具有止血作用的纖維蛋白凝膠的制備及表征

陳俊英，高霞麗，譚建英

(西南交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院， 四川 成都 610031)

在手術(shù)過程中，出血部位的及時止血，不僅會提高手術(shù)成功率，而且可顯著減少術(shù)后并發(fā)癥。關(guān)于手術(shù)部位止血，已從古代物理方法止血、中草藥止血發(fā)展為今天的止血材料止血。理想止血材料需滿足快速止血、清潔安全、可促傷口愈合、價格便宜、使用方便等綜合要求[1]。

目前發(fā)展的止血材料種類較多，如醫(yī)用止血明膠、氧化纖維素與氧化纖維素網(wǎng)、α-氰基丙烯酸酯類組織膠和纖維蛋白膠等[2-10]。其中，纖維蛋白凝膠(fibrin-gels)是纖維蛋白單體在凝血酶及催化因子作用下聚合形成的生物大分子材料。在80年代就曾出現(xiàn)商業(yè)化纖維蛋白膠[11]。纖維蛋白凝膠的止血并不依賴凝血機(jī)制，故對存在凝血功能障礙的患者很適用[12-13]。此外，纖維蛋白凝膠還具有不傳染病毒、室溫下性質(zhì)穩(wěn)定等特點。除了用于局部止血、防止?jié)B透和黏連外，纖維蛋白膠還應(yīng)用于骨科領(lǐng)域，可作為緩釋載體和骨材料支架等[14-17]。

本文模擬人體凝血反應(yīng)的最后階段，將纖維蛋白原和凝血酶制備成纖維蛋白凝膠，以獲得一種具有止血功能的生物凝膠材料。研究中以纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液的體積比為變量，考察不同比例纖維蛋白凝膠的材料學(xué)性質(zhì)、對血小板粘附的影響、與全血作用時對血栓形成量的影響等。篩選比例后，進(jìn)一步了解纖維蛋白凝膠對傷口閉合情況的影響。該工作可為進(jìn)一步研發(fā)纖維蛋白凝膠作為傷口輔料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

纖維蛋白原(MW：340kDa，翊圣，上海)，凝血酶凍干粉(浙江杭康藥業(yè)有限公司)，CaCl2溶液(自己配置)，生理鹽水，PBS，2.5%戊二醛(實驗室配置)，4%多聚甲醛(谷歌)，羅丹明染色劑，檸檬酸鈉，富板漿(PRP，實驗室提取)，貧板漿(PPP，實驗室提取)，載玻片等。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍干燥機(jī)(FD-1C，北京德天佑科技發(fā)展有限公司)，掃描電子顯微鏡(QUANTA200，荷蘭FEI公司)，倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS -IX51，日本)，恒溫水浴鍋(HH-W600，常州普天儀器制造有限公司)等。

1.3 試驗方法

1.3.1 纖維蛋白凝膠的制備

將纖維蛋白原溶于生理鹽水，形成10 mg/mL的纖維蛋白原溶液，將凍干人凝血酶溶于40 mmol/L氯化鈣溶液，得到50 iu/mL的凝血酶溶液，37 ℃下，將纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液分別按1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的體積比混合形成凝膠。樣品的標(biāo)記設(shè)置如表1所示。

表1 樣品設(shè)置

1.3.2 纖維蛋白凝膠的溶脹度分析

將1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的纖維蛋白凝膠在PBS緩沖液中溶脹過夜，溶脹后取出凝膠并除去表面水份，稱取溶脹后質(zhì)量m1，然后在60 ℃左右恒溫真空干燥至恒質(zhì)量m2，利用(m1-m2)/m2計算其溶脹度。

1.3.3 HE染色分析

將1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的纖維蛋白凝膠用4%多聚甲醛固定，然后將樣品進(jìn)行無水乙醇脫水，用石蠟包埋，切片后進(jìn)行HE染色，用光鏡觀察凝膠結(jié)構(gòu)。

1.3.4 掃描電子顯微鏡(SEM)分析

將1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的纖維蛋白凝膠用2.5%戊二醛固定30 min，然后放入液氮罐。再將冷凍后的凝膠放入冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，固定，噴金，用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察凝膠的斷面結(jié)構(gòu)。

