孔偉偉 韓燕 劉譯陽 李國(guó)衛(wèi) 萬書波 崔鳳

摘要：為探索鹽脅迫對(duì)花生硝酸鹽積累的影響，本研究測(cè)定了鹽處理花生葉片的硝酸鹽含量，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫抑制硝酸鹽的積累。進(jìn)一步對(duì)花生地下部和地上部樣品進(jìn)行RNA-seq分析，發(fā)現(xiàn)13個(gè)花生中響應(yīng)鹽脅迫的硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因。本研究揭示了鹽脅迫影響花生硝酸鹽積累的可能機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供了目標(biāo)基因。

關(guān)鍵詞：花生；硝酸鹽；鹽脅迫；硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；差異表達(dá)基因；表達(dá)量

中圖分類號(hào)：S565.201文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2018）06-0086-05

Abstract To understand the effects of salt stress on nitrate accumulation in peanut， we checked the nitrate contents in leaves under salt treatment， and found that salt stress inhibited the nitrate accumulation in peanut. Thirteen genes related to nitrate uptake， translocation and signal transduction in underground and aboveground samples were found response to salt stress by RNA-seq analysis. This study revealed the possible mechanism about how salt stress affecting nitrate accumulation in peanut and provided target genes for further research.

Keywords Peanut； Nitrate； Salt stress； Nitrate transporter； Differentially expressed genes； Expression level

植物在生長(zhǎng)過程中會(huì)受到各種生物脅迫和非生物脅迫的影響，鹽脅迫作為一種重要的非生物脅迫能夠?qū)е聺B透脅迫和離子毒害，影響植物生理和代謝的很多方面，威脅植物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量[1]。氮是組成核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)等基本生物分子結(jié)構(gòu)的必需組成元素，是植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要限制因子，也是影響作物產(chǎn)量的必需營(yíng)養(yǎng)元素。大多數(shù)陸生植物將硝酸鹽作為氮素的主要來源。鹽脅迫影響土壤中的硝化作用和氨化作用，可能影響植物對(duì)氮素的吸收和代謝[2]?；ㄉ鞘澜缥宕笥土献魑镏?，也是我國(guó)重要的油料作物和出口創(chuàng)匯產(chǎn)品?；ㄉ切璧^多的作物，外源氮肥對(duì)其生長(zhǎng)的促進(jìn)主要表現(xiàn)在提供氮素營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)多種含氮化合物如蛋白質(zhì)和核酸的形成，同時(shí)也促進(jìn)葉綠素合成、相關(guān)酶及光合作用的增加[3]。而花生是一種中度鹽敏感作物，產(chǎn)量受鹽脅迫影響嚴(yán)重。目前，鹽脅迫對(duì)花生硝酸鹽的積累、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)的研究還未見報(bào)導(dǎo)。本試驗(yàn)通過測(cè)定鹽脅迫下花生葉片的硝酸鹽積累量，并對(duì)鹽處理前后的花生地下部和地上部進(jìn)行RNA-seq檢測(cè)，旨在探索花生在鹽脅迫條件下對(duì)硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制并為遺傳改良提供目標(biāo)基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用花生品種為魯花14號(hào)，自供。

1.2 試驗(yàn)處理

將花生種子播在沙子中并置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照（200 μmol·m-2·s-1）16 h，相應(yīng)溫度為26℃；黑暗8 h，相應(yīng)溫度為24℃，濕度均保持在50%。待種子萌發(fā)8 d后將花生幼苗轉(zhuǎn)移到水培缽（盛有2 L Hoagland營(yíng)養(yǎng)液）中培養(yǎng)，每缽4株，每周更換營(yíng)養(yǎng)液。

花生苗齡18 d時(shí)進(jìn)行鹽脅迫處理，設(shè)置Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中分別加入100、150、200、300 mmol·L-1 NaCl進(jìn)行鹽脅迫，以未添加NaCl的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照。處理4 d后取倒3葉，充分干燥后進(jìn)行硝酸鹽測(cè)定。

