陳 林, 肖國生, 顧 欣, 曲留柱, 李 迪, 劉美麗

(重慶市生物與食品基礎(chǔ)實驗教學(xué)中心/渝東北特色生物資源開發(fā)利用工程中心/重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,重慶 404100)

紅薯含有豐富的淀粉和膳食纖維,在我國主要用作輔助食品或動物飼料,其深加工產(chǎn)品相對較少,因而其功能性并未完全開發(fā)[1]。紅薯酒又稱地瓜酒、番薯酒,其保健功效在20世紀(jì)80年代得到一些學(xué)者的實驗證實[2]。紅薯酒在農(nóng)村地區(qū)較為常見,其口味甘甜、質(zhì)地清冽,但酒度高、易醉。糯米富含淀粉,其中糯淀粉米中支鏈淀粉占98% ～99%,具有易吸水糊化、易糖化的特點,因此也常被用來釀酒[3-4]。由于淀粉酶對支鏈淀粉的分解不完全,易形成糊精和低聚糖,增加黏稠度,使得酒柔和不刺激。目前,關(guān)于紅薯與糯米結(jié)合制酒,國內(nèi)外鮮有報道,本研究以紅薯和糯米為原料進(jìn)行混合發(fā)酵,結(jié)合兩者特點制備一種酒精度低、口味豐富,且具有抗氧化活性的米酒產(chǎn)品。測定不同環(huán)境、不同貯存階段紅薯糯米酒各成分變化以及抗氧化活性,獲得適宜貯存條件,以期為紅薯糯米酒的工業(yè)化生產(chǎn)提供工藝參數(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅薯,產(chǎn)自重慶萬州;糯米、白砂糖,均購于重慶萬州永輝超市;酵母,購于北京安琪酵母股份有限公司;糖化酶,購于諾維信生物技術(shù)有限公司;果膠酶,購于上海如吉生物科技有限公司;蘆丁、沒食子酸、Folin試劑,購于廣州市齊云生物技術(shù)有限公司;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS(2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸),購于今品化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司;甲醇(標(biāo)準(zhǔn)品)、異戊醇(標(biāo)準(zhǔn)品),購于北京勝達(dá)惠友科貿(mào)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent Technology 7890B型氣相色譜儀,安捷倫科技有限公司;HH.BLL.600-S型恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;PHB-10型酸度計,上海虹益儀器有限公司;YRE200A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鞏義市予華儀器有限公司;日本愛拓PAL-1型可溶性固形物測定儀,北京陽光億事達(dá)貿(mào)易有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅薯糯米酒生產(chǎn)工藝流程

紅薯糯米酒生產(chǎn)工藝見圖1。

圖1 紅薯糯米酒生產(chǎn)工藝Fig.1 Manufacturing flowchart of sweet potato glutinous rice liquor

操作要點：紅薯和糯米分別蒸煮后,按照質(zhì)量比為2∶3拌勻;拌料(g)與無菌水(mL)以 1∶2比例混合,常溫依次加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的糖化酶、乳酸菌、酵母菌,混合均勻后,在30℃的恒溫箱中發(fā)酵7 d。為增進(jìn)紅薯糯米酒的風(fēng)味和質(zhì)量,將發(fā)酵獲得的酒液過濾后加入0.5%活性炭,處理24 h,過濾后貯藏發(fā)酵7 d。

為研究紅薯糯米酒貯存階段在不同條件下甲醇和異戊醇含量差異,本實驗設(shè)計5種貯存方法,如表1。

表1 紅薯糯米酒貯存方法Tab.1 Post-harvest storage method of sweet potato glutinous rice liquor

1.3.2 紅薯糯米酒感官評定方法

感官評分主要分為外觀、香氣、口感和整體感覺,總分為100分。各指標(biāo)分別評分,取各指標(biāo)和為總分。評分標(biāo)準(zhǔn)如表2。

表2 紅薯糯米酒感官評定標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Sensory evaluation criteria of sweet potato glutinous rice liquor

1.3.3 可溶性固形物測定

采用手持折光儀測定樣品可溶性固形物(SSC)含量。每種測3組平行,獲得平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.4 紅薯糯米酒酒精度測定

采用酒精比重計法。量取100 mL紅薯糯米酒上清液,通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾出酒樣中的酒精,收集后蒸餾水定容至100 mL,用酒精度計測定酒精度。每種測3組平行,獲得平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.5 維生素C測定

采用2,6-二氯酚靛酚鈉鹽標(biāo)定法。量取酒樣10 mL,離心后取上清液,用蒸餾水定溶至10 mL。用標(biāo)定的0.26 g/L 2,6-二氯酚靛酚鈉鹽溶液滴定至樣品呈微弱的玫瑰色,并持續(xù)5 s,以顏色不褪為終點,記錄2,6-二氯酚靛酚鈉鹽溶液消耗量。以10 mL經(jīng)10%鹽酸酸化的蒸餾水做空白對照,每種測3組平行,獲得平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.6 總酯測定