1.3.5 血小板粘附試驗

將100 μL富板漿滴加于1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的纖維蛋白凝膠表面，在37 ℃孵箱中靜置45 min，然后用生理鹽水清洗2～3遍，再用2.5%戊二醛固定，羅丹明染料染色，于熒光顯微鏡下觀察血小板粘附情況，并拍照。

1.3.6 靜態(tài)全血試驗

將700 μL全血滴加于1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5纖維蛋白凝膠表面，在37 ℃搖床上作用45 min，再用生理鹽水清洗2～3遍，然后觀察樣品表面的血栓形成情況。

1.3.7 乳鼠創(chuàng)傷實驗

用手術(shù)刀在乳鼠上制造相同的傷口模型后，將1 ∶5纖維蛋白凝膠(實驗組)和含有生理鹽水的紗布(對照組)敷在傷口表面，2 h后，觀察比較乳鼠傷口部位的閉合情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同比例纖維蛋白凝膠的溶脹度比較

將1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的纖維蛋白凝膠在PBS緩沖液中溶脹過夜后，所測得的溶脹度如圖1所示。

圖1 不同比例纖維蛋白凝膠的溶脹度

由圖1可知，1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5纖維蛋白凝膠的溶脹度不同，1 ∶1的溶脹度為53.8±5.4，1 ∶3的溶脹度為86.3±12.1，1 ∶5的溶脹度為78.8±10.1。隨著凝血酶含量的增加，3種蛋白凝膠的溶脹度大小關(guān)系為1 ∶3>1 ∶5>1 ∶1。溶脹度變化與凝血酶含量有關(guān)，但不存在正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)纖維蛋白原和凝血酶比例為1 ∶3時，溶脹度最大。這是因為在1 ∶3樣品中，兩種分子的交聯(lián)度達(dá)到最大，凝膠鎖水能力最強(qiáng)，使1 ∶3纖維蛋白凝膠在三組樣品中呈現(xiàn)最大溶脹度。

2.2 不同比例纖維蛋白凝膠的孔徑大小比較

將1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5纖維蛋白凝膠石蠟切片后，進(jìn)行HE染色，用光鏡觀察凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同比例的纖維蛋白凝膠斷面結(jié)構(gòu)的HE染色圖

從圖中觀察到形狀不規(guī)則的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，孔與孔之間相互連通，說明1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5纖維蛋白凝膠均為多孔纖維狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這種通孔有利于細(xì)胞三維生長，有利于營養(yǎng)及代謝物質(zhì)的輸送和排放，是促進(jìn)傷口組織修復(fù)的理想結(jié)構(gòu)。為了清楚觀察纖維蛋白凝膠的孔洞尺寸，將1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5纖維蛋白凝膠冷凍干燥并噴金后，進(jìn)行凝膠斷面結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微鏡(SEM)觀察，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同比例的纖維蛋白凝膠斷面結(jié)構(gòu)的SEM圖

由圖3可知，纖維蛋白凝膠內(nèi)部呈多孔網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，孔道均勻，與HE染色結(jié)果對應(yīng)。這種結(jié)構(gòu)有利于營養(yǎng)物質(zhì)的輸運(yùn)和細(xì)胞在其中的三維生長。隨著凝血酶含量增加，纖維蛋白凝膠的孔洞尺寸發(fā)生變化，1 ∶3纖維蛋白凝膠的孔洞尺寸最小，為5～13 μm，1 ∶1和1 ∶5的孔洞尺寸相近，分別為11～41 μm和12～37 μm，均大于1 ∶3的孔洞尺寸。這是因為纖維蛋白凝膠形成時，纖維蛋白與凝血酶的交聯(lián)度在1 ∶3時最大，致使凝膠致密度最高，孔洞尺寸最小。

