李欣虹 鄭若愚 辜彥霏 陶思邑 任志華 王亞超 鄧俊良*

(1.四川農業(yè)大學動物醫(yī)學院，成都 611130；2.西南科技大學，綿陽 621010)

玉米赤霉烯酮(ZEA)又稱F-2毒素，是由鐮刀菌(主要是禾谷鐮刀菌，此外還有三線鐮刀菌、木賊鐮刀菌、雪腐鐮刀菌以及粉紅鐮刀菌等)產生的一種類雌激素樣霉菌毒素，在霉變的谷類作物和動物性食品中廣泛存在。ZEA可促進細胞凋亡。Kim等[1]研究發(fā)現，ZEA可導致小鼠精細胞嚴重損害，出現不同程度的凋亡小體，且隨著作用時間延長和濃度增加而加重，精原細胞和精母細胞表現更明顯。余增麗等[2]對乳腺癌的MCF-7細胞研究發(fā)現ZEA對細胞的增殖活性是通過調節(jié)B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)基因和Bcl-2相關X蛋白(Bax)基因的表達抑制了細胞凋亡所獲得的，且ZEA可以顯著提高細胞色素P450家族1亞科A多肽1(CYP1A1)酶的活性及其mRNA表達。鄧友田等[3]也研究得出ZEA能夠促進Bc1-2 mRNA和蛋白表達，而抑制Bax的表達，ZEA可提高人乳腺癌細胞系——MCF27細胞增殖活力并促進有絲分裂指數，并通過對Bc1-2和Bax表達的調節(jié)作用，抑制雌激素耗盡所誘導的MCF27細胞凋亡。符達[4]給大鼠飼喂不同劑量的ZEA發(fā)現，ZEA可對大鼠p53基因第8外顯子的構象產生影響，導致外顯子中2個條帶上堿基對出現以嘧啶與嘌呤的互換突變?yōu)橹鞯耐蛔?。而p53基因與細胞周期生長的調節(jié)、細胞轉化的調節(jié)、DNA復制及誘導程序性死亡有密切關系，p53基因通過Bal-2家族作用調控細胞凋亡[5]。在Yu等[6]關于ZEA誘導小鼠RAW264.7巨噬細胞死亡機制的研究中，ZEA染毒處理導致細胞線粒體膜電位的損失及Bcl-2和Bax蛋白在線粒體的變化，細胞質釋放細胞色素C和凋亡誘導因子，過氧化氫酶抑制ZEA誘導RAW264.7細胞減少。

ZEA作用于免疫系統(tǒng)的主要靶器官是脾臟，可導致脾臟淋巴細胞凋亡，進而使機體免疫功能降低。馬勇江等[7]研究ZEA對離體培養(yǎng)脂多糖活化小鼠脾臟淋巴細胞具有顯著促凋亡作用，且促進強度與其劑量呈依賴性關系。但目前關于ZEA對雞脾臟細胞凋亡方面的研究較少。因此，本研究以原代培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞為模型，從細胞水平上研究鐮刀菌毒素ZEA染毒對雞脾臟淋巴細胞的凋亡及其調控基因的影響，以便闡明ZEA染毒對雞脾臟淋巴細胞的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗動物：東北農業(yè)大學動物醫(yī)學院動物中心提供的40～60日齡健康的伊莎公雞。

胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)、ZEA及無酚紅的RPMI1640培養(yǎng)基均購自Sigma公司；細胞凋亡檢測試劑盒[用異硫氰酸熒光素標記的膜聯蛋白V(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)雙染]購自ACTGene公司；2′,7′-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(DCFH-DA)與羅丹明123(Rh123)購自Sigma公司；Trizol試劑盒、M-MLV反轉錄酶、DNA抽提試劑盒及RNA酶均購自Invitrogen公司；rTaq酶等PCR反應試劑購自TaKaRa(大連)生物公司；溴化乙錠(EB)購自Sigma公司；雞的Bax、Bak-1、Bcl-2、p53及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測試劑盒均購自上海生工生物公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 脾臟淋巴細胞懸液的制備、培養(yǎng)及處理