依據(jù)硝酸鹽測(cè)定結(jié)果，設(shè)置Hoagland營(yíng)養(yǎng)液加入的鹽脅迫濃度為250 mmol·L-1NaCl，同樣以未添加NaCl的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液為對(duì)照。處理4 d后進(jìn)行地上部和地下部取樣用于表達(dá)譜分析，液氮速凍并保存在-80℃冰箱中備用。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 硝酸鹽含量測(cè)定 采用比色法測(cè)定硝酸鹽含量。取0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0 mmol·L-1標(biāo)準(zhǔn)濃度硝酸鹽溶液10 μL，加入90 μL硝酸還原酶，室溫反應(yīng)30 min。加入60 μL N-1奈乙二胺鹽酸和對(duì)氨基苯磺酰胺（N-1奈乙二胺鹽酸∶對(duì)氨基苯磺酰胺=1∶1）反應(yīng)2 h后，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)取樣葉片干燥后稱重，每份樣品中加入適量的0.1 mmol·L-1 鹽酸溶解硝酸鹽，后用水稀釋，取10 μL稀釋液作為待測(cè)樣品，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)樣品的硝酸鹽濃度，最后再根據(jù)稀釋倍數(shù)和樣品重量計(jì)算硝酸鹽含量。

1.3.2 樣品總RNA提取 250 mmol·L-1NaCl脅迫與對(duì)照樣品分別在液氮中研磨。根總RNA用Trizol試劑提取，葉片總RNA用CTAB法提取。使用Agilent 2100（Agilent Technologies）生物分析儀對(duì)RNA進(jìn)行質(zhì)量和定量分析。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜測(cè)序 分別取等量根和葉RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。建庫(kù)以后通過華大Illumina HiSeq TM 2000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序得到的raw reads過濾以后得到clean reads，clean reads被用來進(jìn)行de novo組裝，組裝軟件為Trinity。RNA-seq測(cè)序平臺(tái)為Ion ProtonTM system （Life Technologies）。差異表達(dá)基因通過NOISeq方法進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為log2ratio≥1 and probability ≥ 0.8。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對(duì)花生葉片硝酸鹽含量的影響

鹽脅迫處理下，花生葉片硝酸鹽含量隨鹽濃度升高逐漸降低。在100、150、200、300 mmol·L-1NaCl處理濃度下，葉片內(nèi)硝酸鹽含量分別比對(duì)照降低33.42%、49.57%、74.64%、81.84%（圖1）。表明鹽脅迫對(duì)花生硝酸鹽積累有抑制作用，且抑制作用隨鹽濃度升高而增強(qiáng)。

2.2 鹽脅迫對(duì)花生硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)的影響

為鑒定鹽脅迫對(duì)花生硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)的影響，從而明確造成花生硝酸鹽積累量下降的分子機(jī)制，本試驗(yàn)進(jìn)行了RNA-seq分析，并采用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)作為參考基因組。部分硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的表達(dá)量在鹽脅迫后發(fā)生了顯著變化。nitrate transporter（NRT1.1）基因 CL6501.Contig1和NRT2.4基因CL4824.Contig1、CL4824.Contig2在地下部的表達(dá)量均大幅度下降，NRT3.1基因Unigene16840在地下部的表達(dá)量下降，而NRT1.2基因CL6344.Contig2的表達(dá)量在地下和地上部均上升。NRT1.5基因Unigene19802和Unigene19803在地下部和地上部均被鹽脅迫大量誘導(dǎo)表達(dá)，尤其是在地上部，其表達(dá)被誘導(dǎo)至500倍左右。而另一個(gè)NRT1.5基因CL1925.Contig1在地下部表達(dá)量下降，地上部誘導(dǎo)不顯著（表1，圖2）。NRT1.4基因Unigene935只在地下部被鹽脅迫顯著誘導(dǎo)表達(dá)。NRT1.7基因Unigene24292在地下部和地上部均被誘導(dǎo)表達(dá)。SLAH3基因Unigene22279的表達(dá)在地上部顯著上升。TGA4基因Unigene18749在地下部的表達(dá)量顯著降低， TCP20基因CL10482.Contig1在地下和地上部的表達(dá)量均顯著下降（表1）。

