程弘夏，付 敏，周 立，秦文英，周策凡，4，唐景峰，4*

(1.武漢華夏理工學(xué)院，湖北 武漢430223；2. 武漢大學(xué) 動物實驗中心/ABSL-III實驗室，湖北 武漢430072； 3.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院/生物醫(yī)藥研究院，湖北 武漢 430068； 4.基因診斷與腫瘤個性化治療湖北工程研究中心，湖北 武漢 430070)

0 引言

社區(qū)獲得性肺炎(CAP)在全球范圍內(nèi)影響著各個年齡人的健康.每年約有140萬兒童因該病死亡，5歲以下兒童占18%，且大部分分布在發(fā)展中國家[1-3].引起CAP的主要病原體是肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，SP)感染，其次是肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，MP)和肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae，CP)等病原體的混合感染.由于上述病原體會引起相同的疾病體征，臨床很難準確快速診斷出引起CAP感染的病原體.因此，臨床上建立準確且快速鑒別肺炎鏈球菌及其他菌種感染的檢測方法已迫在眉睫.肺炎鏈球菌，舊稱肺炎雙球菌或肺炎球菌(Pneumococci)，為革蘭氏陽性雙球菌，屬鏈球菌的一種.肺炎鏈球菌根據(jù)其莢膜特異性多糖抗原分型，目前丹麥分84型(丹麥血清研究所為被WHO認可的唯一抗血清來源)，美國分86個血清型.我國曾在20世紀80年代進行全國范圍致病菌型調(diào)查，從血、腦脊液和中耳分泌物分離的菌株以5型最多，其次為6、1、19、23、14、2、3型等，以第3型毒力最強，兒童則多為6、14、19及23型.肺炎鏈球菌可引起大葉肺炎、腦膜炎和中耳炎等23種疾病，氣候驟變時機體抵抗力降低，發(fā)病較多，冬春季多見，可能與呼吸道病毒感染流行有一定關(guān)系.目前，臨床上主要以注射肺炎疫苗來預(yù)防此病，現(xiàn)使用疫苗主要針對肺炎鏈球菌優(yōu)勢血清型而設(shè)計的.肺炎鏈球菌血清型的疫苗尚在推廣之中，如國內(nèi)7價肺炎球菌結(jié)合疫苗盡管在2008年上市但還沒有用于兒童免疫計劃，而10價和13價肺炎結(jié)合疫苗的使用情況還不清楚.有建議提出肺炎球菌疫苗的選擇應(yīng)建立在血清型分布的基礎(chǔ)上，而血清型分布又與年齡、地域等因素有關(guān).因此，準確系統(tǒng)地確定肺炎鏈球菌的血清型分布對于CAP疫苗的選擇及防治具有非常重要的意義.

臨床上對于CAP有效治療是基于快速診斷出感染病原體并給予合適的抗生素.然而近年來對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性逐年上升，特別是肺炎鏈球菌的耐藥最為嚴重，影響了治療效果.肺炎鏈球菌耐藥性主要是由編碼膜蛋白的mefA和編碼核糖體甲基化酶ermB基因引起[4,5].mefA編碼的的外排泵膜相關(guān)蛋白構(gòu)成外排泵，該外排泵主動外排進入細菌體內(nèi)的抗生素而產(chǎn)生耐藥.對14和15元環(huán)的藥物如紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素有較低的抗藥性，而ermB介導(dǎo)的MLSB表型則對大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類顯示出較強抗藥性[6,7].因此，快速鑒別檢測肺炎鏈球菌的菌種、血清型及耐藥性對臨床CAP的有效治療非常關(guān)鍵.目前，臨床上常用的診斷方法有培養(yǎng)法、平板凝集法(Plate agglutination method, PAT)、酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)等.培養(yǎng)法費時費力且陽性檢出率只有10%～30%,甚至更低.平板凝集法中莢膜腫脹實驗需基于致病菌的提取與培養(yǎng)，因此耗時長花費大，且對實驗操作者要求高[8,9].而基于肺炎球菌抗體的ELISA方法同樣面臨檢測耗時長不能同時鑒別多個血清型的問題.多重實時PCR技術(shù)(Multiplex real-time PCR, MRT-PCR)中多色熒光檢測系統(tǒng)可以在同一個反應(yīng)管中同時采集和區(qū)分6個熒光信號，在反應(yīng)管中監(jiān)控6個PCR擴增反應(yīng)，靈敏度高、特異性強，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于各種傳染病病原體的快速精準檢測.本研究建立肺炎鏈球菌的菌種鑒別、血清型分析及耐藥基因檢測的多重RT-PCR方法，并對其特異性和靈敏度進行評價.

