姜云晶，楊子鵬，朱電鋒，范夢雪，陳曉芳，儲小燕，張婭菲，劉 秦，劉錦芳，李 玉，馮士彬，吳金節(jié)，王希春

(安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥230036)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是由某些真菌產(chǎn)生的一種霉菌毒素，世界范圍內(nèi)均有檢出，主要污染玉米、大麥、小麥等農(nóng)產(chǎn)品及其制品。DON污染后，農(nóng)產(chǎn)品的生物活性及其營養(yǎng)價值均被破壞，質(zhì)量水平大幅降低[1-2]。DON雖然毒性較低，但其檢出率較高，因此動物DON中毒的發(fā)病率一直居高不下。DON的毒性作用主要是影響動物的神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及胃腸道[3]，各類動物誤食DON后會表現(xiàn)出不同程度的癥狀，其中豬在所有動物中的表現(xiàn)最為嚴重[4]。國內(nèi)外研究人員已著力于探索DON的神經(jīng)毒性分子機制，并且在此領域獲得了初步成果。耿芳芳等[5-7]研究指出，DON對雛雞具有一定的神經(jīng)毒性作用，可引起雛雞生長緩慢、便血、脂質(zhì)過氧化反應及大腦海馬組織超微結(jié)構發(fā)生明顯變化，腦中Ca2+與鈣調(diào)蛋白(CAM)含量及其mRNA相對表達量顯著降低。Prelusky等[8]發(fā)現(xiàn)，DON可以快速通過血腦屏障進入大腦，并達到峰值。DON還能夠在腦部不同部位引起某些神經(jīng)遞質(zhì)的變化[9]，導致免疫應答遲滯、腦中 5-HT含量升高，進而導致動物行為異常，出現(xiàn)食欲不振、肢體運動障礙、嘔吐以及嗜睡癥狀。Swamy等[10]用含DON的日糧飼養(yǎng)斷乳小豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)仔豬出現(xiàn)攝食量下降、生長遲緩、腦橋NE水平降低、腦部個別部位5-羥吲哚乙酸含量變化等現(xiàn)象?？梢?，DON引起的生長抑制、嘔吐、食欲減退等都可能與神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂及神經(jīng)損傷有關。

自噬是細胞損傷后做出的自主性防御行為，通過胞內(nèi)囊泡的形式包裹受損的細胞器以及某些有害的大分子物質(zhì)并將其運送至溶酶體，隨后溶酶體內(nèi)的酶系統(tǒng)將其溶解，從而實現(xiàn)細胞自身的代謝和受損細胞器的更新。根據(jù)清理細胞內(nèi)有害物質(zhì)的途徑不同可將自噬分為3種：大自噬、小自噬以及依賴分子伴侶產(chǎn)生的自噬，其中大自噬最為常見，也是人們常稱的自噬。目前，對于DON神經(jīng)損傷的研究主要集中在神經(jīng)細胞凋亡和組織壞死方面，而關于DON引起的神經(jīng)毒性中是否有自噬的參與以及自噬的作用，國內(nèi)外尚未見相關文獻報道。PC12細胞是來源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤的細胞株，與神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的特征相似，被視為神經(jīng)細胞試驗的良好模型[11]，其傳代穩(wěn)定，常用于神經(jīng)生理、病理以及藥理學科學研究領域。本研究以PC12細胞為對象，通過體外試驗研究了不同質(zhì)量濃度DON對PC12細胞自噬(大自噬)的影響，以期為自噬在DON誘導神經(jīng)細胞損傷中的作用研究提供試驗依據(jù)，并豐富和完善DON神經(jīng)毒性的基礎理論。

1 材料與方法

1.1 材 料

PC12細胞，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；DON，Sigma公司；β-actin小鼠單克隆抗體，北京銳抗生物科技有限公司；class Ⅲ PI3K抗體，北京博奧森生物技術有限公司；Beclin-1抗體和LC3抗體，美國SANTA公司；P62抗體，沈陽萬類生物科技有限公司；Trizol RNA提取試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

Bestar?SybrGreen qPCR Mastermix，德國DBI公司；StarScript Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Mix，GenStar公司；熒光定量PCR儀，美國Thermo 公司；TEOL-2010電子透射顯微鏡，日本電子株式會社。

