轉(zhuǎn)AhDREB1基因花生T₂代植株耐鹽性分析

郭瑞杰 李文 劉風(fēng)珍 張昆 萬勇善

摘要： DREB1 （dehydration responsive element binding protein） 是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控與逆境誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)、參與植物對鹽脅迫的響應(yīng)及適應(yīng)過程中具有重要作用。本研究以轉(zhuǎn)AhDREB1基因T2代花生植株及其受體品種豐花2號（對照）為材料，苗期用1% NaCl 進行鹽脅迫處理，分析脅迫前后植株表型和基因表達(dá)變化，并對SOD、POD活性和MDA、可溶性蛋白含量等生理指標(biāo)進行測定。結(jié)果表明：鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株葉片保綠程度及根系生長狀況明顯好于對照。轉(zhuǎn)基因植株DREB1基因表達(dá)量升高、響應(yīng)鹽脅迫速度比對照快。轉(zhuǎn)基因植株參與鹽脅迫響應(yīng)的SOD、POD活性和可溶性蛋白含量高于對照，MDA含量低于對照，說明AhDREB1基因過量表達(dá)能有效提高花生的耐鹽性。篩選出耐鹽性較好的轉(zhuǎn)基因單株4個，分別是D254、D380、D385、D448。

關(guān)鍵詞：花生；DREB1；表型；表達(dá)量；生理指標(biāo)；耐鹽性

中圖分類號：S565.201文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2018）06-0072-07

Abstract As a specific transcription factor in plants， DREB1 （dehydration responsive element binding protein） plays an important role in regulating the expression of stress-induced related genes and involves in the response and adaptation of plants to salt stress. In this study， T2 transgenic peanut plants of AhDREB1 and its receptor Fenghua 2 （control） were used as the materials. The seedlings were conducted salt stress treatment with 1% NaCl， and the changes of phenotype and gene expression before and after stress treatment were analyzed. The physiological indexes such as activities of SOD and POD， contents of soluble protein and MDA were measured. The results showed that under salt stress， the green degree and root growth of transgenic plants were better than those of control. The expression level of DREB1 in transgenic plants increased and the response to salt stress was faster than that of control. The activities of SOD and POD and the content of soluble protein of transgenic plants were higher than those of control， and the content of MDA was lower. These results indicated that overexpression of AhDREB1 could enhance the salt tolerance of transgenic peanut plants. Four transgenic plants with better salt tolerance were screened， namely D254， D380， D385 and D448.

Keywords Peanut； DREB1； Phenotype； Expression quantity； Physiological index； Salt tolerance

鹽堿土在全球范圍內(nèi)分布廣泛，約有 100×108 hm2土地受到不同程度鹽漬化的威脅[1]。我國鹽漬土地面積約占全球的1/10[2]，占全國耕地面積的6.2%。土地次生鹽堿化面積的不斷增加已成為制約我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一?；ㄉ侵匾挠土?、經(jīng)濟和蛋白質(zhì)作物，目前關(guān)于花生耐鹽及鹽脅迫下體內(nèi)離子平衡調(diào)節(jié)及適應(yīng)機制的相關(guān)研究較少[3]。利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段培育高耐鹽堿花生新品種對鹽堿地開發(fā)利用、增加農(nóng)民收入具有重要意義。