在無菌條件下，將雞脾臟取出，放入盛有磷酸鹽緩沖液(PBS)的培養(yǎng)皿里，用PBS輕輕洗滌脾臟周圍的血液殘渣，仔細剝去脾臟周圍結締組織，將其移入另一個盛有PBS并浸泡有200目網篩的培養(yǎng)皿中，用鑷子將脾臟放在200目銅網上，用20 mL一次性注射器的內芯輕輕研磨，過濾，將濾液適當稀釋成一定濃度的細胞懸液，再將細胞懸液移入預先裝有雞淋巴分離液離心管里，即緩緩以1∶1體積比將細胞懸液移入到雞淋巴分離液上層，2 000 r/min常溫離心15 min，用巴氏吸管移取淋巴細胞，加入冷的PBS洗滌，1 500 r/min 4 ℃離心5 min，棄去上清液，加入不含毒素的RPMI1640完全培養(yǎng)液(加FBS)再洗滌1次，重懸，計數，并用臺盼藍檢測細胞活力大于95%。

前期試驗已檢測染毒48 h時，ZEA的半抑制濃度(IC50)為(23.91±4.96) μg/mL。通過IC50篩選出ZEA的作用濃度為對照組0、Z1組0.10 μg/mL、Z2組0.40 μg/mL、Z3組1.60 μg/mL、Z4組6.25 μg/mL和Z5組25.00 μg/mL[8]。

1.2.2 流式細胞儀測定細胞凋亡率和壞死率

染毒培養(yǎng)48 h時，收集細胞，1 500 r/min離心3 min，用PBS洗滌細胞3次。離心后，加500 μL Binding Buffer制備細胞懸液，再加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光反應5～15 min，用流式細胞儀測定細胞凋亡率和細胞壞死率，同時以不加Annexin V-FITC及PI作為試劑對照。激發(fā)波長為488 nm，Annexin V-FITC的綠色熒光通過異硫氰酸熒光素(FITC)通道(FL-1，530 nm)檢測，PI的紅色熒光通過PI通道(FL-2，585 nm)檢測。每個樣品以10 000個細胞計數進行統(tǒng)計，數據由流式細胞儀的標準計算機程序分析獲得。

1.2.3 細胞內活性氧(ROS)含量的測定

染毒培養(yǎng)48 h，收集細胞，1 500 r/min離心3 min，后用PBS洗滌細胞3次。選用對細胞內過氧化氫(H2O2)特異性結合的熒光染料DCFH-DA對細胞內ROS進行檢測，用PBS懸浮細胞，加入DCFH-DA染液使其終濃度為100 μmol/L，混勻，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌3次，在流式細胞儀測定其平均熒光強度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)。

1.2.4 細胞線粒體膜電位的測定

染毒培養(yǎng)48 h，收集細胞，1 500 r/min離心3 min，后用PBS洗滌細胞2～3次。選用對線粒體特異性結合的熒光染料羅丹明123對線粒體膜電位進行檢測，用PBS懸浮細胞，加入羅丹明123染液使其終濃度為5 μg/mL，混勻，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌3次，在流式細胞儀測定其平均熒光強度(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm)。

1.2.5 上清液中Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3含量測定(ELISA法)

染毒培養(yǎng)48 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min離心20 min，吸取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?，按ELISA試劑盒說明書測定上清液中Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3的含量。

1.2.6 細胞內凋亡調控基因Bc1-2、p53、Bax、Bak-1及caspase-3的mRNA表達測定

按RNA提取試劑盒說明書操作，最終獲得組織總RNA；取組織總RNA適量，按PrimeScript RT-PCR Kit說明書進行反轉錄，將提取的RNA轉化為cDNA，cDNA保存于-80 ℃?zhèn)溆没蛄⒓从糜赑CR。根據GenBank中發(fā)表的雞的β-肌動蛋白(β-actin)、Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3的全基因序列，應用Prime 5.0軟件設計特異的上、下游引物，并經GenBank Blast進行同源性檢索后由Invitrogen公司(上海)合成。引物序列及參數見表1。

表1 引物序列及參數Table 1 Primer sequences and parameters

相關基因cDNA的PCR反應體系包括cDNA、上游與下游引物、高保真酶、Premix和ddH2O，反應條件為95 ℃預變性30 s，按95 ℃ 變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)，4 ℃終止反應；取PCR擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳2 h，凝膠成像儀拍照記錄PCR結果。