1.2 PC12細胞的培養(yǎng)與DON處理

將1 mg的 DON用無菌水配制成1 mg/mL DON基礎工作液，將其加入到DMEM高糖培養(yǎng)基中，配制DON質(zhì)量濃度分別為125，250，500，1 000 和2 000 ng/mL的工作液。于正方透氣蓋斜口細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)用DMEM高糖培養(yǎng)基(添加體積分數(shù)10% 的FBS和適量的抗生素)培養(yǎng)PC12細胞，培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分數(shù)5% CO2。將生長狀態(tài)良好的PC12細胞用DMEM高糖培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細胞密度為5×105mL-1，接種于六孔板內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用配制好的不同質(zhì)量濃度的DON處理細胞24 h，收集處理后的細胞，用于細胞生長狀況、形態(tài)、超微結(jié)構和自噬泡的觀測，以及自噬相關基因Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶(class Ⅲ PI3K)、人抑癌基因蛋白Beclin-1、哺乳動物真核細胞胞質(zhì)內(nèi)調(diào)控蛋白(P62)的mRNA表達水平和微管相關蛋白1輕鏈3 (LC3Ⅱ)、P62、class Ⅲ PI3K蛋白表達水平的測定。

1.3 DON對PC12細胞形態(tài)和超微結(jié)構的影響

取1.2節(jié)經(jīng)不同質(zhì)量濃度DON處理的PC12細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況及形態(tài)變化，然后用戊二醛固定細胞后制作電鏡切片，觀察細胞超微結(jié)構的變化。

1.4 DON對PC12細胞自噬的影響

調(diào)整PC12細胞密度為2×105mL-1，備用。將圓形細胞爬片鋪入24孔板內(nèi)，每孔接種0.5 mL上述PC12細胞，培養(yǎng)24 h，之后分別加0(對照組(CK))，125，250，500，1 000和2 000 ng/mL的DON工作液0.5 mL/孔，培養(yǎng)24 h，棄工作液，取細胞爬片備用。細胞爬片用PBS清洗后用體積分數(shù)4%多聚甲酸固定30 min，體積分數(shù)0.5% TritonX-100室溫透膜20 min，添加50 g/L BSA封閉液，置室溫條件下20 min，LC3一抗4 ℃孵育過夜，PBS清洗2次(5 min/次)，加入Cy3標記的二抗在室溫條件下避光反應1 h，清洗二抗，100 ng/mL DAPI染色10 min，PBS清洗，封片觀測LC3聚點率。

1.5 DON對PC12細胞class Ⅲ PI3K、Beclin-1、P62基因 mRNA表達水平的影響

根據(jù)GenBank中的class ⅢPI3K、Beclin-1、P62和Actb(內(nèi)參)基因序列(GenBank登錄號分別為：NC_005105.4、NC_005109.4、NC_005104.4和NC_005111.4)，用Primer3軟件設計引物(表1)。引物由華大基因公司合成。

表1 class Ⅲ PI3K、Beclin-1、P62和Actb基因的引物信息Table 1 Primer pairs for class Ⅲ PI3K,Beclin-1,P62 and Actb genes

取1.2節(jié)經(jīng)不同質(zhì)量濃度DON處理的PC12細胞，用Trizol 法提取RNA，測定RNA濃度。RNA使用StarScript Ⅱ First-strand cDNA Synthesis Mix在42 ℃進行反轉(zhuǎn)錄30 min，85 ℃ 5 min使反轉(zhuǎn)錄酶失活，獲得所需cDNA。

參照StepOneTMReal-time PCR System和Bestar?SybrGreen qPCR Mastermix配制PCR反應體系，然后按以下程序進行PCR擴增：95 ℃預變性 2 min； 95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。熔解曲線95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min， 按照每10 s 0.5 ℃的速度由55 ℃升溫至98 ℃。各試驗組的class ⅢPI3K、Beclin-1、P62基因和內(nèi)參基因Actb均在同一參數(shù)下進行3次重復性試驗。以0 ng/mL DON處理的PC12細胞為內(nèi)參(設定其表達水平為1)，采用2-ΔΔCt方法[12]計算其他處理PC12細胞class ⅢPI3K、Beclin-1、P62基因的相對表達量。

