鹽脅迫條件下花生應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子鑒定與分析

秦圣豪 韓燕 崔鳳 劉譯陽 萬書波 李國(guó)衛(wèi)

摘要：轉(zhuǎn)錄因子是一類具有特殊結(jié)構(gòu)、調(diào)控基因表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。為了解析轉(zhuǎn)錄因子在花生適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境中的分子機(jī)制，本研究以魯花14號(hào)為材料，通過RNA-seq分析花生轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫以及恢復(fù)后的表達(dá)差異。結(jié)果表明，在250 mmol/L NaCl處理4 d后，花生中共檢測(cè)到76個(gè)差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，分別屬于13個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。其中，根中35個(gè)轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)表達(dá)，29個(gè)下調(diào)表達(dá)；地上部40個(gè)上調(diào)表達(dá)，17個(gè)下調(diào)表達(dá)。鹽脅迫解除后，有35個(gè)轉(zhuǎn)錄因子不但沒有恢復(fù)到鹽處理前的水平，反而表達(dá)量進(jìn)一步增加。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究花生轉(zhuǎn)錄因子家族在鹽脅迫中的作用和提高花生的耐鹽性奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生；轉(zhuǎn)錄因子；鹽脅迫；恢復(fù)；RNA-seq

中圖分類號(hào)：S565.2：Q7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）06-0041-05

Abstract Transcription factors are a class of protein molecules that have special structures and regulate gene expression. Peanut variety Luhua 14 was used as the material to analyze the molecular mechanism of transcription factors responding to salt stress in peanut through RNA-seq. The results showed that after 4 days of treatment with 250 mmol/L NaCl， 76 differentially expressed transcription factors were detected in peanut， belonging to 13 transcription factor families. After salt treatment， 35 transcription factors were up-regulated and 29 were down-regulated in roots； 40 were up-regulated and 17 were down-regulated in shoots. After recovery， 35 transcription factors did not return to the pre-salt level， in contrast， the expression levels increased. This study lays a theoretical foundation for the further study of the role of peanut transcription factor family in salt stress and the improvement of salt tolerance of peanut.

Keywords Peanut；Transcription factor；Salt stress；Recovery；RNA-seq

鹽脅迫是自然界中主要的非生物脅迫之一，是直接影響農(nóng)作物生產(chǎn)穩(wěn)定的主要限制因素[1]。鹽脅迫不但會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性，改變膜的滲透性，同時(shí)還會(huì)在細(xì)胞內(nèi)外形成較強(qiáng)的滲透壓力差，使植物吸收水分困難，致使細(xì)胞發(fā)生水分虧缺[2]。鹽脅迫影響植物生長(zhǎng)發(fā)育、光合作用及呼吸作用等重要的代謝過程，且對(duì)植物體內(nèi)離子含量、酶活性、激素水平等均有影響。為了適應(yīng)環(huán)境變化，植物形成了一系列防御機(jī)制以抵御逆境傷害[3]。其中，植物抗逆基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控對(duì)植物抵御逆境脅迫發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要通過特定的轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式元件相互作用來實(shí)現(xiàn)[3]。目前發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下能夠誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子主要包括：禽成髓細(xì)胞瘤病毒致癌基因同源物類（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog， MYB）、堿性域亮氨酸拉鏈 （basicdomain leucine-zipper， bZIP）、乙烯應(yīng)答元件組合蛋白/因子（APELATA2 /ethylene-responsive element binding proteins/factors， AP2/EREBP）、鋅指型調(diào)控因子（Zinc finger regulator， WRKY）和蛋白N端含有一個(gè)新的保守序列的基因（NAC）等[4]。

花生是我國(guó)重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物之一[5，6]。目前，我國(guó)食用植物油自給率不足，對(duì)花生的需求逐年增大，而耕地面積的不斷下降，導(dǎo)致糧油爭(zhēng)地矛盾日益突出。因此開展花生耐鹽性研究，培育適應(yīng)鹽堿地種植的花生品種，是提高花生產(chǎn)量，避免糧油爭(zhēng)地，增加油脂供給的有效手段。

