柯丹霞，李祥永，彭昆鵬，韓雅彭

(信陽師范學(xué)院 a.生命科學(xué)學(xué)院; b.大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院，河南 信陽 464000)

0 引言

Rop(Rho GTPase of plant)是植物特有的一類小G蛋白，參與調(diào)控植物體內(nèi)多種生理過程，包括花粉管的伸長、根毛的發(fā)育、防御脅迫反應(yīng)、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[1-5].目前, 許多植物如擬南芥、水稻、楊樹等的Rop基因已被克隆.近年的證據(jù)表明，Rop在共生固氮的早期信號途徑中發(fā)揮重要功能[6-8]，對模式豆科植物百脈根(Lotusjaponicus)Rop基因的研究將有助于深入揭示此類基因在結(jié)瘤信號途徑中的調(diào)控機制[9].啟動子(Promoter)作為基因的“開關(guān)”，控制基因表達(dá)的起始和程度.克隆基因啟動子并鑒定其特征序列是挖掘基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的關(guān)鍵.有關(guān)Rop家族基因啟動子的克隆、序列特征分析和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究報道日益增多.劉偉等[10]研究發(fā)現(xiàn)，蒺藜苜蓿Rop5基因在植株根系的各個部位均有表達(dá).根瘤菌侵染后，其啟動子轉(zhuǎn)錄活力明顯升高.筆者前期在百脈根中克隆了Rop6基因的啟動子，并對其表達(dá)特征進(jìn)行了分析[11].石佰麗[12]對毛果楊Rop家族基因的啟動子研究發(fā)現(xiàn),受鹽脅迫和外源激素誘導(dǎo)的基因，其啟動子序列中也存在相應(yīng)的響應(yīng)元件.黃亞成[13]克隆了橡膠樹的5個Rop基因啟動子，軟件分析發(fā)現(xiàn)5個啟動子序列均具有多種調(diào)控元件, 部分預(yù)測的順式作用元件通過實驗手段得到了初步證實.李煜[14]發(fā)現(xiàn)對楊樹Rop家族基因的啟動子中包含大量與脅迫及激素響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件.

在前期工作中，克隆了百脈根的Rop家族基因Rac1，過表達(dá)Rac1的轉(zhuǎn)基因百脈根結(jié)瘤數(shù)目較空白對照明顯增加.推測Rac1基因可能參與調(diào)控早期結(jié)瘤信號途徑[15].盡管Rac1基因的生物學(xué)功能已得到初步闡明，但有關(guān)該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制尚不清楚.有關(guān)百脈根Rac1基因啟動子的預(yù)測及其重要調(diào)控元件的相關(guān)研究在國內(nèi)外未見報道.鑒于此，本研究在前期工作基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)方法預(yù)測Rac1基因啟動子，并對其含有的順式作用元件進(jìn)行鑒定及統(tǒng)計分析.同時克隆Rac1基因啟動子片段，并構(gòu)建GUS報告基因融合的植物雙元表達(dá)載體，對其功能性調(diào)控元件進(jìn)行挖掘, 以揭示Rac1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制.

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

百脈根MG-20、發(fā)根農(nóng)桿菌菌株LBA1334、植物雙元表達(dá)載體p1391Z由本實驗室保存；百脈根毛根轉(zhuǎn)化所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Phytotech公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒，Takara公司產(chǎn)品；引物和測序由南京金斯瑞生物科技有限公司合成.

1.2 方法

1.2.1Rac1基因啟動子的生物信息學(xué)分析

利用啟動子在線分析軟件Promoter 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)、Network Promoter Prediction(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)、Promoter SCAN(http://www- bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)對Rac1基因的啟動子進(jìn)行預(yù)測.

利用http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=cpgfinder&group=programs&subgroup=promoter、http://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/對啟動子的CpG島進(jìn)行預(yù)測.

利用在線軟件http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=tssp&group=programs&subgroup=promoter查找啟動子含有的重要順式作用元件.

1.2.2 基因組DNA的提取

經(jīng)表面滅菌的百脈根種子置于無菌的濕潤濾紙上， 22 ℃暗培養(yǎng)待其發(fā)芽，1周后收集幼嫩根部組織，迅速放入加有液氮的研缽內(nèi)充分研磨.采用CTAB法提取基因組DNA.

