耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌cprD基因突變分析及耐藥元件研究

陳彩云，吳慶，賴紅娟

耐碳青霉烯類藥物的細(xì)菌菌株是耐藥程度較為嚴(yán)重的菌株，其不僅對碳青霉烯類藥物表現(xiàn)為耐藥，同時(shí)對青霉素及頭孢一代至四代藥物也表現(xiàn)為耐藥。耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌的原因往往為菌株生產(chǎn)具有對碳青霉烯類藥物有水解活性的 -內(nèi)酰胺酶和/或菌株自身的膜孔蛋白D基因發(fā)生突變相關(guān)[1]。近年來，盡管國內(nèi)有較多關(guān)于鮑氏不動桿菌耐藥基因（耐藥機(jī)制）的報(bào)道，但涉及鮑氏不動桿菌D基因突變的研究較為罕見[2-4]。因此筆者收集了一組耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌，對其進(jìn)行了D基因突變分析和 33種B-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因，16種氨基糖苷類藥物耐藥基因和 10種可移動遺傳元件（MGEs）檢測，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)菌來源 收集2015年 1月至2017年12月浙江省泰順縣人民醫(yī)院住院患者痰標(biāo)本分離的菌株20株。

1.2 菌種鑒定和藥敏試驗(yàn) 菌株鑒定采用法國梅里埃公司 VITEK2compact細(xì)菌鑒定儀，抗菌藥物藥敏試驗(yàn)梅里埃公司 VITEK2compact細(xì)菌鑒定儀和Kirby-Bauer紙片擴(kuò)散法。

1.3 細(xì)菌DNA制備 為蛋白酶K水解裂解法，試劑盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。

1.4 基因檢測 全部耐藥基因檢測均為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法，檢測項(xiàng)目：膜孔蛋白 oprD基因和32種 B-內(nèi)酰胺酶基因，共 33種B-內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因，16種氨基糖苷類藥物耐藥基因，10種MGEs。全部PCR引物由無錫新吳區(qū)新克隆數(shù)據(jù)分析工作室設(shè)計(jì)并獲授權(quán)使用，PCR擴(kuò)增盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。

1.6 菌株間親緣關(guān)系分析 測得結(jié)果作樣本聚類分析（UPGMA法）。樣本聚類分析由無錫新吳區(qū)新克隆數(shù)據(jù)分析工作室完成。

2 結(jié)果

2.1 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果 20株耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌不僅對碳青霉烯類藥物（亞胺培南、美洛培南）表現(xiàn)為耐藥，對第三、第四代頭孢及復(fù)合制劑亦表現(xiàn)為耐藥，12種抗菌藥物的耐藥率均為100.0%。見表1。

2.3 耐藥元件檢測結(jié)果 20株耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌D突變率達(dá)100.0%；另外 TEM、 ADC、OXA-23 群、 OXA-66、’-Ⅰb、3’-Ⅰ、 Ⅰ1、ISaba1的檢出率亦均達(dá)100.0%。見表2。

2.4 親緣關(guān)系分析 20株菌有明顯的聚集性，且有3個(gè)克隆播散，見圖1。

3 討論

抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，20株菌不僅對碳青霉烯類藥物均表現(xiàn)為耐藥，對第三、第四代頭孢及復(fù)合制劑亦均表現(xiàn)為耐藥。對D基因作PCR擴(kuò)增及DNA測序，20株菌測得序列一致。將測得DNA序列轉(zhuǎn)為氨基酸序列后獲得一條長438個(gè)氨基酸殘基的序列，經(jīng)與SDF株比對，有4個(gè)氨基酸殘基序列不同，即20株耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌D突變率達(dá)100.0%。序列決定結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)決定功能，序列改變將導(dǎo)致功能改變。另外，20株菌 TEM、 ADC、OXA-23群、 OXA-66等4種 -內(nèi)酰胺酶基因均為 100.0%檢出率。因此可以推測本文菌株耐上述 -內(nèi)酰胺類藥物是菌株D突變與同時(shí)攜帶4種 -內(nèi)酰胺酶基因的合力結(jié)果。

表1 20株耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌對抗菌藥物耐藥情況 %

表2 20株耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌耐藥元件檢測結(jié)果 株（%）

本文菌株對3種氨基糖苷類藥物均表現(xiàn)為耐藥，20 株菌 2’-Ⅰb、3’-Ⅰ等2種氨基糖苷類藥物耐藥基因檢出率均為100.0%；另外， (3)-Ⅰ、 (6′)-Ⅰb、 (3”)-Ⅰ、 A等4種氨基糖苷類藥物耐藥基因檢出率均在75.0%以上。這些就是導(dǎo)致耐氨基糖苷類藥物的原因。

本組20株菌有明顯的聚集性，且有3個(gè)克隆播散。2號株、4號株、5號株、6號株、8號株、9號株、10號株、11號株、12號株、14號株、16號株、17號株等12株為第1個(gè)克隆[均存在oprD突變與攜帶 TEM、 ADC、 OXA-23群、OXA-66、 2’-Ⅰb、 (3)-Ⅰ、 (6’)-Ⅰb、 (3”)-Ⅰ、3’-Ⅰ、 A、1U513、ISaba1、IS26]；1 號株、18號株、20號株等3株為第2個(gè)克?。ň嬖贒突變與攜帶 TEM、ADC、 OXA-23群、 OXA-66、2’-Ⅰb、 (3)-Ⅰ、 (6’)-Ⅰb、(3”)-Ⅰfffcc03’-Ⅰ、fffcbfⅠ1、fffcbeU、fffcbd513、ISaba1、IS26)；3號株、6號株為第3個(gè)克隆(均存在oprD突變與攜帶 TEM、ADC、fffcbcOXA-23 群、fffcbbXA-66、fffcbaⅠb、fffcb93’-Ⅰ、fffcb8Ⅰ1、fffcb7U、fffcb6513、ISaba1、IS26)?？梢娺@ 3 個(gè)克隆的菌株均為攜帶了多種 -內(nèi)酰胺類藥物耐藥基因、多種氨基糖苷類藥物耐藥基因和多種MGEs。

圖1 20株耐碳青霉烯類藥物鮑氏不動桿菌菌株耐藥元件檢測結(jié)果的樣本聚類分析