DREB是一類植物特有且含有1個高度保守AP2結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，屬于 AP2/EREBP（AP2/ethylene-responsive element-binding proteins，乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白）家族。Stockinger等[4] 首次從擬南芥中克隆到編碼 DREB 蛋白的CBF1基因。Liu等[5]首次從擬南芥中克隆到編碼DREB蛋白的DREB1A和DREB2A基因。Lucas等[6]發(fā)現(xiàn)在逆境脅迫下DREB類轉(zhuǎn)錄因子特異性的與抗逆相關(guān)基因啟動子區(qū)的DRE/CRT等順式作用元件結(jié)合，激發(fā)下游靶基因過量迅速表達(dá)，使植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化酶活性增加，有效提高了植物對高鹽、低溫、干旱等的耐受性。Li等[7]從耐干燥的苔蘚中分離到新型A-5類DREB基因ScDREB8并在擬南芥中進行過表達(dá)研究，表明通過正調(diào)控下游脅迫相關(guān)基因的表達(dá)和提高活性氧清除能力，可使鹽脅迫下擬南芥的萌發(fā)率和幼苗期耐鹽能力得到顯著提高。劉強等[8]對擬南芥進行DREB基因轉(zhuǎn)化，證實轉(zhuǎn)基因擬南芥的高鹽耐受性、抗旱性均比野生型植株增強。研究表明，超表達(dá)DREB1A/CBF3、 DREB1B/CBF1 和 DREB1C/CBF2這三個基因中的任何一個都顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對冰凍、干旱和高鹽的耐受性[5， 9， 10]。在不影響植株正常生長的情況下，轉(zhuǎn)GmDREB2基因大豆對干旱和高鹽脅迫的抗性增強[11]。同樣在脅迫誘導(dǎo)RD29A啟動子控制下，過表達(dá)OsDREB2A基因的轉(zhuǎn)基因水稻也表現(xiàn)出對干旱、高鹽耐受性的提高[12]。

張梅等[13]發(fā)現(xiàn)花生的PNDREB1（GenBank登錄號為FM955398）能被低溫強烈、迅速誘導(dǎo)表達(dá)，并對干旱脅迫也有一定程度的響應(yīng)。李文[14]對花生AhDREB1研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下不同品種基因表達(dá)量的差異直接影響下游抗旱相關(guān)基因的表達(dá)，決定了品種抗旱性。翟迎慧[15]得到轉(zhuǎn)AhDREB1基因植株的基因表達(dá)量顯著高于對照，干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量和SOD、POD、CAT等酶活顯著高于對照，MDA含量顯著低于對照，說明存在干旱脅迫響應(yīng)應(yīng)答。

目前轉(zhuǎn)錄因子DREBD功能驗證大部分是在模式植物擬南芥和煙草中進行耐鹽脅迫響應(yīng)應(yīng)答研究，在花生中則主要是干旱脅迫響應(yīng)情況，對DREB1基因在花生耐鹽性及耐鹽性狀的分析研究較少。本研究以轉(zhuǎn)AhDREB1基因花生T2代植株為材料，分析鹽脅迫下的植株表型和基因表達(dá)情況，并對SOD、POD活性、MDA和可溶性蛋白含量等生理性狀進行測定，探討AhDREB1基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子與花生植株耐鹽性的關(guān)系，以期為研究DREB1基因在鹽脅迫下的生理功能及適應(yīng)機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

本試驗PCR鑒定所用T2代單株源自轉(zhuǎn)DREB1基因的花生T1代種子。具體獲取方法：課題組前期構(gòu)建了含有花生DREB1基因的過表達(dá)載體pGBDREB1[16]，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入栽培種豐花2號[14]，留種得到T1代轉(zhuǎn)基因種子。

本試驗所用轉(zhuǎn)DREB1基因的T2代幼苗由前期PCR鑒定得到，用作鹽脅迫處理，分析植株表型、基因表達(dá)及進行生理性狀測定。

所有試驗均以豐花2號為對照（CK）材料。

超快新型植物 RNA 提取試劑盒（GK 系列）購自北京華越洋生物科技有限公司；SYBR Premix EX Taq（Perfect Real Time）、 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit均購自寶生物工程有限公司（TaKaRa）；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 T2代轉(zhuǎn)DREB1基因花生植株的PCR鑒定 采用上層育苗盤中河沙固定苗、下層水培盒中營養(yǎng)液提供營養(yǎng)的沙水結(jié)合方法種植T1代種子，單粒播，置于25℃、16 h光照條件下。待T2代植株長到兩片真葉展開時，用改良1/5 Hoagland營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，出苗7 d后編號，摘取幼葉進行基因組 DNA的PCR檢測，以確定轉(zhuǎn)基因單株。PCR鑒定標(biāo)記基因bar所用引物：bar-F：5′-GTCTGCACCATCGTCAAC-3′；bar-R：5′-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3′。

