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(山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 山西 大同 037009)

赤小豆(Vignaangrlaris)又名赤豆、蛋白豆、赤山豆，豆科(Leguminosae)豇豆屬(Vigna)，一年生雙子葉草本植物，外形呈橢圓或長(zhǎng)橢圓狀，多為赤褐色。赤小豆對(duì)土壤要求低，在微酸、微堿、微貧瘠中均能生長(zhǎng)，在我國(guó)各地均普遍栽培。赤小豆具有廣泛的藥用價(jià)值和食用價(jià)值。目前，赤小豆在中藥材領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，它含有其他豆科植物缺乏或含量低的三萜皂甙等成分，具有抗癌，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，護(hù)肝及減肥等多重生理功能[1-2]。

化學(xué)誘變可快速改良物種，提高作物產(chǎn)量、質(zhì)量等性狀。疊氮化鈉(NaN3)作為化學(xué)誘變常用的誘變劑之一，早期研究者采用的處理溶液pH值為7，而無(wú)法顯示出疊氮化鈉的誘變效果。后來(lái)，選用不同pH值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，疊氮化鈉溶液在pH值為3時(shí)，可誘發(fā)高頻率的突變[3]。其誘變機(jī)理為：疊氮化鈉等電點(diǎn)在pH=4.18，當(dāng)用磷酸緩沖液(pH=3，現(xiàn)用現(xiàn)配)溶解疊氮化鈉時(shí)，在溶液中會(huì)產(chǎn)生一種呈中性的HN3分子，它能夠以自由擴(kuò)散的方式透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞中，以堿基替換的方式影響DNA的正常合成，導(dǎo)致處理種子發(fā)生點(diǎn)突變[4-5]。疊氮化鈉是一種強(qiáng)烈的呼吸抑制劑，抑制了電子傳遞鏈中的細(xì)胞色素氧化酶和過(guò)氧化物酶。相比于其他誘變劑，疊氮化鈉具有高效、無(wú)毒、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)。

目前,關(guān)于疊氮化鈉在其他物種方面的誘變實(shí)例較多[6-7]，但是針對(duì)赤小豆疊氮化鈉誘變卻鮮有報(bào)道。赤小豆與其它豆科植物類似，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化較為困難，不易構(gòu)建插入突變體庫(kù)[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)疊氮化鈉處理赤小豆，研究種子萌發(fā)及抗氧化系統(tǒng)的變化，為赤小豆化學(xué)誘變育種及反向遺傳學(xué)等研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

赤小豆(由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所提供)。

1.2 方 法

選取顆粒飽滿、無(wú)褶皺、大小均勻的赤小豆種子。先用沸水燙種30 s后，加入清水冷卻，浸種6 h，瀝干表面水分。將浸好的種子以每90粒置于三角瓶中，共18組(以每粒種子1 mL處理液，按設(shè)定的疊氮化鈉濃度和時(shí)間梯度處理)。置于搖床培養(yǎng)箱(溫度37 ℃，120 r/min)，按設(shè)計(jì)的時(shí)間梯度培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后，用硫代硫酸鈉溶液處理15 min，終止反應(yīng)，最后用清水沖洗5 min，洗去殘留液。將處理好的種子放置在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿均勻地放置30粒種子，并使濾紙保持濕潤(rùn)狀態(tài)，置于恒溫培養(yǎng)箱(25 ℃)中，光照培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)7 d中赤小豆種子每天的發(fā)芽情況。將采用不同濃度，不同時(shí)間疊氮化鈉誘變劑處理的赤小豆發(fā)芽種子分別移栽花盆中，每盆均勻放置5粒，培養(yǎng)成植株。

由于赤小豆發(fā)芽時(shí)間較長(zhǎng)，所以在記錄赤小豆發(fā)芽過(guò)程中，每天對(duì)赤小豆種子進(jìn)行清洗，以防染菌對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果造成干擾。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

發(fā)芽率(%)=7 d所有發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%。

SOD、POD和CAT活性測(cè)定參考高俊鳳版《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》[9]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 23軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 疊氮化鈉誘變對(duì)赤小豆種子發(fā)芽的影響

由表1可知：同一時(shí)間處理，磷酸緩沖液(pH=3)處理的赤小豆發(fā)芽率大于蒸餾水處理的發(fā)芽率，且差異水平極顯著；采用較低濃度的疊氮化鈉溶液(≤0.2 mmol/L)處理赤小豆種子后，赤小豆的發(fā)芽率及相對(duì)發(fā)芽率有平緩的增大趨勢(shì)，而后隨著疊氮化鈉處理濃度的增大，赤小豆種子的發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率表現(xiàn)為下降。說(shuō)明磷酸緩沖溶液(pH=3)和低濃度的疊氮化鈉(≤0.2 mmol/L)對(duì)赤小豆種子萌發(fā)都有促進(jìn)作用，而高濃度的疊氮化鈉溶液會(huì)抑制種子萌發(fā)。相同濃度下(≤1.4 mmol/L)赤小豆種子發(fā)芽率隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。表明適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)處理時(shí)間，會(huì)促進(jìn)赤小豆種子萌發(fā)。由數(shù)據(jù)可知：誘變時(shí)間為20 h時(shí)，疊氮化鈉對(duì)赤小豆的半致死濃度1.0 mmol/L。