1.6 DON對PC12細胞自噬相關蛋白表達的影響

以β-actin蛋白為內(nèi)參，采用Western-blot法分析DON對自噬相關蛋白表達水平的影響。取1.2節(jié)經(jīng)不同質(zhì)量濃度DON處理的PC12細胞，按照碧云天公司提供的試劑盒抽提總蛋白，用于LC3Ⅱ、P62、class Ⅲ PI3K蛋白表達水平的檢測。采用BCA工作液測定各試驗組提取物的總蛋白含量，調(diào)節(jié)總蛋白含量使其一致。將上述總蛋白樣品加入5×SDS loading buffer，95 ℃水浴熱處理10 min后-80 ℃保存?zhèn)溆?。總蛋白?0 μg 的上樣量進行SDS-PAGE電泳(50 g/L濃縮膠，class Ⅲ PI3K、p62使用120 g/L分離膠， LC3使用150 g/L分離膠)，試驗條件為：120 V電泳20～30 min，當待檢樣品到達分離膠邊界后把電壓降為80 V，繼續(xù)電泳60～80 min。隨后依照負極-海綿-靠膠濾紙-膠-PVDF膜-靠膜濾紙-海綿-正極的次序放入電泳槽，120 V電壓下轉(zhuǎn)膜40 min，轉(zhuǎn)膜完成后，將其置于50 g/L BSA溶液中，在搖床上室溫勻速震動封閉4 h。加class Ⅲ PI3K(1∶250)、 P62(1∶500)、LC3 (1∶750) 一抗，冷藏條件下過夜孵育；加二抗(1∶10 000) 室溫孵育2 h。進行ECL化學發(fā)光檢測，暗室曝光顯影，凝膠成像處理系統(tǒng)拍照后，用軟件對所獲得的圖片進行灰度掃描分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 DON對PC12細胞形態(tài)的影響

分別用配制好的不同質(zhì)量濃度的DON處理PC12細胞24 h后，觀察細胞的生長情況，結(jié)果表明，對照組(0 ng/mL DON)PC12細胞飽滿，細胞充滿整個視野，緊密地連接在一起，甚至出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象(圖1-A)；隨著DON質(zhì)量濃度的增大，PC12細胞之間空隙逐漸變大，凸起結(jié)構逐漸變少，正常細胞的飽滿伸展形態(tài)喪失，體積縮小漸為圓形，視野內(nèi)漂浮和貼壁不緊的細胞增多(圖1-B～F)。

A～F分別為0 (CK)，125，250，500，1 000和2 000 ng/mL DON處理的細胞
A-F represent 0 (CK),125,250,500,1 000 and 2 000 ng/mL DON treated cells,respectively
圖1 DON對PC12細胞生長狀態(tài)的影響(×400)
Fig.1 Effect of DON on PC12 cell growth state (×400)

2.2 DON對PC12細胞超微結(jié)構的影響

PC12細胞經(jīng)過DON暴露，制片后使用透射電鏡觀察其超微結(jié)構，結(jié)果見圖2。圖2表明，對照組細胞胞質(zhì)均勻；DON處理組細胞胞質(zhì)中有空泡，出現(xiàn)了雙層或多層膜包裹的自噬小體和晚期自噬溶酶體結(jié)構，且DON質(zhì)量濃度越高，PC12細胞的空泡化越明顯，2 000 ng/mL DON組出現(xiàn)的胞質(zhì)空泡化細胞最多，部分視野可見自噬小體。

2.3 DON對PC12細胞自噬的影響

由圖3可見，對照組細胞呈微弱紅色熒光且LC3未見點狀聚集現(xiàn)象；不同質(zhì)量濃度的DON均可引起LC3發(fā)生聚點現(xiàn)象，且隨著DON質(zhì)量濃度的增加，LC3呈點狀在細胞核周邊凝集的數(shù)量呈先增加后減少的趨勢，當DON質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL時發(fā)生 LC3聚集的細胞數(shù)量最多。計算各處理的聚點率，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，500，1 000和2 000 ng/mL DON處理PC12細胞的聚點率極顯著高于對照組(P<0.01)，表明DON暴露可誘導PC12細胞發(fā)生自噬現(xiàn)象。