本研究以鹽脅迫處理前后的花生品種魯花14號(hào)的根和地上部分為材料，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq），鑒定并分析花生響應(yīng)鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄因子及表達(dá)特性，為更深入的了解花生對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制，進(jìn)一步發(fā)掘轉(zhuǎn)錄因子家族成員的相關(guān)功能、鑒定和克隆其重要的耐鹽基因，提高花生的耐鹽性奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以花生品種魯花14號(hào)為材料，在沙土中萌發(fā)7 d后將幼苗移栽到裝有2 L Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液的水培盆中，恒溫28℃，光照/黑暗：16 h/8 h，相對(duì)濕度50%，每周定期更換營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鹽脅迫處理 參考Cui等[5]的處理方法，選取18 d大小且生長(zhǎng)一致的幼苗進(jìn)行處理，分成 3 組，其中一組正常培養(yǎng)作為對(duì)照（CK），一組250 mmol/L NaCl 處理4 d（N4），一組在鹽處理4 d后轉(zhuǎn)移至正常Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)3 d進(jìn)行恢復(fù)（R3），每組設(shè)置3次重復(fù)。收集花生地上部和根，立即放入液氮中冷凍，-80℃保存。

1.2.2 RNA的提取與檢測(cè) 將冷凍樣品在液氮中研磨，利用植物總RNA提取試劑盒（天根）提取總RNA，具體步驟參照試劑盒說明。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，檢測(cè)合格后送至深圳華大基因科技有限公司進(jìn)一步確認(rèn)質(zhì)量后，進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.3 Illumina測(cè)序 參考Cui等[5]所述的方法，使用Illumina HiSeqTM 2000 測(cè)序儀對(duì)上述構(gòu)建的CK、N4及R3轉(zhuǎn)錄組 cDNA 文庫(kù)進(jìn)行深度測(cè)序與組裝。

1.2.4 差異基因鑒定與分析 為鑒定花生中響應(yīng)鹽脅迫及恢復(fù)后的差異表達(dá)基因（DEGs，differentially expressed genes），將測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行RNA-seq分析，使用RPKM （reads per kilo bases per million reads）法計(jì)算基因表達(dá)量，根據(jù)基因表達(dá)量（RPKM值）計(jì)算其在處理與對(duì)照中的差異表達(dá)倍數(shù)。將差異表達(dá)倍數(shù)≥2.0、可靠性≥0.8的基因認(rèn)定為差異表達(dá)基因。轉(zhuǎn)錄組及RNA-Seq分析的原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI的SRA （Sequence Read Archive） 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/），Bioproject的編號(hào)為PRJNA398720。

1.2.5 熒光定量RT-PCR 以分別提取的CK、N4和R3樣品的RNA 為材料，使用TaKaRa 公司的PrimeScript RT reagent Kit With cDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)

錄合成cDNA。利用qRT-PCR 驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。PCR反應(yīng)程序及內(nèi)參參考Cui等[5]所述方法，引物名稱及序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫及恢復(fù)對(duì)花生幼苗的影響

由圖1可以看出，N4與CK相比，花生幼苗的生長(zhǎng)受到顯著抑制，葉片變黃，植株失水，萎蔫嚴(yán)重，受害表現(xiàn)明顯（圖1B）；而將鹽處理的幼苗轉(zhuǎn)入Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中，花生幼苗的生長(zhǎng)并未恢復(fù)至正常水平，甚至出現(xiàn)了比鹽脅迫更為嚴(yán)重的表型（圖1C）。

