周迎春 劉少博 韓海濤 彭新然

摘 要：提供一種利用超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法快速測定動物源性食品中萬古霉素殘留量的方法。凍豬背膘、凍豬去骨前腿皮和凍豬去骨前腿肉樣品用0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）提取，所得提取液用水飽和正己烷除脂、MCX固相萃取柱凈化，凈化液經(jīng)氮吹濃縮、流動相定容后用UPLC-MS/MS儀測定。結果表明：在2.0～100.0 μg/L質量濃度范圍內，萬古霉素的線性關系良好，R2>0.999 9；該方法的最低檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg；在10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg 4 個添加水平下，3 種樣品中萬古霉素的回收率為70.05%～102.97%，相對標準偏差≤4.65%。該方法有效解決了樣品基質效應大、靈敏度低等問題，能夠保證分析結果的準確性，適用于動物源性食品，尤其是高脂肪含量的動物源性食品中萬古霉素的殘留量測定。

關鍵詞：萬古霉素；超高效液相色譜-串聯(lián)質譜；動物源性食品；正己烷脫脂；固相萃取

Abstract： A rapid method for the determination of vancomycin residues in animal-origin foods by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS-MS） was presented. The sample was extracted with 0.1% formic acid-acetonitrile （90：10， V/V）. The extract was degreased with n-hexane and cleaned up by solid phase extraction on an MCX column， concentrated by nitrogen blowing and diluted again with the mobile phase prior to being analyzed by UPLC-MS-MS. The calibration curve of vancomycin had a good linearity with a correlation coefficient higher than 0.999 9 in the concentration range of 2.0 to 100.0 μg/L. The detection limit of this method was 0.3 μg/kg， and the limit of quantification was 1.0 μg/kg. The recoveries of vancomycin in spiked samples ranged from 70.05% to 102.97% at spiked levels of 10.0， 20.0， 50.0 and 100.0 μg/kg， with relative standard deviations ≤ 4.65%. This method overcame the problems of high matrix effect and low sensitivity， thereby ensuring the accuracy and reproducibility of the results. This method was suitable for determination of vancomycin residues in animal-origin foods， especially high-fat animal-origin foods.

Keywords： vancomycin； ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； animal-origin foods； hexane degreasing； solid phase extraction

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201804010

中圖分類號：O657.63 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2018）04-0056-06

引文格式：

周迎春， 劉少博， 韓海濤， 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法快速測定動物源食品中萬古霉素殘留量[J]. 肉類研究， 2018， 32（4）： 56-61. 萬古霉素（分子式C66H75Cl2N9O24）屬于糖肽類抗生素，分子結構中含有1 個二氯三苯基醚結構單元、2 個糖基、多個氨基酸以及堿性的伯氨基團，呈弱堿性，易溶于水，難溶于有機試劑[1]。萬古霉素具有能引起耳、腎毒性[2-5]、皮膚過敏反應[6]、神經(jīng)系統(tǒng)毒性和器官功能紊亂[7]等副作用[8]，我國農業(yè)部第560號公告[9]規(guī)定萬古霉素為禁用獸藥。但由于萬古霉素具有良好的抗菌作用[10-12]，可以抑制細菌的生長和繁殖，對各種革蘭氏陽性球菌與桿菌均具有強抗菌作用[13]，在經(jīng)濟利益的驅動下，仍有不法分子將其用于動物疾病治療，甚至將其作為飼料添加劑用于預防非治療性疾病和促進牲畜生長等[14]。