2.3 不同比例纖維蛋白凝膠表面血小板粘附情況

通過羅丹明染色觀察到的纖維蛋白凝膠表面血小板粘附情況如圖4所示。

圖4 不同比例纖維蛋白凝膠表面血小板粘附情況

由圖4可知，載玻片表面有部分血小板粘附，活化輕微，其促凝效果較凝膠差。而在1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的凝膠表面，血小板發(fā)生集聚，活化明顯，表明表面可促進(jìn)血小板粘附和變形，有利于提高表明促凝血能力。血小板在凝膠表面發(fā)生激活與凝膠材料本身有關(guān)，纖維蛋白原和凝血酶都是參與凝血反應(yīng)的重要物質(zhì)，兩者的存在會加速凝血反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)一步激活血小板。

2.4 不同比例纖維蛋白凝膠表面血栓的形成情況

將全血加在1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5纖維蛋白凝膠表面，在37 ℃搖床上反應(yīng)45 min，然后觀察樣品表面血栓形成情況，實驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同比例纖維蛋白凝膠表面全血試驗結(jié)果

由圖5可知，載玻片表面無血栓形成，而纖維蛋白凝膠表面已形成明顯血栓。在3種纖維蛋白凝膠中，1 ∶5纖維蛋白凝膠形成的血栓量最多，載玻片與3種凝膠表面血栓形成量關(guān)系為1 ∶5>1 ∶3>1 ∶1>載玻片。該結(jié)果表明，纖維蛋白凝膠對傷口出血有良好止血作用。纖維蛋白凝膠通過形成血栓達(dá)到止血的目的，其原因可能如下。在凝血酶作用下，纖維蛋白原的ɑ鏈釋放出A肽，β鏈釋放出B肽，生成纖維蛋白單體。在這個過程中，因酸性多肽釋放，負(fù)電性降低，纖維蛋白單體易聚合形成纖維蛋白多聚體。在Ca2+與活化XIII因子的進(jìn)一步作用下，纖維蛋白單體之間以共價鍵相連，變成穩(wěn)定的不溶性纖維蛋白凝塊。形成凝膠后，通過以下機(jī)制發(fā)揮止血和封閉作用[15]：1)纖維蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，能吸附血液中的紅細(xì)胞及血小板，形成血凝塊；2)纖維蛋白凝膠形成后，機(jī)械強(qiáng)度增強(qiáng)，可以黏連組織及封閉傷口，與此同時，該凝膠能刺激毛細(xì)血管內(nèi)的細(xì)胞生長，然后以纖維蛋白凝膠為支架形成肉芽組織，從而促進(jìn)傷口愈合；3)纖維蛋白凝膠在傷口表面形成的膜狀凝膠能防止損傷組織的細(xì)胞內(nèi)溶酶體向細(xì)胞外泄漏，從而避免周圍組織進(jìn)一步受損，減少受傷表面出血，防止組織粘連。因此纖維蛋白凝膠在全血試驗中，形成大量血栓。血栓形成量隨凝血酶含量增加而增加，1 ∶5的纖維蛋白凝膠形成的血栓量最多。這可能是因為1 ∶5凝膠中凝血酶含量最多，而活化的凝血酶會加速凝血反應(yīng)，使在相同時間內(nèi)形成更多血栓。

2.5 乳鼠創(chuàng)傷實驗

由全血試驗可知，1 ∶5的纖維蛋白凝膠的血栓形成量最多，故在乳鼠創(chuàng)傷實驗時，選1 ∶5的纖維蛋白凝膠作為乳鼠創(chuàng)傷實驗的實驗組，而對照組為含有生理鹽水的醫(yī)用紗布。用手術(shù)刀在乳鼠背部制造傷口后，分別將凝膠和紗布敷在傷口表面，2 h后比較乳鼠傷口的閉合情況，實驗結(jié)果如圖6所示。

注：Rat表示乳鼠固定方式和傷口，0 h表示凝膠剛貼上時的情況，10 min、30 min、1 h、1.5 h和2 h表示凝膠貼上10 min、3 min、1 h、1.5 h和2 h后的傷口愈合情況，箭頭表示的是凝膠所在位置。