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序準(zhǔn)確性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證測(cè)序差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)的可靠性，從數(shù)據(jù)中隨機(jī)挑選8個(gè)差異表達(dá)基因，其中N4中2個(gè)上調(diào)基因Unigene20928 和CL9331.contig1，2個(gè)下調(diào)基因Unigene21721和Unigene6241；R3中2個(gè)上調(diào)基因Unigene16871 和CL9331.contig1，2個(gè)下調(diào)基因Unigene25029和CL4897.contig2。以花生地上部基因CL11012.Contig1和Unigene817以及根中基因Unigene14502和Unigene20560作為鹽脅迫和恢復(fù)條件的參考基因，進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果表明，雖然8個(gè)基因在鹽脅迫和恢復(fù)后的表達(dá)程度與測(cè)序結(jié)果稍有不同（圖2、3），但脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的變化趨勢(shì)基本一致，說明Illumina測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性較高。

2.3 花生鹽脅迫下應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子分析

將CK及N4中根及地上部的差異表達(dá)基因進(jìn)行比較分析，共檢測(cè)到76個(gè)轉(zhuǎn)錄因子差異表達(dá)，分別隸屬于13個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族。由表2可以看出，根中上調(diào)表達(dá)35個(gè)，下調(diào)表達(dá)29個(gè)，其中NAC轉(zhuǎn)錄因子家族上調(diào)數(shù)量最多，共11個(gè)；bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族下調(diào)數(shù)量最多，共13個(gè)，地上部上調(diào)表達(dá)40個(gè)，下調(diào)表達(dá)17個(gè)。其中NAC轉(zhuǎn)錄因子家族上調(diào)數(shù)量最多，共11個(gè)；bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族下調(diào)數(shù)量最多，共6個(gè)。這表明NAC和bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族在花生鹽脅迫響應(yīng)中起到重要作用。

2.4 花生響應(yīng)鹽脅迫的重要轉(zhuǎn)錄因子

根據(jù)BLASTP結(jié)果對(duì)DEGs進(jìn)行功能注釋，我們發(fā)現(xiàn)多個(gè)鹽脅迫標(biāo)志性轉(zhuǎn)錄因子基因顯著上調(diào)或下調(diào)表達(dá)（表3）。上調(diào)的基因如乙烯響應(yīng)因子AhAP2（Unigene13934，Unigene13933）和AhERF（CL9645.Contig2），GRAS轉(zhuǎn)錄因子AhGRAS（CL6657.Contig1，CL6657.Contig1），GRF轉(zhuǎn)錄因子AhGRF（Unigene29805，Unigene29805），MYB轉(zhuǎn)錄因子AhMYB（Unigene14467），NAC轉(zhuǎn)錄因子AhNAC（CL8911.Contig2，Unigene11981），Trihelix轉(zhuǎn)錄因子AhTrihelix（CL3296.Contig2），WRKY轉(zhuǎn)錄因子AhWRKY（Unigene11819，CL6093.Contig1），bHLH轉(zhuǎn)錄因子AhbHLH（CL6900.Contig3）等。下調(diào)的基因如Dof轉(zhuǎn)錄因子AhDof（CL7219.Contig4），ERF轉(zhuǎn)錄因子AhERF（Unigene13426），MYB轉(zhuǎn)錄因子AhMYB（Unigene28340），MYB-related轉(zhuǎn)錄因子AhMYB-related（CL9393.Contig1，CL9393.Contig1），TCP轉(zhuǎn)錄因子AhTCP（CL10482.Contig1，CL10482.Contig1），bHLH轉(zhuǎn)錄因子AhbHLH（Unigene446， Unigene9521）及bZIP轉(zhuǎn)錄因子AhbZIP（Unigene26095，Unigene26095）。