1.2.3Rac1啟動子的克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

依據(jù)Rac1基因cDNA序列(GenBank登錄號：Z73961.1)，獲得位于該基因翻譯起始位點(ATG)上游5'-啟動子區(qū)的3 kb序列.設(shè)計引物，PCR擴增ATG上游1.8 kb的目的片段.上游引物為F-Rac1-Pro(5'-AACTGCAGAGCTGCCTCTGCATCAATTTG -3')，下游引物為R-Rac1-Pro(5'-GGAATTCGTTTTGAGCTGAGTGGAAAAG -3')，以提取的基因組DNA為模板擴增.PCR擴增產(chǎn)物回收純化后連接T載體測序驗證.

引入PstⅠ /EcoRⅠ 位點將測序正確的目的片段插入載體p1391Z中，實現(xiàn)Rac1基因啟動子和GUS基因的融合.引物下劃線處為酶切位點序列PstⅠ和EcoRⅠ，重組質(zhì)粒命名為p1391Z-Rac1Pro.

1.2.4 百脈根的毛根轉(zhuǎn)化

百脈根毛根轉(zhuǎn)化具體方法參照參考文獻(xiàn)[16].種子經(jīng)表面滅菌后，22 ℃暗培養(yǎng)獲取外植體.農(nóng)桿菌侵染外植體，經(jīng)共培養(yǎng)后待毛根從下胚軸長出.剪取0.5 cm長的根尖放入GUS染液中鑒定毛根，留下顯藍(lán)的陽性毛根，切掉不顯藍(lán)的陰性毛根.

1.2.5 組織化學(xué)染色

獲得的陽性轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)煉苗和移栽后，接種根瘤菌MAFF303099.取接種前和接種后7 d毛根，GUS染液染色，奧林巴斯體視顯微鏡觀察Rac1Pro:GUS在根部的表達(dá)情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 Rac1啟動子的預(yù)測

通過檢索GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得Rac1基因翻譯起始位點(ATG)上游5'非編碼區(qū)的3 kb序列.采用Promoter 2.0、Network Promoter Prediction、Promoter SCAN等3種軟件預(yù)測分析，得出潛在的啟動子結(jié)構(gòu)(表1).

表1 Rac1啟動子預(yù)測結(jié)果Tab. 1 The prediction results of Rac1 promoter

3種不同的在線軟件預(yù)測的Rac1基因啟動子區(qū)域存在一定的差異.啟動子的預(yù)測算法有多種，不同的算法有不同的預(yù)測結(jié)果，須綜合考慮.

2.2 Rac1啟動子含有的順式作用元件分析

利用生物信息學(xué)工具查找Rac1基因啟動子含有的重要順式作用元件.結(jié)果表明，該啟動子含有的順式作用元件共248個.表2列出了除未命名和無功能的調(diào)控元件外的所有可能的順式作用元件.其中有95個與轉(zhuǎn)錄必需的RNA聚合酶結(jié)合的TATA-box，64個調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄效率的CAAT-box.此外，在Rac1啟動子中，還含有光反應(yīng)、防御與脅迫反應(yīng)、激素反應(yīng)如乙烯、生長素、赤霉素應(yīng)答元件以及與生長代謝相關(guān)的厭氧誘導(dǎo)、胚乳表達(dá)、分生組織表達(dá)、晝夜節(jié)律控制等調(diào)控元件(表2).

表2 Rac1啟動子含有的重要順式作用元件Tab. 2 The putative important cis-regulatory elements identified in Rac1 promoter

一般來說，真核生物基因啟動子的A和T堿基含量高于C和G堿基含量.Rac1基因啟動子含有的堿基A、T、C、G百分比分別為31.3%、34.4%、16.8%、17.5%，A和T堿基總和與C和G堿基總和的比值為1.92.綜上，Rac1基因啟動子具有真核生物啟動子類似的堿基組成特征和重要調(diào)控元件.

2.3 Rac1啟動子的克隆及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以提取的幼嫩根組織的基因組DNA為模板，通過PCR擴增ATG上游1.8 kb的啟動子片段.PCR擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期啟動子片段長度(1 836 bp)一致(圖1).目的片段回收純化后連接T載體送去公司測序，確保擴增產(chǎn)物的序列與已發(fā)布的啟動子序列完全相同.引入PstⅠ /EcoRⅠ 酶切位點將目的片段插入植物雙元表達(dá)載體p1391Z中，構(gòu)建Rac1基因啟動子和GUS基因融合的重組質(zhì)粒p1391Z-Rac1Pro.雙酶切瓊脂糖電泳膠圖顯示載體片段約為11 kb，目的片段約為1.8 kb，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖2).