圖6 貼上1 ∶5纖維蛋白凝膠的乳鼠的

傷口表面的愈合情況

由圖6可知，纖維蛋白凝膠對傷口閉合具有促進(jìn)作用。實驗組傷口在0～30 min閉合情況與對照組無差別，但隨時間增加，1.5 h后，纖維蛋白凝膠在傷口表面與傷口黏性連接，起到傷口黏合或傷口封閉作用，而對照組傷口仍處于裂開狀態(tài)。該結(jié)果與纖維蛋白凝膠發(fā)揮傷口止血、封閉作用、促進(jìn)組織再生的機(jī)制[18]有關(guān)。由于乳鼠毛細(xì)血管不發(fā)達(dá)，新陳代謝快，本身出血量不大，故纖維蛋白凝膠的止血效果無法充分體現(xiàn)。同時，纖維蛋白凝膠呈半透明狀，有利于觀察傷口的閉合情況，減少二次傷害。

3 綜合分析與討論

纖維蛋白凝膠止血效果好，組織相容性好，黏合性能良好，其止血并不依賴凝血機(jī)制，對存在凝血功能障礙的患者較適合[12-13]。研究中，將纖維蛋白原和凝血酶制備成纖維蛋白凝膠，結(jié)果見表2。纖維蛋白凝膠內(nèi)部為多孔纖維狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，孔與孔之間相互連通，1 ∶1和1 ∶5的孔洞尺寸相近，均大于1 ∶3，孔洞尺寸大小可以通過凝血酶含量進(jìn)行調(diào)控。不同凝膠樣品的溶脹度大小關(guān)系為1 ∶3>1 ∶5>1 ∶1，3種凝膠均能激活血小板，表面易形成血栓，其中1 ∶5凝膠表面形成的血栓量最多。這是因為1 ∶5的凝膠含凝血酶最多，而凝血酶經(jīng)活化可加速凝血反應(yīng)，使在相同條件下表面血栓形成量更多。與紗布相比，由于纖維蛋白凝膠的封閉作用，1 ∶5的纖維蛋白凝膠對傷口閉合有明顯促進(jìn)作用。纖維蛋白凝膠在促進(jìn)傷口閉合方面的影響，需進(jìn)一步研究[19-22]。

表2 實驗結(jié)果匯總

注：a:“無”表示未進(jìn)行相應(yīng)實驗；b：血小板形狀和血栓形成量實驗中，對照組為載玻片，乳鼠創(chuàng)傷實驗中，對照組為含有生理鹽水的紗布；c:“+”與血栓形成量呈正比。

4 結(jié)論

1)通過材料學(xué)表征發(fā)現(xiàn)，1 ∶1、1 ∶3、1 ∶5的纖維蛋白凝膠內(nèi)部均為多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其中1 ∶3纖維蛋白凝膠的孔徑最小，溶脹度最大。

2)通過血小板粘附和全血試驗發(fā)現(xiàn)，纖維蛋白凝膠能顯著激活血小板，與血液接觸時表面血栓形成能力強(qiáng)，其中1 ∶5的纖維蛋白凝膠表面血栓形成量最多。

3)乳鼠創(chuàng)傷實驗發(fā)現(xiàn)，1 ∶5的纖維蛋白凝膠對傷口閉合有一定促進(jìn)作用。

校友作者介紹

陳俊英(1968—)，女，四川威遠(yuǎn)人，西華大學(xué)材料系熱加工工藝及設(shè)備專業(yè)1989級本科生。教授，博士生導(dǎo)師，四川省學(xué)術(shù)與技術(shù)帶頭人(2015—)。近20年來一直從事血液接觸生物材料與人工器官表面改性方面的工作，主持國家自然科學(xué)基金項目4項，主研“973”課題3項、“863”計劃1項。以第一或通信作者身份在Biomaterials、Actabiomaterialia、ACS Applied Materials & Interfaces等期刊上發(fā)表SCI收錄論文30余篇，參編《Biomedical Nanomaterials》《組織誘導(dǎo)性生物材料國際發(fā)展動態(tài)》等專著。獲授權(quán)中國發(fā)明專利14項，轉(zhuǎn)化成果1項。獲四川省科學(xué)技術(shù)進(jìn)步一等獎、教育部技術(shù)發(fā)明二等獎、中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會黃家駟生物醫(yī)學(xué)工程獎二等獎各1項。