2.5 鹽脅迫解除后花生轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)分析

為進(jìn)一步研究鹽脅迫恢復(fù)3 d后，花生幼苗的生長(zhǎng)仍然受到抑制的原因，我們篩選了R3的差異基因，查找出花生中仍有差異表達(dá)（未恢復(fù)）的轉(zhuǎn)錄因子。由表4可以看出，根中未恢復(fù)的轉(zhuǎn)錄因子13個(gè)，地上部未恢復(fù)的轉(zhuǎn)錄因子22個(gè)。其中根中ERF和MYB未恢復(fù)的數(shù)量最多，共6個(gè)；地上部MYB和NAC未恢復(fù)的數(shù)量最多，共10個(gè)。上述轉(zhuǎn)錄因子可能是花生幼苗的生長(zhǎng)并未恢復(fù)至正常水平，甚至出現(xiàn)了比鹽處理更為嚴(yán)重表型的原因。

3 討論與結(jié)論

在干旱或者鹽堿等逆境脅迫下，植物能夠通過改變基因的表達(dá)，調(diào)控不同代謝和信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在轉(zhuǎn)錄和翻譯等不同水平上做出響應(yīng)，而轉(zhuǎn)錄因子可在逆境脅迫下激活或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。目前已經(jīng)證實(shí)bZIP、WRKY、AP2/EREBP、C2H2、bHLH、MYB和NAC等轉(zhuǎn)錄因子家族的成員參與了植物對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[8]。本研究結(jié)果表明，花生在250 mmol/L NaCl處理后，共檢測(cè)到隸屬于13個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族的76個(gè)轉(zhuǎn)錄因子有差異表達(dá)。其中無論在根或地上部，NAC轉(zhuǎn)錄因子家族上調(diào)數(shù)量最多，而bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族下調(diào)數(shù)量最多。推測(cè)NAC轉(zhuǎn)錄因子家族可能在花生鹽脅迫條件下起到正向調(diào)節(jié)作用。在12個(gè)NAC家族轉(zhuǎn)錄因子成員中，Unigene11981、Unigene21164、CL8911.Contig2 上調(diào)10倍以上，這可能是花生參與鹽脅迫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子。在18個(gè)參與花生響應(yīng)鹽脅迫應(yīng)答過程的bHLH轉(zhuǎn)錄因子中，3個(gè)表達(dá)上調(diào)，其中CL6900.Contig3上調(diào)50倍以上；13個(gè)表達(dá)下調(diào)，其中Unigene9521 和Unigene446 下調(diào)60倍以上，這暗示著bHLH轉(zhuǎn)錄因子可能在花生鹽脅迫應(yīng)答中主要起負(fù)向調(diào)節(jié)的作用。另外，在植物特有的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族中，有8個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與花生的鹽脅迫應(yīng)答過程，且都表達(dá)上調(diào)，這表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在花生鹽脅迫響應(yīng)中起到正向調(diào)節(jié)的作用。

為進(jìn)一步研究R3處理后，花生幼苗的生長(zhǎng)仍然受到抑制的原因，發(fā)現(xiàn)在R3條件下35個(gè)轉(zhuǎn)錄因子不但沒有恢復(fù)到鹽處理前的水平，反而表達(dá)量進(jìn)一步增加。其中，ERF、MYB、NAC基因家族中未恢復(fù)的轉(zhuǎn)錄因子最多。推測(cè)ERF、MYB和NAC轉(zhuǎn)錄因子在花生恢復(fù)處理后仍過量表達(dá)，導(dǎo)致植物產(chǎn)生額外的應(yīng)激損害了細(xì)胞的穩(wěn)定性。

本研究通過測(cè)序數(shù)據(jù)分析，初步推斷出差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子在花生鹽脅迫和恢復(fù)中的作用，下一步需要進(jìn)行更多的試驗(yàn)來深入分析其在花生耐鹽中的作用機(jī)理。例如，鹽脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)MYB轉(zhuǎn)錄因子Unigene28340的表達(dá)，差異倍數(shù)達(dá)到700以上。本試驗(yàn)提供了花生鹽脅迫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子候選基因，為轉(zhuǎn)錄因子參與植物鹽脅迫和恢復(fù)的機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

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