3 討論與結(jié)論

硝酸鹽是農(nóng)田土壤中氮素的主要存在形式，也是陸生植物的主要氮素來源。鹽脅迫嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，使花生等作物減產(chǎn)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)鹽脅迫導(dǎo)致花生硝酸鹽積累減少，并且減少量隨鹽濃度的增加而增加；通過對(duì)鹽處理前后的花生地下部和地上部進(jìn)行RNA-seq分析可知，鹽脅迫對(duì)花生硝酸鹽積累的影響，可能是通過抑制硝酸鹽吸收基因?qū)崿F(xiàn)的。nitrate transporter（NRT） 1.1既是高親和性又是低親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其親和性的轉(zhuǎn)變依賴于101位的蘇氨酸的磷酸化[4]。NRT1.1在植物地下部和地上部均有分布，除介導(dǎo)硝酸鹽從外部的攝取和地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)外，還能介導(dǎo)硝酸鹽信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5-7]。NRT1.2是低親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，NRT2.4是高親和性硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，均介導(dǎo)硝酸鹽的攝入[8，9]。NRT3.1與除NRT2.7以外的NRT2家族蛋白相互作用并促進(jìn)其硝酸鹽攝入活性[10，11]。S-type anion channel SLAH3在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中介導(dǎo)硝酸鹽外排[12]。硝酸鹽作為多種生理活動(dòng)的關(guān)鍵信號(hào)因子，大約調(diào)控了10%的基因組表達(dá)，在這個(gè)過程中有一些調(diào)節(jié)因子參與了復(fù)雜的硝酸鹽反應(yīng)。TGA4和TCP20作為轉(zhuǎn)錄因子被報(bào)道在調(diào)節(jié)硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和同化作用基因方面起到重要作用[13]。

差異表達(dá)基因中，與硝酸鹽吸收相關(guān)的NRT1.1基因CL6501.Contig1、NRT2.4基因CL4824.Contig1、CL4824.Contig2，NRT3.1基因Unigene16840在地下部的表達(dá)量均顯著下降，只有NRT1.2基因CL6344.Contig2的表達(dá)量在地下和地上部均上升，而CL6344.Contig2在地下部的表達(dá)量相對(duì)于以上四個(gè)基因均較低，且誘導(dǎo)量不高，暗示硝酸鹽吸收減少，可能是這些基因表達(dá)協(xié)同作用的結(jié)果，而CL6344.Contig2可能在鹽脅迫條件下對(duì)花生進(jìn)行硝酸鹽攝取具有積極意義。硝酸鹽從土壤中吸收到根部之后，先被同化成銨，后是氨基酸。由于同化作用所需的碳骨架來自光合作用，所以氨基酸的合成主要發(fā)生在地上部分。硝酸鹽通過木質(zhì)部導(dǎo)管被從根部遷移至地上部分。NRT1.5在這個(gè)過程中起重要作用[14]。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)花生NRT1.5基因Unigene19802和Unigene19803在對(duì)照條件下地下部和地上部表達(dá)量均較低，但都被鹽脅迫大量誘導(dǎo)表達(dá)，尤其地上部的誘導(dǎo)倍數(shù)達(dá)到了500倍左右，暗示這兩個(gè)花生NRT1.5基因在鹽脅迫時(shí)對(duì)花生硝酸鹽從地下部轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部起到非常重要的作用，對(duì)是否能夠提高植物耐鹽性值得探討；而另一個(gè)NRT1.5基因CL1925.Contig1在對(duì)照條件下表達(dá)量較高，鹽處理后地下部表達(dá)量下降，地上部誘導(dǎo)不顯著，暗示這個(gè)基因除硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)功能，可能還具有硝酸鹽攝取功能。據(jù)報(bào)道NRT1.4基因在葉柄中表達(dá)，與調(diào)節(jié)葉片硝酸鹽平衡相關(guān)，NRT1.7被報(bào)道在將硝酸鹽從老葉片動(dòng)員到新生葉片的過程中起作用[15，16]，本試驗(yàn)中花生差異表達(dá)基因中的NRT1.4基因Unigene935只在地下部被鹽脅迫顯著誘導(dǎo)表達(dá)，暗示這個(gè)基因可能在鹽脅迫時(shí)具有新功能；差異表達(dá)基因中的NRT1.7基因Unigene24292在地下部和地上部均被誘導(dǎo)表達(dá)，暗示這兩個(gè)基因可能在鹽脅迫時(shí)具有其他功能。目前大部分硝酸鹽吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)控蛋白在植物鹽脅迫應(yīng)答中發(fā)揮的功能及分子機(jī)制仍知之甚少，針對(duì)這些基因進(jìn)一步的研究，有利于深入理解非生物脅迫條件下植物的應(yīng)答機(jī)制，從而為達(dá)到提高作物氮肥利用效率和耐逆性的目標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Munns R， Tester M. Mechanisms of salinity tolerance[J].Annu. Rev. Plant Biol.， 2008，59：651-681.