目前，萬古霉素的主要檢測方法有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[15]、二維液相色譜（liquid chromatography，LC）法[16-17]、液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[18-19]、酶放大免疫分析法[20-22]、酶聯(lián)免疫法[23-24]、化學發(fā)光免疫法[25]、熒光偏振免疫法[26]、毛細管電泳化學發(fā)光法[27]、近紅外光譜法[28]及微生物法[29-30]等。相關研究多集中在醫(yī)藥衛(wèi)生領域，檢測對象多為人體或動物血液、腦脊液、飼料等樣品，而動物源性食品中萬古霉素的檢測方法也主要針對魚[31]、蝦[32]、乳[33]及乳制品[34]，對于脂肪含量較高、基質成分復雜的動物源性食品中萬古霉素的測定研究還非常少，且提供的方法相對復雜、靈敏度低[35]。相比于其他方法，超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法具有很好的定性能力，可以較好地排除基質干擾，具有較高的靈敏度。本研究利用UPLC-MS/MS法提供了一種更適合測定高脂肪含量動物源性食品中萬古霉素含量的方法，旨在解決動物源性食品基質復雜、易受其他雜質干擾及不易實現(xiàn)準確定性定量等問題[36]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

進口凍豬背膘（34 份）、凍豬去骨前腿皮（18 份）、凍豬去骨前腿肉（25 份）由河南進口肉類指定口岸漯河查驗區(qū)提供。

萬古霉素標準品（純度94.1%） 德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸（質譜純）、乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國Fisher Scientific公司；實驗用水為Millipore系統(tǒng)制得的高純水；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

6470超高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀、5982-9110固相萃取裝置 美國Agilent公司；MCX、SCX、PCX、HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，粒徑30 μm） 美國Waters公司；VX-Ⅲ渦旋振蕩器 北京踏錦科技有限公司；5810R離心機 德國Eppendorf公司；N-EVAP氮吹儀 美國Organomation公司；KQ 5200DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；XPE 205分析天平（感量0.01 mg） 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

標準儲備溶液配制：精密稱?。?0.63±0.01） mg萬古霉素標準品，用純水溶解并定容至100 mL，配制成質量濃度為100.0 μg/mL的標準儲備溶液，4 ℃條件下可保存1 個月。

標準中間溶液配制：準確吸取上述萬古霉素標準儲備溶液1.0 mL于100 mL棕色容量瓶中，用水稀釋成質量濃度為1.0 μg/mL的標準中間溶液，將此溶液轉移至儲液瓶中，4 ℃條件下可保存1 個月。

標準工作溶液配制：使用前根據(jù)需要將萬古霉素標準中間溶液用0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）稀釋成適當濃度的標準工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 提取

稱取制備好的樣品（2.00±0.01） g，加入20.0 mL 0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V），渦旋振蕩混勻，超聲提取20 min，然后在5 000 r/min條件下離心5 min，將全部上清液轉移至另一潔凈離心管中。

1.3.2.2 除脂

在1.3.2.1節(jié)得到的上清液中加入20.0 mL水飽和正己烷，渦旋振蕩混勻后，在5 000 r/min條件下離心5 min，取下清液，待凈化。

1.3.2.3 萃取凈化

依次用5.0 mL甲醇和5.0 mL 0.2 mol/mL鹽酸溶液活化MCX固相萃取柱后，取10.0 mL待凈化液上樣，控制流速為1～2 mL/min，棄去流出液；用5.0 mL甲醇淋洗除雜，棄去流出液；最后用5.0 mL 4%氨化甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，40 ℃氮氣吹干，用0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）定容至1 mL，過0.22 μm微孔濾膜，上機測定。

1.3.3 UPLC條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），流動相梯度洗脫程序如表1所示，柱溫35 ℃，進樣量10.0 μL。

1.3.4 MS條件

電噴霧離子源；正離子模式；多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流速6 L/min；毛細管電壓4 000 V；其他參數(shù)如表2所示。

1.3.5 標準曲線的繪制

將萬古霉素標準中間溶液用0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）稀釋成質量濃度分別為2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列標準工作溶液，上機測定。以色譜峰面積為縱坐標（y），相應的萬古霉素的質量濃度為橫坐標（x），得到萬古霉素的標準曲線和相關系數(shù)。

1.3.6 方法驗證

在陰性凍豬背膘、陰性凍豬去骨前腿皮和陰性凍豬去骨前腿肉樣品中添加適量萬古霉素標準工作液，制得萬古霉素的添加量分別為10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg的樣品，每個添加水平6 個平行樣品，計算回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），考察方法的準確度和精密度。