圖1 Rac1基因啟動子片段的擴增Fig. 1 The promoter fragment amplification of Rac1 gene

注：M為DL2000 DNA Marker; 1為目的片段的擴增

圖2 重組質(zhì)粒p1391Z-Rac1Pro的酶切鑒定Fig. 2 Digestion and identification of recombinant plasmids p1391Z-Rac1Pro

注：M為1 kb DNA ladder; 1為重組質(zhì)粒p1391Z-Rac1Pro的雙酶切

2.4 Rac1基因啟動子的表達(dá)分析

毛根轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)GUS染色后，陽性毛根呈現(xiàn)藍(lán)色，陰性毛根不變色(圖3).

圖3 含有p1391Z-Rac1Pro重組質(zhì)粒的百脈根毛根鑒定Fig. 3 Identification of hairy roots of Lotus japonicus transformed with p1391Z-Rac1 Pro

注：A. GUS染色前的百脈根毛根; B. GUS染色后的百脈根毛根，箭頭所指即為顯藍(lán)的陽性毛根

通過體視鏡觀察陽性毛狀根中GUS的表達(dá)情況，以此分析啟動子在根中的表達(dá)情況.結(jié)果顯示，在未接種根瘤菌的陽性毛根中，GUS主要在根的維管束中表達(dá)，在根毛中幾乎沒有表達(dá)(圖4 A).在接種根瘤菌7 d的陽性毛根中，GUS在根的維管束中表達(dá)量上升，在根毛中的表達(dá)尤為明顯(圖4 B)，在主根根尖、根瘤原基皮層中也觀察到了GUS的表達(dá)(圖4 C、圖4D).

圖4 組織化學(xué)染色檢測Rac1基因的表達(dá)部位Fig. 4 Expression of Rac1 gene by histochemical staining

注：A. 未接種根瘤菌的根毛; B. 接種根瘤菌的根毛; C. 箭頭所指為顯藍(lán)的毛根根尖; D. 箭頭所指為顯藍(lán)的根瘤原基皮層

結(jié)果表明,Rac1基因受根瘤菌誘導(dǎo)表達(dá)增強，這一結(jié)論與前期Real-time PCR結(jié)果[15]相吻合.同時Rac1基因在根尖、皮層等分生區(qū)表達(dá)，也預(yù)示著Rac1基因參與調(diào)控根瘤的生長發(fā)育.

3 結(jié)論

基因啟動子是控制基因表達(dá)開啟的核心，克隆基因啟動子序列并對其中的特征信號進(jìn)行分析是了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)及其調(diào)控機制的關(guān)鍵[17，18].百脈根Rac1基因的啟動子具有類似真核生物啟動子的堿基組成特征以及重要的順式作用元件，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控核心元件TATA-box和CAAT-box，表明上述元件在調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮著重要作用.此外，在Rac1基因啟動子中，還發(fā)現(xiàn)多種與光照、防御與脅迫、激素以及生長代謝等非生物環(huán)境信號應(yīng)答相關(guān)的調(diào)控元件，表明Rac1的表達(dá)可能還與上述內(nèi)在信號和環(huán)境因子的狀況密切相關(guān).組織化學(xué)染色法發(fā)現(xiàn)Gus基因在接種根瘤菌的毛根維管束和根毛中表達(dá)量明顯上升，說明Rac1基因受根瘤菌誘導(dǎo)表達(dá)增強，在根尖、皮層等分生區(qū)檢測到Gus的表達(dá)，表明Rac1基因可能參與調(diào)控根瘤的生長發(fā)育.

本研究為闡明百脈根小G蛋白Rac1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ).下一步將構(gòu)建Rac1基因啟動子不同長度片段驅(qū)動報告基因Gus表達(dá)的系列雙元表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化百脈根獲得陽性毛根，進(jìn)而通過不同啟動子長度片段表達(dá)特征的分析，由此鑒定Rac1基因啟動子中含有的重要調(diào)控元件及其進(jìn)一步精細(xì)定位.