采用中和滴定(指示劑)測定方法[5]。取酒樣10 mL與30 mL蒸餾水混勻。加入酚酞指示劑1～2滴,用0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈微紅色,記錄消耗量,計算酒樣中總酸的含量;準(zhǔn)確加入0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液15 mL,在沸水浴中回流加熱30 min,進(jìn)行皂化,冷卻后加入0.1 mol/L硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液15 mL,用0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至溶液呈微紅色,計算酒樣中總酯含量,同時做空白對照。每種測3組平行,獲得平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.7 黃酮測定

采用分光光度計法測定紅薯糯米酒黃酮含量[6]。 分別量取 0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL 0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液與2 mL甲醇、2.5 mL 2%三氯化鋁-甲醇溶液混勻,室溫反應(yīng)10 min,于415 nm處測定吸光度。根據(jù)反應(yīng)液中蘆丁的質(zhì)量濃度(mg/mL)與吸光度A415nm制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(式(1))。

樣品總黃酮含量測定：取0.5 mL酒樣代替蘆丁,測定吸光度。每種測3組平行,獲得平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.8 總酚測定

采用Folin酚法測定紅薯糯米酒總酚含量[7]。取8個 10.0 mL容量瓶,依次加入 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 的 500 μg/mL 沒食子酸溶液,然后依次加入1.5 mL 20%碳酸鈉緩沖液和0.5 mL Folin顯色劑,蒸餾水定容。在室溫下放置2 h,于760 nm處測定吸光度。線性回歸方程見式(2)。

式(2)中,x為沒食子酸溶液質(zhì)量濃度,μg/mL;y為A760nm。取樣品2.0 mL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟反應(yīng)后,測定吸光度,將所得結(jié)果單位換算為單位體積酒樣中所含總酚相當(dāng)于沒食子酸的質(zhì)量,mg/mL。每種測3組平行,獲得平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.9 紅薯糯米酒抗氧化活性測定

1)DPPH·清除率的測定。按照參考文獻(xiàn)[8]測定DPPH·,并進(jìn)行改進(jìn)。準(zhǔn)確量取3.9 mL 25.6 mg/L的DPPH·溶液,加入70%的乙醇0.1 mL,混勻,在517 nm波長處測吸光度值(Ac)。將各待測樣品配成0.75、1.50、3.00、6.00、12.00 μg/mL 溶液后,分別量取0.1 mL樣品溶液與3.9 mL DPPH·溶液均勻混合,避光反應(yīng)30 min后于517 nm處測定吸光度(Ai)。以70%乙醇作對照,加入同體積樣品溶液并測定吸光度(Aj)。每種測3組平行,獲得平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差,見式(3)。

2)ABTS+清除能力的測定。參考文獻(xiàn)[9]測定ABTS+,并改進(jìn)。取7.0 mmol/L的ABTS+溶液5.0 mL,加入88.0μL 140.0 mmol/L的過硫酸鉀,室溫下置于暗處反應(yīng)12～16 h,形成ABTS+自由基儲備液。在734 nm處,用70%乙醇將儲備液稀釋至吸光度為0.70±0.02備用。準(zhǔn)確量取0.1 mL樣品溶液,加入3.9 mL ABTS+溶液,混勻,在室溫下反應(yīng)6 min后于734 nm測定吸光度AE。同時吸取3.9 mL ABTS+溶液,加入0.1 mL體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液于734 nm處測定吸光度AB。每種測3組平行,獲得平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差見式(4)。

3)總還原能力測定。樣品的抗氧化能力體現(xiàn)在能使鐵氰化鉀的三價鐵還原成二價鐵(亞鐵氰化鉀),二價鐵(亞鐵氰化鉀)進(jìn)一步再和三氯化鐵反應(yīng)生成在700 nm處有最大吸光度的普魯士藍(lán)[10],因此測定700 nm處吸光度的高低可以間接反映抗氧化劑的還原能力大小[11-12]。吸光度越大,還原能力越強。

1.3.10 甲醇和異戊醇測定

紅薯糯米酒中的甲醇主要由紅薯中果膠在甲酯酶作用下水解和甘氨酸轉(zhuǎn)化而成,雜醇油以異戊醇為代表,主要由蛋白質(zhì)和糖類代謝物轉(zhuǎn)化形成。本實驗采用氣相色譜法測定紅薯糯米酒貯存7 d后甲醇和異戊醇含量,每種測3組平行,獲得平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差[13-14]。

氣相色譜條件：色譜柱為Agilent cp97753 cp-Wax 57cb(50 m×0.32 mm×0.2μm);升溫程序35流比40∶1;進(jìn)樣口溫度180℃;檢測器溫度250℃;載氣N2(純度99.999%)。

1.3.11 甲醇和異戊醇混標(biāo)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取甲醇、異戊醇各500 mg及400 mg乙酸乙酯,以少量水洗入50 mL容量瓶中,并加水稀釋至刻度,混勻。準(zhǔn)確吸取混標(biāo)溶液1.0 mL至10 mL容量瓶中,用10%無甲醇的乙醇溶液定溶至刻度,混勻;準(zhǔn)確吸取混標(biāo)溶液 0.1、0.3、0.5、0.7 mL于10 mL容量瓶中,用10%無甲醇的乙醇溶液定容至刻度,混勻后與試樣分別上機(jī)測定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正曲線計算出試樣的雜醇油含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中可溶性固形物、p H值及酒精度變化