Ⅰ.Cy3標記LC3結(jié)果，Ⅱ.DAPI染色結(jié)果，Ⅲ.Merge結(jié)果。箭頭標示發(fā)生聚點的LC3
Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ show the results of Cy3 mark LC3, DAPI staining and Merge,respectively.Arrows point the presence of LC3 puncta
圖3 不同質(zhì)量濃度 DON對PC12細胞自噬的影響
Fig.3 Effect of DON on autophagy of PC12 cell

*，**分別表示與對照組(0 ng/mL DON)相比差異達顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01) 水平。下圖同
* and ** represent significant difference (P<0.05) and highly significant difference (P<0.01) compared with control group,respectively.The same below
圖4 DON對PC12細胞聚點率的影響
Fig.4 Effect of DON on punctuate ratio of PC12 cell

2.4 DON對PC12細胞自噬相關基因mRNA表達的影響

采用RT-PCR方法檢測class ⅢPI3K、Beclin-1、P62 mRNA的相對表達水平，結(jié)果見圖5。由圖5可知，試驗組class ⅢPI3KmRNA相對表達水平均極顯著高于對照組(P<0.01)，且當DON質(zhì)量濃度為125～1 000 ng/mL時，class ⅢPI3KmRNA相對表達水平逐漸增高，在DON質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL時達到峰值，之后表達水平下降。Beclin-1 mRNA相對表達水平在經(jīng)DON刺激后極顯著增加(P<0.01)，在DON質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL時達到最大值。P62 mRNA相對表達水平隨著DON質(zhì)量濃度的增加而顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)下降，在 DON質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL時降至最低。

2.5 DON對PC12細胞自噬相關蛋白表達的影響

DON對PC12細胞自噬相關蛋白表達影響的SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果見圖6。由圖6可知，不同質(zhì)量濃度DON對LC3Ⅱ、P62和class Ⅲ PI3K蛋白表達的影響有差異。

由圖7可知， DON處理組PC12細胞LC3Ⅱ蛋白的表達量隨DON質(zhì)量濃度的增大而呈先增加后降低的趨勢，1 000 ng/mL DON處理組表達量最高；與對照組相比，250～2 000 ng/mL DON處理組LC3表達量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)增加。與對照組相比，DON處理組PC12細胞P62蛋白表達量均極顯著降低(P<0.01)，其中以1 000 ng/mL DON 處理組最低。DON處理組PC12細胞class Ⅲ PI3K蛋白的表達量隨DON質(zhì)量濃度的增大而呈先增加后降低的趨勢，以1 000 ng/mL DON處理組表達量最高；與對照組相比，500～2 000 ng/mL DON處理組細胞class Ⅲ PI3K蛋白表達量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)增加。

圖5 DON 對PC12細胞自噬相關基因mRNA表達的影響
Fig.5 Effects of DON on autophagy-related genes expressions of PC12 cells

圖6 DON對PC12細胞自噬相關蛋白表達影響的SDS-PAGE電泳檢測
Fig.6 SDS-PAGE results of effect of DON on autophagy-related proteins

圖7 DON對PC12細胞自噬相關蛋白表達水平的影響
Fig.7 Effect of DON on autophagy-related proteins

3 討 論

國內(nèi)外關于DON的研究一致指出，DON對動物造成的各種損害最終都是通過細胞凋亡和壞死實現(xiàn)的，體外試驗發(fā)現(xiàn)，DON暴露能夠引起各類細胞的凋亡和壞死，但在DON造成細胞壞死和凋亡的過程中是否存在自噬的參與至今鮮有研究。而自噬與凋亡、壞死類似，在神經(jīng)細胞功能發(fā)揮方面起重要作用。因此，本研究選用有類似神經(jīng)細胞功能的PC12細胞為對象，通過電鏡、免疫熒光、qRT-PCR法及Western-blot等試驗技術研究DON處理后PC12細胞是否發(fā)生自噬以及發(fā)生自噬的分子機制。自噬小體以及自噬溶酶體是評價自噬發(fā)生的重要指標[13]。本試驗使用透射電鏡觀察DON處理后的細胞，大部分視野可見自噬小體以及自噬溶酶體。