1 材料

1.1 樣本

CAP患者痰液或咽拭子標本512份(自2008年1月至2014年7月)，武漢大學(xué)人民醫(yī)院、武漢大學(xué)中南醫(yī)院、湖北婦幼保健院采集.診斷標準：1)患者有發(fā)熱、咳嗽、膿痰、白細胞增多或減少；2)胸部X線片表現(xiàn)有片狀、葉狀肺泡高密度浸潤性病變等；3)患者有呼吸道以外的癥狀(≥65歲).

1.2 菌株

不同血清型的肺炎鏈球菌標準：1 (ATCC 12213), 2 (ATCC 11733), 3 (ATCC 6303), 4 (ATCC 6304), 5 (ATCC 6305), 6B (ATCC 6326), 7F (ATCC10351), 8 (ATCC 6308), 9V (ATCC 10368), 9N (ATCC 6309), 10A (ATCC 8334), 11A (ATCC 10343), 12F (ATCC 6312), 14 (ATCC 6314), 15B (ATCC 10354), 17F (ATCC 6317), 18C (ATCC 10356), 19A (ATCC 10357), 19F (ATCC 6319), 20 (ATCC 6320), 22F (ATCC 6322) , 23F (ATCC 6323), 33F (ATCC 10370)；耐藥菌株(ATCC 49619)；支原體標準株FH(ATCC 15531)和M129-B7(ATCC 29342)；衣原體標準株AR-39(ATCC 53592)；陰性菌株：肺炎克雷伯菌(ATCC 31488) 、金黃色釀膿葡萄球菌(ATCC 13565)、嗜肺軍團軍(ATCC 33152)、綠膿桿菌(ATCC 35096)、化膿性鏈球(ATCC 19615).購自美國菌種保藏中心.

1.3 主要試劑及儀器

SAP酶、EXO I酶、Taq酶等PCR擴增體系相關(guān)試劑，寶生物工程公司，大連；瓊脂平板，Oxoid公司，英國；痰酶，Kyokuto制藥工業(yè)公司，日本；QIAamp DNA Mini 試劑盒，QIAGEN公司，德國；引物，英駿生物技術(shù)公司，上海；TaqMan探針，生工生物股份公司，上海；TaqMan MGB探針，基康生物技術(shù)公司，上海； ABI7500熒光定量PCR儀，ABI公司，美國；P360型IMPLEN超微量分光光度計，IMPLEN公司，德國；ABI3130型基因分析儀，ABI公司，美國.

2 方法

2.1 微生物的培養(yǎng)與細菌鑒別

臨床樣本混懸于1.5 mL胸膜炎類 PPLO肉湯培養(yǎng)基內(nèi).痰液樣本用含有痰酶PPLO稀釋至1.5 mL，取5 μL接種到羊血瓊脂平板和巧克力瓊脂平板并置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱的條件下進行培養(yǎng).孵育20 h 以后，平板上菌落使用標準化方法[10]進行鑒定.

2.2 肺炎菌株DNA的提取

取4%NaOH液化處理的痰液或咽拭子0.5 mL，加入等量4%NaOH，室溫放置10 min，5000 r/min 離心20 min.棄上清，沉淀加入1 ×TE緩沖液1 mL，混勻，5000 r/min 離心20 min，重新洗滌1次.離心后的沉淀依照QIAamp DNA Mini 試劑盒說明書進行DNA提取，并用1 ×TE緩沖液稀釋至200 μL備用.標準株及空白對照均按上述方法進行處理.

2.3 引物及TaqMan探針

針對肺炎鏈球菌菌種鑒別、血清型分析及耐藥檢測設(shè)計了多組引物及探針.① 菌種鑒別：針對CAP致病的肺炎鏈球菌LytA基因、肺炎支原體P1基因和肺炎衣原體ompA基因設(shè)計特異的引物及探針，見表1.② 血清型分析：針對肺炎鏈球菌cps基因座序列，在NCBI進行Blast比對分析，設(shè)計出用于檢測肺炎鏈球菌的23種血清型的特異引物及探針，見表2.③ 耐藥性檢測：針對肺炎鏈球菌mefA和ermB基因設(shè)計多對引物及探針(表3)進行耐藥性檢測.以上靶序列均通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行BLAST(在線)和MEGA 4.0(離線)比對分析，分析后的最佳靶序列進一步通過Beacon Designer 7.0軟件進行引物及探針設(shè)計.所有探針3'端均由BHQ或MGB標記，5'端由不同的熒光染料標記.