表1 不同濃度和時(shí)間的疊氮化鈉對(duì)紅小豆發(fā)芽的影響

時(shí)間(h)濃度(mmol/L)發(fā)芽率(%)相對(duì)發(fā)芽率(%)16ck184.44cC92.68bBck291.11bB100.00cC0.297.78aA107.32aA0.675.56dD82.93dD1.036.67eE40.25eE1.424.44fF26.82fF1.813.33gG14.63gG20ck391.11bB93.96bBck496.97aA100.00aA0.297.78aA100.84aA0.677.78cC80.21cC1.048.89dD50.41dD1.47.78eE38.96eE1.827.78fF28.65fF24ck594.44aA97.70aAck696.67aA100.00aA0.296.97aA100.00aA0.680.00bB81.91bB1.051.11cC52.87cC1.450.00cC51.72dD1.827.78dD28.73eE

注：ck1，ck3，ck5處理液為蒸餾水；ck2，ck4，ck6處理液為pH=3的磷酸緩沖液。表中同系列不同字母代表存在差異，小寫字母代表平均值差異的顯著性水平為0.05，大寫字母代表平均值差異的顯著性水平為0.01。

2.2 疊氮化鈉對(duì)赤小豆M1代葉片SOD活性的影響

如圖1所示，相同處理時(shí)間下，磷酸緩沖溶液(pH=3)對(duì)赤小豆M1代葉片中的SOD活性影響較大，顯著高于蒸餾水對(duì)照組；較低濃度疊氮化鈉溶液(≤1.0 mmol/L)處理后，赤小豆M1代葉片中的SOD活性增大，但疊氮化鈉濃度小于0.2 mmol/L時(shí)，赤小豆SOD活性增大不明顯；隨著疊氮化鈉濃度繼續(xù)增大，赤小豆葉片中SOD活性下降。說(shuō)明磷酸緩沖溶液(pH=3)和較低濃度的疊氮化鈉溶液(≤1.0 mmol/L)對(duì)赤小豆M1代葉片中的SOD活性有促進(jìn)作用，較高濃度的疊氮化鈉溶液(≥1.4 mmol/L)對(duì)赤小豆SOD活性有抑制作用。處理液濃度較低時(shí)(≤1.0 mmol/L)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，赤小豆M1代葉片SOD活性有平緩的增大趨勢(shì)；隨著處理液濃度增大，活性先平緩增大，后平緩減小。說(shuō)明適宜的處理時(shí)間也能提高赤小豆SOD活性，但影響程度沒有濃度梯度顯著。

圖1 NaN3處理對(duì)赤小豆M1代葉片SOD活性的影響(p<0.05)。

2.3 疊氮化鈉對(duì)赤小豆M1代幼苗POD活性的影響

如圖2所示，磷酸緩沖溶液(pH=3)和較低濃度的疊氮化鈉溶液(≤0.6 mmol/L)均能使赤小豆M1代組織中的POD活性增大，但低濃度的疊氮化鈉(≤0.2 mmol/L)使赤小豆POD活性增大不明顯；而后隨著處理液濃度增大，POD活性降低。說(shuō)明磷酸緩沖溶液(pH=3)和較低濃度的疊氮化鈉(≤0.6 mmol/L)對(duì)赤小豆M1代組織中的POD活性有促進(jìn)作用，高濃度的疊氮化鈉溶液(≥1.0 mmol/L)對(duì)赤小豆M1代組織的POD活性有抑制作用。相同處理液濃度下(≤0.2 mmol/L)，赤小豆M1代POD活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)平緩增大，當(dāng)處理液濃度大于0.6 mmol/L，赤小豆POD活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而降低。說(shuō)明適宜的處理時(shí)間對(duì)赤小豆M1代組織中的POD活性也有一定的促進(jìn)作用，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)抑制赤小豆的POD活性。

2.4 疊氮化鈉對(duì)赤小豆M1代葉片CAT活性的影響

如圖3所示，相同處理時(shí)間，磷酸緩沖溶液(pH=3)和疊氮化鈉溶液都能使赤小豆M1代葉片中CAT活性增大，但在較低疊氮化鈉濃度(≤0.6 mmol/L)誘變下，CAT活性增大不明顯；疊氮化鈉濃度繼續(xù)升高，其活性顯著增強(qiáng)。說(shuō)明磷酸緩沖液(pH=3)和高濃度的疊氮化鈉處理對(duì)赤小豆M1代CAT活性影響較大。相同處理濃度下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，赤小豆M1代葉片中的CAT活性平緩升高。說(shuō)明處理時(shí)間對(duì)赤小豆M1代葉片CAT活性也有一定的影響。