1.2.2 T2代轉(zhuǎn)DREB1基因植株的鹽脅迫處理 經(jīng)PCR鑒定的T2代轉(zhuǎn)基因植株培養(yǎng)至出苗21 d后，將維持轉(zhuǎn)基因和對照植株生長的營養(yǎng)液更換為含有1% NaCl的營養(yǎng)液進行鹽脅迫處理。

1.2.3 鹽脅迫下T2代轉(zhuǎn)基因植株表型鑒定 鹽脅迫0、4 d時照相記錄并觀察轉(zhuǎn)基因和對照植株的表型變化。

1.2.4 鹽脅迫下T2代轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)量鑒定 鹽脅迫0、1 h時取幼嫩葉，液氮冷凍，熒光定量PCR檢測AhDREB1基因表達(dá)量變化。具體操作步驟如下：

熒光定量模板cDNA的獲取：參照華越洋RNA快速提取試劑盒（GK系列）操作步驟并加以優(yōu)化進行花生葉片總RNA提取操作，并按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒操作說明進行RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA鏈。

熒光定量PCR特異引物為qDREB-F：5′-AATGTGGCTCGGAACTTAC-3′；qDREB-R：5′-GATTGGCTACGGCTTCAT-3′。18S rRNA作為內(nèi)參基因：18S rRNA-F：5′-GAAACGGCTACCACATCCAAG-3′；18S rRNA-R：5′-CCAACCCAAGGTCCAACTACG-3′。

參照寶生物試劑盒SYBR Premix EX Taq說明配制20 μL的qRT-PCR反應(yīng)體系，采用兩步法進行定量反應(yīng)。條件為： 95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)；60～95℃ 每0.3℃收集一次熒光信號。在ABI Step One Plus實時熒光定量PCR儀上進行擴增。

1.2.5 鹽脅迫下T2代轉(zhuǎn)基因植株生理性狀的測定 鹽脅迫0、6 h時取功能葉，液氮速凍，用于超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）、可溶性蛋白含量等生理性狀的測定。其中， SOD活性采用氮藍(lán)四唑光還原法（NBT）進行測定[17]； POD活性采用愈創(chuàng)木酚法進行測定[18]； MDA含量采用硫代巴比妥酸法（TBA）進行測定[17]；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法進行測定[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2003處理數(shù)據(jù)并作圖。

基因相對表達(dá)量=2-△△Ct [注： -ΔΔCt=-（ΔCt，a-ΔCt，b），Ct：熒光閾值；a：目的基因AhDREB1；b：內(nèi)參基因18S rRNA ]；

相對值=鹽脅迫后生理性狀測定值/鹽脅迫前生理性狀測定值；

增幅=鹽脅迫后生理性狀測定值-鹽脅迫前生理性狀測定值。

2 結(jié)果與分析

2.1 T2代轉(zhuǎn)DREB1基因花生植株的PCR檢測

試驗以157個T2代單株的葉片基因組DNA為模板進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性單株DNA擴增出分子量是424 bp的特異性目的條帶（圖1所示部分陽性單株），試驗共獲得24個轉(zhuǎn)DREB1基因花生單株。