LC3在細胞內(nèi)由泛素樣蛋白合成，經(jīng)Atg4同源物催化后其暴露出某些氨基酸殘基，形成LC3Ⅰ，LC3Ⅰ溶于整個細胞漿內(nèi)。當細胞發(fā)生自噬時，LC3Ⅰ與囊泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)特異性結(jié)合，最終形成能夠直觀反映自噬的LC3Ⅱ。在自噬發(fā)生的最后一個階段——自噬溶酶體的形成階段，LC3Ⅱ會被溶酶體內(nèi)的一系列酶降解。LC3Ⅱ的含量能夠直觀地反映自噬泡的數(shù)量，二者呈正相關關系。酸性自噬泡的形成是自噬的一個重要特征[14-15]。因此，可采用檢測LC3Ⅱ的含量來評判自噬發(fā)生的強弱[16-18]。Han等[19]在DON誘導的豬卵母細胞發(fā)生自噬和凋亡的試驗中指出，自噬泡較多組的LC3含量也較多。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量DON可以使自噬泡的形成增多，免疫熒光及Western-blot檢測LC3Ⅱ含量也較多，這與Tang等[20]的研究結(jié)果一致。

PI3K是自噬過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白之一。依據(jù)其結(jié)構可將PI3K分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3類，在最早的研究中發(fā)現(xiàn)在添加Class Ⅲ PI3K的抑制劑后自噬的程度減弱，這反向證明了class Ⅲ PI3K能夠促進自噬的發(fā)生。PI3K的Ⅰ型和Ⅱ型最豐富，Ⅰ型PI3K及其產(chǎn)物通過激活Akt/PKB，進而活化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制自噬[21]。只有Ⅲ型PI3K(class Ⅲ PI3K)才是自噬的正調(diào)控蛋白，通過與Beclin-1結(jié)合共同致力于自噬泡的核化過程[22-24]。本研究在基因和蛋白表達水平上測定的class Ⅲ PI3K表達量都符合該蛋白在自噬中的表達方式。

如今，針對Beclin-1在自噬領域內(nèi)的研究越來越廣泛。類似的研究報道有，當Beclin-1基因的表達水平增高時，人類乳腺癌細胞中自噬小體的數(shù)量上升，但細胞增殖受到抑制[25]。也有體外研究發(fā)現(xiàn)，Beclin-1基因表達量降低時，機體細胞的增殖機能上升，自噬水平逐漸下降[26]。Beclin-1基因編碼序列相仿于酵母Atg6，Beclin-1蛋白不具酶活力，是影響自噬活性的重要因素，主要與各蛋白之間的調(diào)節(jié)因子接觸輔助調(diào)控Vps-34，最終與Vps34-Vps15結(jié)合作用于自噬溶酶體，促進自噬的發(fā)生。本試驗結(jié)果表明，DON處理后PC12細胞Beclin-1的基因表達水平提高，與自噬程度的變化趨勢一致。

P62具有細胞因子調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導、蛋白更新以及自噬調(diào)節(jié)等功能。P62中有一個稱為LIR的線性結(jié)構域，該結(jié)構域能夠與自噬標志物LC3相互結(jié)合并與泛素化蛋白相連，參與自噬的過程，最終將受損的細胞器、有害大分子以及異物運送至溶酶體形成自噬溶酶體而將其溶解。研究發(fā)現(xiàn)，在自噬缺陷性試驗中檢測到了P62蛋白含量大量增多，進一步揭示了P62蛋白與自噬存在密不可分的關系[27]。自噬過程中伴隨著P62蛋白被自噬溶酶體水解這一過程，因此P62蛋白的含量與自噬強度呈負相關關系[28]，這與本試驗P62蛋白表達水平隨著DON質(zhì)量濃度的升高而下降的結(jié)果一致。

綜上所述，DON能促使PC12細胞的生長狀態(tài)發(fā)生改變，造成細胞破損，并顯著調(diào)節(jié)自噬相關基因mRNA與蛋白的表達水平，誘導PC12細胞發(fā)生自噬。