在空白樣品中添加系列質量濃度的標準工作溶液，以最低檢出濃度計算檢出限，在能夠定性分析的基礎上，以定量離子的信噪比不小于10為定量限，考察方法的靈敏度。

2 結果與分析

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)萬古霉素易溶于水、微溶于甲醇等有機溶劑這一性質[37]，提取溶劑以水為主要成分；考慮到動物源性食品中一般脂肪含量較高，為使樣品充分接觸提取溶劑，確保萬古霉素的充分提取，可在提取溶劑中加入適量既易溶于水又易溶于脂肪的極性溶劑。符合條件的常用有機溶劑有乙腈、乙醇和甲醇，但考慮到提取液脫脂時需要用到正己烷萃取技術，而乙醇又與正己烷混溶，不能達到較好的除脂效果，因此，本研究對比了10%乙腈水溶液和10%甲醇水溶液對進口凍豬背膘中萬古霉素的提取效率。結果表明，二者均能有效提取進口凍豬背膘中的萬古霉素。使用10%甲醇水溶液作為提取溶劑時，提取液相對比較渾濁，且提取液經(jīng)脫脂和固相萃取凈化后，目標物附近仍有較大的雜質峰，而使用10%乙腈水溶液作為提取溶劑時則沒有觀察到明顯的干擾峰，這可能是由于與甲醇相比，乙腈的極性相對較強，不容易溶解太多進口凍豬背膘中的非極性雜質，從而減少了干擾峰的出現(xiàn)。

本研究進一步對比了純水、5%乙腈水溶液、10%乙腈水溶液和20%乙腈水溶液對進口凍豬背膘中萬古霉素的提取效率，結果表明，10%乙腈水溶液作為提取試劑時的提取效率最高。最后，本研究對比了10%乙腈水溶液、0.05%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）、0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）和0.2%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）對進口凍豬背膘中萬古霉素的提取效率，結果表明，0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）作為提取試劑時，進口凍豬背膘中萬古霉素的提取效果最好。

綜上所述，本研究選取0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液（90∶10，V/V）作為動物源性食品中萬古霉素測定時的提取溶劑，此條件下得到的提取液經(jīng)脫脂和固相萃取凈化后，目標物附近無明顯的干擾峰，峰型好，回收率高。

2.1.2 脫脂技術的選擇

動物源性食品中不可避免會存在脂肪，特別是凍豬背膘、豬腩等動物源性食品，其脂肪含量可達50%以上，大量脂肪的存在會嚴重影響固相萃取柱的柱效，因此，在固相萃取凈化之前，有必要對提取液進行脫脂處理。正己烷具有很好的脫脂及去除其他干擾雜質的效果，由于正己烷與水有少量互溶，提取溶劑中又含有大量水，且萬古霉素易溶于水，為避免萃取時造成萬古霉素的損失，宜采用水飽和正己烷去脂。本研究對比了冷凍脫脂和水飽和正己烷脫脂技術的脫脂效果，結果表明，使用水飽和正己烷脫脂更徹底，脫脂后的提取液更加澄清，固相萃取凈化時不易造成柱堵塞。

2.1.3 固相萃取小柱的選擇

由于萬古霉素是一種偏堿性的三環(huán)糖肽類抗生素[38]，因此宜選擇陽離子交換型固相萃取小柱對脫脂后提取液進行凈化，以除去中性和酸性干擾物，吸附和保留目標物。本研究分別選取MCX、SCX、PCX、HLB柱進行固相萃取，通過對比色譜峰及回收率得出，MCX柱的保留效果和凈化效果最好。