[2] Meng S， Su L， Li Y M， et al. Nitrate and ammonium contribute to the distinct nitrogen metabolism of Populus simonii during moderate salt stress[J]. PLoS ONE， 2016，11（3）： e0150354.

[3] 羅盛， 楊友才， 沈浦，等. 花生氮素吸收、根系形態(tài)及葉片生長(zhǎng)對(duì)葉面噴施尿素的響應(yīng)特征[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015，47（10）：45-48，59.

[4] Liu K H， TsayY F. Switching between the two action modes of the dual-affinity nitrate transporter CHL1 by phosphorylation[J].EMBO J.， 2003，22 （5）： 1005-1013.

[5] Remans T， Nacry P， Pervent M， et al. The Arabidopsis NRT1.1 transporter participates in the signaling pathway triggering root colonization of nitrate-rich patches[J].Proc. Natl. Acad. Sci.USA， 2006，103（50）：19206-19211.

[6] Noguero M， Lacombe B. Transporters involved in root nitrate uptake and sensing by Arabidopsis[J]. Front. Plant Sci.，2016 （7）：1391.

[7] Guo F Q， Wang R， Crawford N M. The Arabidopsis dual-affinity nitrate transporter gene AtNRT1.1 （CHL1） is regulated by auxin in both shoots and roots[J]. J. Exp. Bot.，2002，53 （370）：835-844.

[8] Huang N C， Liu K H， Lo H J， et al. Cloning and functional characterization of an arabidopsis nitrate transporter gene that encodes a constitutive component of low-affinity uptake[J]. Plant Cell， 1999，11（8）：1381-1392.

[9] Kiba T， Feria-Bourrellier A B， Lafouge F， et al. The Arabidopsis nitrate transporter NRT2.4 plays a double role in roots and shoots of nitrogen-starved plants [J]. Plant Cell， 2012，24 （1）：245-258.

[10]Li W B， WangY， Okamoto M， et al. Dissection of the AtNRT2.1：AtNRT2.2 inducible high-affinity nitrate transporter gene cluster[J]. Plant Physiol.， 2007，143（1）：425-433.

[11]Kotur Z， Mackenzie N， Ramesh S， et al. Nitrate transport capacity of the Arabidopsis thaliana NRT2 family members and their interactions with AtNAR2.1[J]. New Phytol.，2012，194（3）：724-731.

[12]Wang Y Y， Hsu P K，Tsay Y F. Uptake， allocation and signaling of nitrate[J]. Trends in Plant Science， 2012，17（8）：458-467.

[13]Kant S. Understanding nitrate uptake， signaling and remobilisation for improving plant nitrogen use efficiency[J]. Seminars in Cell & Developmental Biology， 2018，74：89-96.

[14]Lin S H， Kuo H F， Canivenc G， et al. Mutation of the Arabidopsis NRT1.5 nitrate transporter causes defective root-to-shoot nitrate transport[J]. Plant Cell，2008，20（9）：2514-2528.

[15]Chiu C C， Lin C S， Hsia A P， et al. Mutation of a nitrate transporter， AtNRT1：4， results in a reduced petiole nitrate content and altered leaf development[J]. Plant Cell Physiol.，2004，45（9）：1139-1148.

[16]Fan S C， Lin C S， Hsu P K， et al. The Arabidopsis nitrate transporter NRT1.7， expressed in phloem， is responsible for source-to-sink remobilization of nitrate[J]. Plant Cell， 2009，21（9）：2750-2761.