圖2 NaN3處理對(duì)赤小豆M1代幼苗POD活性的影響(p<0.05)

圖3 NaN3處理對(duì)赤小豆M1代葉片CAT活性的影響(p<0.05)

3 討論與結(jié)論

疊氮化鈉誘變是獲得基因水平變異體的重要途徑，了解疊氮化鈉處理時(shí)間和處理濃度等基本條件是進(jìn)行誘變育種的前提。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織與國(guó)際原子能委員會(huì)提出的谷類作物疊氮化鈉處理一般程序應(yīng)用于豆類作物應(yīng)適當(dāng)?shù)男薷?。由于豆類種子種皮較厚，不易打破，體積大，發(fā)芽所需的水分多[8]。所以在其預(yù)浸、疊氮化鈉誘變處理時(shí)間等方面都應(yīng)適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)，誘變劑與種子比例應(yīng)做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整[9]。本研究采用0.0，0.2，0.6，1.0，1.4，1.8 mmol/L的疊氮化鈉溶液對(duì)赤小豆種子進(jìn)行誘變處理，處理時(shí)間為16，20，24 h。同一處理時(shí)間，NaN3濃度高于0.6 mmol/L時(shí)，赤小豆種子萌發(fā)受抑制，且疊氮化鈉濃度越大，抑制作用越明顯。誘變濃度較低時(shí)，處理時(shí)間延長(zhǎng)可對(duì)種子萌發(fā)有促進(jìn)作用。當(dāng)處理時(shí)間為16，20 h時(shí)，磷酸緩沖溶液(pH=3)和低濃度(≤0.2 mmol/L)的疊氮化鈉溶液對(duì)赤小豆萌發(fā)有極顯著的影響。浸種16 h對(duì)所有種子是否都能打破萌發(fā)，還有待進(jìn)一步探究。姚紅等在不同培養(yǎng)條件對(duì)紅小豆萌發(fā)特性影響研究中指出，35～45 ℃浸種24 h，紅小豆的發(fā)芽率最高[11]。而在較低濃度(≤1.4 mmol/L)疊氮化鈉處理下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，則有可能使赤小豆萌發(fā)，發(fā)芽率增大。而事實(shí)上，24 h的蒸餾水處理發(fā)芽率確實(shí)大于20 h的發(fā)芽率。

注：A為對(duì)照，B～F為不同濃度NaN3突變?nèi)~形。圖4 觀察到的M1代植株代表性突變表型

抗氧化系統(tǒng)作為植物適應(yīng)和抵抗逆境能力的一個(gè)重要機(jī)制，SOD、POD、CAT活性是反映植物抗氧化系統(tǒng)能力的重要指標(biāo)。正常代謝下，植物組織中自由基的產(chǎn)生與清除處于低水平平衡狀態(tài)。在低脅迫環(huán)境下，植物體內(nèi)的自由基清除系統(tǒng)激活，產(chǎn)生的作用超過(guò)了自由基對(duì)植物的損傷[12]。本研究顯示，較低濃度誘變劑、適宜誘變時(shí)間可使赤小豆M1代幼苗中SOD、POD、CAT活性升高，有助于清除體內(nèi)因脅迫導(dǎo)致產(chǎn)生的過(guò)多自由基，利于防御因逆境脅迫對(duì)赤小豆幼苗的傷害；在高脅迫環(huán)境下，保護(hù)酶系統(tǒng)嚴(yán)重被抑制，抗氧化酶系統(tǒng)內(nèi)多種酶之間活性不平衡[13-14]。研究中，隨著處理濃度增大和誘變時(shí)間延長(zhǎng)，赤小豆M1代組織中的SOD、POD活性降低，但CAT活性卻升高。表明赤小豆對(duì)高濃度的疊氮化鈉傷害也能做出保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，其中CAT起關(guān)鍵作用。植物中SOD、POD活性隨脅迫的增強(qiáng)表現(xiàn)為先增大后降低，這符合植物應(yīng)對(duì)脅迫反應(yīng)的特征。即當(dāng)植物面對(duì)脅迫時(shí)，會(huì)通過(guò)各種機(jī)制提高抗性以適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境，但當(dāng)脅迫超過(guò)植物可以耐受極限時(shí)，植物的防御機(jī)制就會(huì)損傷、甚至死亡。

佟星等研究發(fā)現(xiàn)，EMS濃度為0.9%，處理時(shí)間為24 h時(shí)，京農(nóng)6號(hào)小豆M1代葉形變異突出，有雞爪葉、劍葉、腎形葉等[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，疊氮化鈉處理也會(huì)使赤小豆葉形發(fā)生改變。疊氮化鈉處理后赤小豆M1代葉片發(fā)生皺縮，甚至殘缺，且疊氮化鈉濃度越高，赤小豆殘缺越明顯。