24株轉(zhuǎn)基因單株被用于下一步鑒定鹽脅迫相關(guān)的生理性狀變化，其遺傳關(guān)系如表1所示。

2.2 鹽脅迫下T2代轉(zhuǎn)基因植株表型變化

鹽脅迫0 d時，T2代轉(zhuǎn)基因植株與豐花2號（CK）植株長勢旺盛且基本一致，植株的功能葉和老葉顏色呈深綠色，幼嫩葉及未展開葉顏色呈嫩綠色（圖 2A）。鹽脅迫4 d 后，植株生長狀況如圖 2B 所示。轉(zhuǎn)基因植株和CK植株均出現(xiàn)了不同程度的葉片萎蔫失綠變黃現(xiàn)象。轉(zhuǎn)基因植株萎蔫程度低，葉片保綠程度明顯高于對照；整株出現(xiàn)真葉閉合的感夜運動；植株的未展開葉受鹽脅迫傷害較小，衰老葉黃斑點逐漸由邊緣向中心蔓延，多數(shù)功能葉顏色呈綠色；雖然植株根系顏色變黃并且側(cè)根數(shù)目減少，主根根尖部位顏色些許變褐，但整體生長狀態(tài)較好。CK植株受鹽脅迫傷害程度大于轉(zhuǎn)基因植株，表現(xiàn)在CK的主莖及側(cè)枝的功能葉片已經(jīng)枯萎下垂，葉片存活數(shù)少于轉(zhuǎn)基因植株，部分葉片基部顏色呈發(fā)黃趨勢；主莖變褐色，根系顏色變成黑褐色，側(cè)根長及側(cè)根數(shù)目明顯低于轉(zhuǎn)基因植株。

2.3 鹽脅迫下T2代轉(zhuǎn)基因植株中AhDREB1基因表達(dá)量分析

鹽脅迫0 h時，轉(zhuǎn)基因植株（D146除外）中AhDREB1基因的表達(dá)量均高于CK；AhDREB1基因在不同轉(zhuǎn)基因單株的本底表達(dá)水平不盡相同，D380中表達(dá)量最高，是CK的 50.2 倍。鹽脅迫1 h后，轉(zhuǎn)基因植株和CK中AhDREB1 基因的表達(dá)量均上調(diào)，說明AhDREB1基因受鹽脅迫誘導(dǎo)；CK中AhDREB1基因的表達(dá)量增幅0.53，是脅迫0 h時的1.53倍；87.5%的轉(zhuǎn)基因植株中AhDREB1基因的表達(dá)量增幅在1.78～14.54，其中D254單株響應(yīng)鹽脅迫速度最快，增幅達(dá)14.54，而D188以較緩慢的速度響應(yīng)鹽脅迫（圖3）。

2.4 鹽脅迫下T2代植株耐鹽相關(guān)生理性狀分析

2.4.1 SOD 活性變化 鹽脅迫0 h時，轉(zhuǎn)基因和CK植株中SOD活性存在差異。大部分轉(zhuǎn)基因植株的SOD活性高于CK。鹽脅迫6 h后，轉(zhuǎn)基因和CK植株中 SOD活性幾乎都升高，其中D448中SOD 活性明顯高于CK，酶活升高率是CK的3.2倍，并且比脅迫0 h時升高了 254個酶活性單位，而D151中 SOD活性是CK的1.94倍（圖4）。

2.4.2 POD活性變化 鹽脅迫0 h時，轉(zhuǎn)基因植株的POD活性顯著高于CK，其中D254的POD活性是CK的3.7倍。鹽脅迫 6 h后，除D453、D184和D242外，其它植株中 POD活性都明顯升高；不同轉(zhuǎn)基因植株的POD活性升高了1.03～2.08倍，以D151葉片的POD 活性增幅最高，達(dá)12.7個酶活單位，是脅迫0 h的2.08倍；CK僅升高了1.4個酶活單位（圖5）。

2.4.3 MDA 含量變化 鹽脅迫0 h時，轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量與CK相比均處于低水平狀態(tài)。鹽脅迫6 h后，所有植株葉片細(xì)胞膜的膜脂過氧化水平都上升，膜系統(tǒng)受到傷害，但丙二醛含量增加幅度在植株間存在差異；CK葉片的MDA含量增幅是2.4，相對值是1.33；轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量增幅范圍為0.05～2.06，多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株的MDA 含量增幅都遠(yuǎn)低于CK（圖6）。