表1 引物和TaqMan探針用于肺炎鏈球菌、肺炎支原體、肺炎衣原體檢測及擴增序列Tab. 1 Primers and probes used for amplification and detection of S. pneumoniae, M. pneumoniae and C. pneumoniae

表2 肺炎鏈球菌血清型分析的引物與TaqMan探針序列Tab. 2 Primers and probes used for amplification and detection of serotypes of S. pneumoniae.

續(xù)表2

PCR組血清型名稱序列 (5'→3')標記GenBank編號長度/bp619F正向引物GGCTTTATTCCATGGGATGATG22619F反向引物GCAATGCAACGTATCACAGTATTGHEX-BHQCR931678.124619F探針TCGCTGTCCCTCGTGAAGCATACGAC26620正向引物TGGAGAAGGGTAGTATAGGTGTTGC25620反向引物TGGATGGACATACATCGTTGAATCROX-BHQCR931679.124620探針CCGATTTATGCTAATGGAACAATATGGAGGAA32722F正向引物GCGCGAATCAAGAGCACTTTA21722F反向引物ACCCGCAATGCTAAGTAGGTATTAGFAM-BHQCR931682.125722F探針TATCCAAGTCGGATCATAGTTGGAACAGATT31723F正向引物CCGATAAAGCTAATAAATAATCTCAGTGA29723F反向引物GCGTCATATTTTCTGCTGACATATAGHEX-BHQCR931685.126723F探針TTGCTGTAGAGGGAATTGGCTTTTCATATGG31733F正向引物ATGGGATAATAAATCTGGAACTGG24733F反向引物GTTCAATGGTTCTAAGACCGTCTGROX-BHQCR931702.124733F探針CAGCAACTATACGCTTTGATGATTATAAGGCTG33

表3 肺炎鏈球菌耐藥性擴增和檢測引物和MGB探針序列Tab. 3 Primers and probes used for amplification and detection of the resistance of S. pneumoniae

2.4 單重RT-PCR對肺炎鏈球菌菌種的鑒別檢測

將肺炎鏈球菌、肺炎支原體及肺炎衣原體特異性基因片段擴增，克隆至PTA-2載體，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5ɑ.重組質(zhì)粒用QIAamp試劑盒純化保存至-80 ℃，濃度采取 UV-vis測定A260/A280值.根據(jù)測定的濃度及目的片段的大小，計算重組質(zhì)粒拷貝數(shù).重組質(zhì)粒分別經(jīng)10倍梯度稀釋后用于RT-PCR檢測.ddH2O為陰性對照，標準株DNA為陽性對照.單重RT-PCR反應(yīng)體系包括：樣本或標準株DNA 50 μL，1.0 × PCR buffer，3.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，2.5 U Hot Start Taq DNA聚合酶.三個PCR擴增管中肺炎鏈球菌、肺炎衣原體、肺炎支原體PCR引物終濃度分別為0.30、0.35、0.25 μmol/L，各探針終濃度為0.20 μmol/L.最終用ddH2O稀釋至50 μL.反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，隨后94 ℃ 15 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共40個循環(huán).擴增曲線結(jié)果分析：Ct值≤35為陽性擴增.Ct值>35的為陰性擴增.無擴增曲線的為試驗失敗，需重新提取樣本或菌種進行擴增.同時，采用測序法和培養(yǎng)法作對比實驗.

2.5 多重RT-PCR對肺炎鏈球菌菌種的鑒別檢測

依據(jù)2.4制備和稀釋重組質(zhì)粒，以ddH2O為陰性對照，標準株DNA為陽性對照.多重RT-PCR反應(yīng)體系包括：樣本或標準株DNA 1 μL，1.0 × PCR buffer，3.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，2.5 U Hot Start Taq DNA聚合酶.肺炎鏈球菌、肺炎衣原體和肺炎支原體PCR引物終濃度分別為0.35、0.45、0.35 μmol/L，各探針終濃度為0.25 μmol/L.最終用ddH2O稀釋至50 μL.反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 min，隨后94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72℃ 35 s共40個循環(huán).擴增曲線結(jié)果分析：Ct值≤35為陽性擴增.Ct值>35的為陰性擴增.無擴增曲線的為試驗失敗，需重新提取樣本或菌種進行擴增.同時，采用測序法和培養(yǎng)法作對比實驗.

