDA含量分別是CK的10.0、7.2倍，電解質(zhì)滲透率分別是CK的3.0、2.2倍。結(jié)果說(shuō)明，外源NaCl顯著降低了干旱脅迫下葉片內(nèi)超氧陰離子產(chǎn)生速率、葉片內(nèi)H2O2和MDA積累以及電解質(zhì)外滲，維持了脅迫下鴨茅葉片細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，有效緩解了水分脅迫造成的氧脅迫傷害。

2.3 水分脅迫下Na+對(duì)鴨茅葉片抗氧化保護(hù)酶活性的影響

SOD、CAT和POD是植物體內(nèi)清除活性氧的重要酶類。結(jié)果表明，水分脅迫條件下，鴨茅葉片SOD活性較對(duì)照顯著增加。當(dāng)添加外源NaCl處理后，PEG+NaCl處理的SOD活性比PEG處理的活性增加24%，差異達(dá)顯著水平(圖3-A)。水分脅迫使鴨茅葉片POD活性顯著降低，在添加外源NaCl處理后下降幅度顯著減小，表明外源NaCl的添加有效緩解了水分脅迫對(duì)POD活性的抑制(圖3-B)。從圖3-C可以看出，水分脅迫處理CAT活性較對(duì)照差異不顯著，然而添加外源NaCl顯著提高了正常水分和水分脅迫下的CAT活性。

2.4 水分脅迫下Na+對(duì)鴨茅葉片內(nèi)有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

游離脯氨酸和可溶性糖是植物體內(nèi)重要的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。從圖4-A可以看出，正常水分條件下(CK和CK+NaCl處理)鴨茅葉片內(nèi)游離脯氨酸含量均較低，且差異不顯著；然而在水分脅迫條件下(PEG和PEG+NaCl)含量均急劇增加，其中PEG處理的脯氨酸含量高于PEG+NaCl處理，差異達(dá)顯著水平。同時(shí)，水分脅迫使鴨茅葉片積累了更多的可溶性糖，其中PEG+NaCl處理的可溶性糖含量顯著低于直接水分脅迫處理(圖4-B)。

3 討論與結(jié)論

干旱是限制植物生長(zhǎng)和發(fā)育最主要的逆境因子之一，水分脅迫往往會(huì)造成植物體內(nèi)大量活性氧的積累，導(dǎo)致膜質(zhì)過(guò)氧化，其中MDA是膜質(zhì)過(guò)氧化作用的產(chǎn)物之一，MDA含量高低和細(xì)胞質(zhì)膜透性變化是反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用強(qiáng)弱和質(zhì)膜破壞程度的重要指標(biāo)，被廣泛地用作氧化損傷的分析[19]。同時(shí)，電解質(zhì)滲透率直接反映植物細(xì)胞膜穩(wěn)定性，其值大小是反映干旱脅迫對(duì)植物的傷害程度[20]。抗氧化酶系統(tǒng)是主要清除活性氧的保護(hù)酶系統(tǒng)，通過(guò)催化超氧陰離子發(fā)生歧化作用而轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，并將不同細(xì)胞定位的H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，該系統(tǒng)需要活性氧清除酶系統(tǒng)的關(guān)鍵酶SOD、CAT、POD發(fā)揮協(xié)同作用，以降低氧化脅迫導(dǎo)致的植物毒害[21]。本研究中，正常水分條件下添加外源Na+處理鴨茅葉片內(nèi)MDA含量、電解質(zhì)滲透率和活性氧成分均未發(fā)生明顯變化，說(shuō)明 50 mmol/L NaCl沒有對(duì)鴨茅造成氧化脅迫傷害，而根系活力、CAT活性顯著高于對(duì)照CK，該結(jié)果與李州等的研究結(jié)果[4，22]一致，即吸收適量的Na+有助于促進(jìn)植物生長(zhǎng)。在水分脅迫條件下添加外源NaCl處理能夠有效緩解了水分脅迫導(dǎo)致的氧化損傷，顯著提高了鴨茅對(duì)水分脅迫的耐受力。該結(jié)果與部分旱生植物耐旱機(jī)制一致，蔡建一等研究表明 50 mmol/L NaCl能夠顯著提高滲透脅迫下霸王SOD、CAT、POD活性，從而減輕活性氧對(duì)細(xì)胞膜的傷害，有效降低水分脅迫對(duì)植物的傷害[7]。Martíínez等對(duì)濱藜[Atriplexpatens(Litv. ) Iljin]進(jìn)行干旱處理發(fā)現(xiàn)，適量的Na+可以減輕水分脅迫造成的氧化脅迫，提高植物適應(yīng)環(huán)境的能力[23]。由此看來(lái)，Na+在適量水平時(shí)，對(duì)植物的抗逆性有重要作用。

長(zhǎng)期以來(lái)，無(wú)機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Na+被認(rèn)為是造成植物鹽害的主要因素，因此對(duì)Na+的研究主要集中在植物鹽害方面。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究關(guān)注于Na+對(duì)旱生植物的滲透調(diào)節(jié)作用。已有研究表明，Na+在荒漠植物梭梭[Haloxylonammodendron(C. A. Mey.) Bunge]的滲透調(diào)節(jié)中貢獻(xiàn)最大，是梭梭適應(yīng)干旱環(huán)境時(shí)最主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[24]。然而適量的Na+對(duì)中生植物耐旱性研究比較少，缺乏充足的證據(jù)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，水分脅迫下加入50 mmol/L NaCl可以使鴨茅葉片內(nèi)游離脯氨酸和可溶性糖含量顯著降低。這與張金林等的結(jié)果較為一致，即中生植物和多漿旱生植物并不依靠脯氨酸來(lái)調(diào)節(jié)滲透勢(shì)，Na+對(duì)滲透調(diào)節(jié)的貢獻(xiàn)要遠(yuǎn)大于K+、Ca2+和有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等[25-26]。由此可以推測(cè)，鴨茅在響應(yīng)外源Na+進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)時(shí)可能與多槳旱生植物具有相似特性[27]，通過(guò)積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)Na+，可以平衡液泡滲透勢(shì)，減少合成其他有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，維持植物生長(zhǎng)和抵御干旱脅迫。

綜上所述，50 mmol/L NaCl預(yù)處理能顯著增強(qiáng)水分脅迫下鴨茅葉片抗氧化防御系統(tǒng)，有效緩解水分脅迫導(dǎo)致的細(xì)胞氧化性損傷。外源NaCl處理顯著提高鴨茅抗旱性的原因可能與旱生植物一樣是通過(guò)富集Na+提高其滲透調(diào)節(jié)能力來(lái)發(fā)揮作用，并非促進(jìn)了植物體內(nèi)有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累。