2.1.4 UPLC流動相與色譜柱的選擇

在流動相中加入適量甲酸，可以在萬古霉素離子化過程中提供質子，增加其響應強度，因此本研究選取0.1%甲酸水溶液和乙腈作為流動相。

分別對比Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）與Eclipse Plus C8 RRHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）液相色譜柱對萬古霉素的分離效果，結果表明，使用C18液相色譜柱時，萬古霉素峰型更好，可以形成尖的對稱峰，且響應值更高，故選擇C18液相色譜柱對萬古霉素進行定量分析。在此條件下，100 μg/L萬古霉素標準溶液的總離子流圖及提取離子色譜圖如圖1所示。

2.1.5 主要MS參數(shù)的確定

萬古霉素分子結構中存在多個伯胺基和叔胺基，這使其在離子化過程中容易得到質子，在正電離時具有較高的信號強度，因此，本研究選擇電噴霧離子源，正離子模式。通過全掃描可知，萬古霉素在正電離時形成[M+2H]2+的準分子離子峰[39]，母離子的質荷比（m/z）為725.4；通過子離子掃描可知，萬古霉素的定量離子m/z為144.2，定性離子m/z分別為1 307.0和100.0。在全掃描和子離子掃描的同時優(yōu)化各項MS參數(shù)，在優(yōu)化好的MS參數(shù)條件下，采用MRM模式對樣品進行定量測定。在優(yōu)化好的條件下，100 μg/L萬古霉素標準溶液的質譜圖如圖2所示。

2.2 標準曲線方程及相關系數(shù)

在本研究方法的條件下，萬古霉素在2 min內快速出峰。在2.0～100.0 μg/L質量濃度范圍內，萬古霉素的線性方程為y=301.899 3x-1.398 5，R2≥0.999 9，線性關系良好。

2.3 方法的回收率、精密度和靈敏度

由表3可知：在10.0、20.0、50.0、100.0 μg/kg 4 個添加水平時，凍豬背膘中萬古霉素的回收率在70.05%～76.65%之間，RSD為1.41%～4.65%；凍豬去骨前腿皮中萬古霉素的回收率在90.65%～102.97%之間，RSD為1.99%～3.74%；凍豬去骨前腿肉中萬古霉素的回收率在79.14%～100.50%之間，RSD為2.74%～4.19%。陰性凍豬背膘樣品的色譜圖和萬古霉素添加量為50.0 μg/kg的陰性凍豬背膘樣品的總離子流圖及提取離子色譜圖如圖3～4所示。

以最低檢出濃度計算，凍豬背膘凍、豬去骨前腿皮和凍豬去骨前腿肉中萬古霉素的檢出限分別為0.5、0.3、0.3 μg/kg，定量限分別為1.5、1.0、1.0 μg/kg。

本研究的檢出限與定量限與梁玉禧等[40]的研究結果相同，但本研究所提供方法的稱樣質量僅為2.00 g，而梁玉禧等[40]的研究中稱樣質量為10.00 g；另外，本研究所提供的方法精密度更高、回收率更好。王玉琴等[8]提供的方法的檢出限與定量限略高于本研究，但本研究的稱樣質量更少，精密度和回收率也遠遠高于前者。此外，本研究所提供的方法在用于檢測脂肪含量較高、基質更復雜的凍豬背膘等樣品時依然具有很好的準確度和精密度，符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》[41]對于新方法確證的標準要求。

2.4 實際樣品測定

為進一步確認本研究方法的可行性和可靠性，將其用于測定由河南進口肉類指定口岸漯河查驗場提供的共計77 份樣品，其中包括34 份進口凍豬背膘、18 份進口凍豬去骨前腿皮及25 份進口凍豬去骨前腿肉。所有樣品均未檢出萬古霉素，表明本研究方法適合用于動物源性食品中萬古霉素殘留量的檢測。

3 結 論

本研究采用固相萃取技術和UPLC-MS/MS相結合的分析方法，解決了動物源性食品，特別是脂肪含量較高的動物源性食品基質干擾嚴重、靈敏度低等難題，且方法操作簡單、方便、成本低、準確度高、檢出限低、穩(wěn)定性好，能夠有效保證分析結果的重復性，適用于批量檢測動物源性食品中萬古霉素的殘留量，可以較好地滿足實際工作的需要。

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