2.6 多重RT-PCR對肺炎鏈球菌血清型的鑒別檢測

基于cps基因座序列信息，鑒別肺炎鏈球菌血清型.根據(jù)序列的信息，23種與致病有關(guān)的肺炎鏈球菌血清型被分為7組：①血清型1-5；②血清型6B，7F；③血清型8，9N/V，10A；④血清型11A，12F，14；⑤血清型15B，17F，18C；⑥血清型19A，19F，20；⑦血清型22F，23F，33F.將上述分組，在熒光定量擴增板上進行分組，采用多重RT-PCR對肺炎鏈球菌血清型進行分析.反應(yīng)體系50 μL包括：樣本或標準株DNA 1 μL、1.0 × PCR buffer，3.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，2.5 U HotStart Taq DNA聚合酶，引物的最終濃度分別為0.15 μmol/L 和0.4 μmol/L，探針濃度為0.25 μmol/L.PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 min，隨后94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s共40個循環(huán).擴增曲線結(jié)果分析：Ct值≤35為陽性擴增.Ct值>35的為陰性擴增.無擴增曲線的為試驗失敗，需重新提取樣本或菌種進行擴增.采用莢膜腫脹試作為對比實驗.

2.7 多重RT-PCR對肺炎鏈球菌耐藥基因的檢測

選用臨床樣本中的耐藥肺炎鏈球菌在37 ℃培養(yǎng)，采用瓊脂稀釋法測定其紅霉素、阿奇霉素、萬古霉素、克拉霉素、交沙霉素、泰利霉素、青霉素、左氧氟沙星的最小抑菌濃度，用SPSS軟件對試驗結(jié)果進行分析.

設(shè)計針對耐藥基因的特異TaqMan探針，采用多重RT-PCR法對肺炎鏈球菌耐藥基因進行檢測.50 μL反應(yīng)體系包括：1.0 × PCR buffer，4.5 mmol/L MgCl2，0.3 mmol/L dNTPs，2.5U HotStart Taq DNA聚合酶.0.4 μmol/L肺炎鏈球菌ermB基因特異性引物，0.45 μmol/L 的肺炎鏈球菌mefA特異性引物，0.35 μmol/L 的肺炎鏈球菌ermBTaqMan探針，0.3 μmol/L 的肺炎鏈球菌mefATaqMan探針，和1μL肺炎鏈球菌DNA.PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 min，隨后94 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s共40個循環(huán).擴增曲線結(jié)果分析：Ct值≤35為陽性擴增.Ct值>35的為陰性擴增.無擴增曲線的為試驗失敗，需重新提取樣本或菌種進行擴增.

3 結(jié)果

3.1 多重RT-PCR特異性及靈敏度

研究結(jié)果顯示，在對3種致病菌檢測中，多重RT-PCR特異性好，5種陰性菌株均無擴增.與單重RT-PCR檢測結(jié)果一致性好，見圖1.

圖1 多重RT-PCR致病菌拷貝對數(shù)(縱坐標)和單重RT-PCR致病菌拷貝對數(shù)(橫坐標)檢測臨床陽性樣本相關(guān)性Fig. 1 Correlation between multiplex FQ-PCR and simplex FQ-PCR for detecting the three pathogens positive clinical specimens

(a) 32例臨床肺炎衣原體(CP)陽性樣本DNA滴度性； (b) 83例臨床肺炎支原體(MP)陽性樣本DNA滴度；(c) 189個肺炎鏈球菌(SP)臨床陽性樣本DNA的滴度；(d) 肺炎鏈球菌兩種測定方法相關(guān)性，r=0.990；(e)肺炎支原體P兩種測定方法相關(guān)性，r=0.988 ；(f) ；肺炎衣原體兩種測定方法相關(guān)性，r=0.987

3.2 多重RT-PCR對肺炎鏈球菌菌種鑒別

對512個臨床樣本分別采用測序、培養(yǎng)和多重RT-PCR方法分析，采用SPSS(17.0)進行的統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示多重RT-PCR與測序法有很好的一致性，統(tǒng)計學(xué)比較無差異(P> 0.05)，與細菌培養(yǎng)比較有顯著差異(P< 0.01)，測序和多重RT-PCR較培養(yǎng)法具有更好的靈敏度.