圖1為紅薯糯米酒發(fā)酵過程中可溶性固形物、pH值及酒精度變化曲線。從圖1可以看到,發(fā)酵第3天可溶性固形物、pH值及酒精度均有明顯變化,由此推斷第3天紅薯糯米處于酒釀發(fā)酵的關(guān)鍵時刻。酵母菌經(jīng)過大量繁殖后在糖化酶的幫助下開始分解消耗紅薯和糯米中的淀粉,此時酵母菌處于繁殖能力最強的對數(shù)生長期,酒精度不斷提高最后保持在22°左右,此時pH值也穩(wěn)定在3.4左右。

2.2 不同貯存條件下紅薯糯米酒各成分差異以及感官評價

紅薯糯米酒經(jīng)過7 d發(fā)酵后進(jìn)行7 d后熟,不同貯存條件下成分和雜醇油變化如表3。從表3可以看到,5種不同貯存條件下貯存7 d的樣品,pH值逐漸穩(wěn)定在3.53左右,可溶性固形物、總酯、總酚含量變化不大,酒精度、黃酮、維生素C受溫度及果膠酶含量的變化影響,差異明顯。通過感官評定發(fā)現(xiàn),25℃貯藏的紅薯糯米酒色澤和口感較差,而低溫貯藏下總酯較高的紅薯糯米酒口感比較好。

圖1 7 d發(fā)酵紅薯糯米酒可溶性固形物、酒精度及pH值的變化Fig.1 Change of soluble solids contents,alcohol contents and pH in sweet potato glutinous rice liquor during 7 days fermentation

通過氣相色譜分析不同貯存條件下甲醇、異戊醇含量發(fā)現(xiàn),貯存溫度不同對甲醇、異戊醇生成影響比較大。25℃貯存下甲醇含量明顯高于4℃,異戊醇相反;但添加果膠酶后異戊醇含量明顯降低,兩種醇類隨果膠酶添加量的增大而逐漸降低。感官評價結(jié)果顯示,4℃不加果膠酶口感最好,但是由于兩種醇類含量較高,而添加果膠酶能明顯降低醇類含量,添加2%果膠酶得到的貯存酒樣口感得到提升。綜合評價：4℃,添加2%果膠酶進(jìn)行酒樣貯存效果好。

2.3 不同貯存條件下紅薯糯米酒總還原能力和抗氧化性分析

清除DPPH·和ABTS+能力是目前衡量產(chǎn)品抗氧化性常用指標(biāo)。表4為不同貯存條件下紅薯糯米酒總還原能力和抗氧化能力情況。從表4結(jié)果可知,不同貯存條件下紅薯糯米酒對自由基的清除能力不同,而且隨著果膠酶添加量的增加,清除能力增加;酒樣總還原能力變化不大,但在果膠酶添加量為2.0%條件下,還原能力變化明顯。由此推斷果膠酶能提高酒樣的總還原能力和抗氧化能力,因此選擇4℃,添加2%果膠酶條件下進(jìn)行紅薯糯米酒貯存。

表3 紅薯糯米酒貯存后成分差異及感官評分Tab.3 Effect of different post-harvest storage conditions on components and sensory evaluation values of sweet potato glutinous rice liquor

表4 紅薯糯米酒貯存后總還原能力和抗氧化性分析Tab.4 Antioxidant activity of sweet potato glutinous rice liquor after storage

3 結(jié) 論

1)分析了紅薯糯米酒發(fā)酵過程以及各貯存階段成分變化情況。其中可溶性固形物、酒精度及pH值隨著發(fā)酵時間均產(chǎn)生明顯變化,其中發(fā)酵第3天為紅薯糯米酒發(fā)酵關(guān)鍵時期。

2)通過不同條件下貯存發(fā)酵酒樣實驗可知,可溶性固形物、總酯、總酚含量變化不大,而酒精度、黃酮、維生素C含量受溫度及果膠酶含量的變化有明顯差異。常溫貯藏的紅薯糯米酒色澤和口感較差,而低溫貯藏能提高紅薯糯米酒總酯含量,進(jìn)而增進(jìn)口感。

3)氣相色譜分析測得不同貯存條件下甲醇、異戊醇含量發(fā)現(xiàn),貯存溫度和果膠酶添加量與紅薯糯米酒各成分以及甲醇、異戊醇生成相關(guān),其中4℃,2%果膠酶添加量條件下,能保存紅薯糯米酒品質(zhì)和風(fēng)味,降低甲醇及異戊醇生成。

4)不同貯存條件下的紅薯糯米酒對自由基清除能力不同,并隨著果膠酶添加量增加而增大,其中添加2.0%果膠酶能明顯提高紅薯糯米酒的抗氧化能力。

紅薯糯米酒不僅保留了米酒獨特的風(fēng)味,而且增加了紅薯的香甜,適合多類人群食用,具有廣闊的市場前景。