2.4.4 可溶性蛋白含量變化 鹽脅迫0 h時，75%的轉(zhuǎn)基因花生植株葉片中可溶性蛋白含量高于CK，其中D448的可溶性蛋白含量為10.4 mg/g，是CK的3.5倍；但D329的可溶性蛋白含量僅是CK的0.64倍。鹽脅迫6 h后，轉(zhuǎn)基因花生植株的可溶性蛋白含量均明顯增加，但增加速度存在差異； D153中可溶性蛋白含量升高速度最快，是脅迫0 h的2.5倍，脅迫后的CK僅升高了0.25 mg/g，相對值是1.08（圖7）。

3 討論與結(jié)論

本試驗在課題組前期獲得轉(zhuǎn)AhDREB1基因T1代花生植株的基礎(chǔ)上，以T2代轉(zhuǎn)基因單株為材料進行研究。發(fā)現(xiàn)鹽脅迫0 h時，T2代轉(zhuǎn)基因植株中AhDREB1基因表達(dá)量高于豐花2號（CK），鹽脅迫1 h后，轉(zhuǎn)基因植株響應(yīng)鹽脅迫速度比CK快。鹽脅迫 4 d 后，高鹽抑制了CK的根部和地上部生長，轉(zhuǎn)基因植株葉片保綠程度及根系生長狀況明顯優(yōu)于CK。證實DREB1基因在花生耐鹽通路中發(fā)揮了一定的作用。Bouaziz等[20]證明與野生型相比，轉(zhuǎn)StDREB1基因過表達(dá)的馬鈴薯植株具有較強的耐鹽抗旱性。這也與本試驗結(jié)果證實DREB1轉(zhuǎn)錄因子基因參與鹽脅迫響應(yīng)應(yīng)答一致。

酶促系統(tǒng)能降低植株體內(nèi)活性氧含量，從而延緩植株衰老，提高抗性。SOD 是活性氧清除系統(tǒng)中首要發(fā)揮作用的抗氧化酶，作用于活性氧大量生成的部位催化超氧離子的歧化反應(yīng)，SOD與POD等協(xié)同抵御過氧化物自由基對膜系統(tǒng)的損害[21]，在逆境中保護植物細(xì)胞膜。研究證明各抗氧化酶酶活與植物耐鹽性呈正相關(guān)[22， 23]。本研究得出轉(zhuǎn)AhDREB1基因花生植株的 SOD、POD活性和可溶性蛋白含量在鹽脅迫6 h 后均高于CK，MDA含量低于CK，表明轉(zhuǎn)基因植株的質(zhì)膜損傷程度低于CK。轉(zhuǎn)基因單株D380、D385中AhDREB1基因表達(dá)量在脅迫前后都高水平表達(dá)，鹽脅迫0 h時，其SOD、POD 活性和可溶性蛋白含量均高于CK，在經(jīng)鹽處理6 h后，其MDA含量低于CK，SOD、POD和可溶性蛋白性狀檢測值均高于CK。由于轉(zhuǎn)基因單株遺傳背景的差異致使單株間基因表達(dá)量和鹽脅迫相關(guān)生理性狀檢測值出現(xiàn)顯而易見的差異，即使同屬一株系如16D287-2株系中的9個陽性單株間也存在差異，推測是由外源片段插入位點不同所造成，有待于進一步試驗確認(rèn)。綜上結(jié)果分析，推測AhDREB1基因超表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因花生植株對鹽脅迫的耐受性。

本試驗從轉(zhuǎn)基因T2代單株的鹽脅迫后表型、AhDREB1基因表達(dá)量和抗氧化酶系統(tǒng)等相關(guān)分子及生理性狀變化中篩選出耐鹽性較好的4個轉(zhuǎn)基因單株，分別是D254、D380、D385和D448，為深入研究DREB1轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游靶基因表達(dá)及其耐鹽網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建提供了材料。

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