304個陽性臨床樣本經(jīng)過多重RT-PCR檢測，45例樣本拷貝數(shù)在102～103copies/mL，59例樣本拷貝數(shù)在103～104copies/mL，122例樣本拷貝數(shù)在104～106copies/mL，62例樣本拷貝數(shù)在106～107copies/mL，16例樣本拷貝數(shù)在超過107copies/mL.304例臨床陽性樣本其中189例(62.2%)為肺炎鏈球菌陽性，83例(27.3%)為肺炎支原體陽性，32例(10.5%)為肺炎衣原體陽性，具體見表4.

表4 測序法、培養(yǎng)法與多重RT-PCR對臨床樣本測定結(jié)果Tab. 4 Comparison of multiplex RT-PCR with sequencing and culture for detecting the three pathogens in clinical specimens

3.3 多重RT-PCR對肺炎鏈球菌菌種血清型分析

通過多重FQ-PCR方法對189 例肺炎鏈球菌陽性樣本血清型分析，結(jié)果顯示：19 (19.58%, 37/189)，23 (15.87%, 30/189)，6 (13.23%, 25/189)，14 (6.3%, 12/189)，其他血清型 (22.75%, 43/189)，其他血清型 (22.22%, 42/189).具體見表5.所得結(jié)果與莢膜腫脹試驗結(jié)果一致，從肺炎鏈球菌血清型分析可以看出優(yōu)勢血清型為6，14，19和23.

表5 多重RT-PCR對陽性臨床樣本肺炎鏈球菌血清型研究結(jié)果Tab. 5 The result of S. pneumoniae serotypes in the positive samples by multiplex RT-PCR

3.4 多重RT-PCR對肺炎鏈球菌菌種耐藥性分析

通過多重FQ-PCR方法對189 例肺炎鏈球菌陽性樣本的耐藥性檢測分析顯示：115例(60.85%)耐藥性與基因ermB有關(guān)，56(29.63%)例耐藥性與基因mefA有關(guān)，15例(7.94%)耐藥性與上述2種基因均有關(guān).根據(jù)MIC試驗分析113例(59.79%)耐藥性與基因ermB有關(guān)，56(29.63%)例耐藥性與基因mefA有關(guān)，14例(7.41%)耐藥性與上述2種基因均有關(guān).測序結(jié)果顯示115例(60.85%)耐藥性與基因ermB有關(guān)，56(29.63%)例耐藥性與基因mefA有關(guān)，14例(7.41%)耐藥性與上述2種基因均有關(guān)，具體見表6.

表6 肺炎鏈球菌陽性樣本耐藥性檢測結(jié)果Tab. 6 The results of resistance in S. pneumoniae positive samples

4 討論

肺炎鏈球菌是CAP疾病的主要致病菌，其不同血清型分布隨地域及患者年齡不同而不同，因此WHO推薦了解血清型分布是給藥合適疫苗防治該疾病的關(guān)鍵.多重RT-PCR方法對臨床304例疑似陽性樣本檢測分析結(jié)果顯示,CAP主要致病菌的結(jié)果與日本和美國相似[11].同時肺炎支原體是CAP致病的又一常見病原體，本實驗結(jié)果的陽性率高于美國學(xué)者的研究結(jié)果[12].多重RT-PCR方法對肺炎鏈球菌血清型分析結(jié)果與中國的血清型分析一致[8,9].多重RT-PCR對肺炎鏈球菌耐藥基因分析結(jié)果與日本的研究數(shù)據(jù)相似，但耐藥性與ermB基因相關(guān)的比例高于美國[13,14].

5 結(jié)論

多重RT-PCR方法可在一次PCR擴增檢測中，快速區(qū)分引起社區(qū)獲得性肺炎的肺炎鏈球菌、肺炎支原體和肺炎衣原體等3種致病菌，快速檢測患者感染肺炎鏈球菌血清型和耐藥性.該方法特異性好、靈敏度高及方便快速.多重RT-PCR方法可用于肺炎鏈球菌菌種鑒別、血清型分型及耐藥性分析，檢測準確，快速方便，適合臨床CAP的快速診斷，具有很高的應(yīng)用推廣意義，對提高CAP的病原體和流行病學(xué)研究及指導(dǎo)臨床用藥具有很好的推動作用.