1.3 數據分析

采用REST軟件(Pfaffl)分析毒素處理樣品各目的基因mRNA的表達豐度，應用SPSS 13.0軟件對數據進行顯著性F檢驗及相關性分析；其中上述各項指標的測定重復3個不同批次的細胞，每批細胞每個樣本重復3次，數據以平均值±標準差表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 ZEA對雞脾臟淋巴細胞凋亡率和壞死率的影響

ZEA對雞脾臟淋巴細胞凋亡率和壞死率的影響見表2。ZEA染毒時，細胞凋亡率各組間差異顯著(P<0.05)。細胞壞死率除Z2組和Z3組差異不顯著(P>0.05)外，其余各組間差異均極顯著(P<0.01)。當ZEA濃度達到6.25 μg/mL以上，細胞凋亡和壞死均有所減緩。

除Z5組較Z4組淋巴細胞的凋亡率和壞死率均有所下降外，其余試驗組的細胞凋亡率和壞死率均隨ZEA濃度的升高而升高，各ZEA組細胞凋亡率和壞死率均極顯著高于對照組(P<0.01)；且同濃度下，脾臟淋巴細胞的凋亡率均高于壞死率，表明ZEA染毒主要導致脾臟淋巴細胞凋亡。

2.2 ZEA對雞脾臟淋巴細胞內ROS含量與線粒體膜電位的影響

ZEA對雞脾臟淋巴細胞內ROS含量與線粒體膜電位的影響見表3。ZEA染毒48 h，雞脾臟淋巴細胞ROS含量隨毒素濃度的升高而增加，各ZEA組ROS含量極顯著高于對照組(P<0.01)；而線粒體膜電位隨毒素濃度的升高而降低(Z3組除外)，各ZEA組線粒體膜電位極顯著低于對照組(P<0.01)。ROS含量除Z3組與Z4組間差異不顯著(P>0.05)外，其余各組間差異顯著(P<0.05)；ZEA組間線粒體膜電位差異顯著(P<0.05)。

表2 ZEA對雞脾臟淋巴細胞凋亡率和壞死率的影響Table 2 Effects of ZEA on the apoptotic rate and necrotic rate of chicken splenic lymphocytes %

同列數據肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。
In the same column, values with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 ZEA對雞脾臟淋巴細胞內ROS含量與線粒體膜電位的影響Table 3 Effects of ZEA on intracellular ROS content and mitochondrial membrane potential in chicken splenic lymphocytes

2.3 ZEA對雞脾臟淋巴細胞培養(yǎng)上清液中Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3含量的影響

ZEA對雞脾臟淋巴細胞培養(yǎng)上清液中Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3含量的影響見表4。針對Bcl-2含量，除Z1組與Z2組間差異不顯著(P>0.05)外，其余各組間差異均極顯著(P<0.01)；針對p53含量，各組間均差異顯著(P<0.05)；針對Bax含量，Z1組、Z2組、Z3組和對照組之間差異均不顯著(P>0.05)，Z4組和Z5組之間及與上述各組間差異極顯著(P<0.01)；針對Bak-1含量，各組間差異均顯著(P<0.05)；針對caspase-3含量，除Z3組和Z4組間差異不顯著(P>0.05)外，其余各組間均差異顯著(P<0.05)。

由此表明，p53、Bax、Bak-1和caspase-3含量隨毒素濃度的升高而增加，Bcl-2含量隨毒素濃度的升高而降低，具有顯著的劑量依賴關系。

2.4 ZEA對雞脾臟淋巴細胞Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3 mRNA表達的影響

ZEA對雞脾臟淋巴細胞Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3 mRNA表達的影響見表5。針對Bcl-2 mRNA表達量，Z1組、Z2組和Z3組間Bax/Bcl-2值差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于對照組(P<0.05)，Z4組和Z5組極顯著高于其他各組(P<0.01)；針對p53 mRNA表達量，各ZEA組極顯著高于對照組(P<0.01)；針對BaxmRNA表達量，各組間差異顯著(P<0.05)；針對Bak-1 mRNA表達量，除Z2組和Z3組間差異不顯著(P>0.05)外，其余各組間差異極顯著(P<0.01)；針對caspase-3 mRNA表達量，對照組、Z1組、Z2組和Z3組間差異不顯著(P>0.05)，Z4組和Z5組極顯著高于其他各組(P<0.01)，且2組間差異極顯著(P<0.01)。

由此表明，除caspase-3 mRNA表達量在Z1組、Z2組和Z3組略小于對照組外，Bax/Bcl-2值以及Bax、Bak-1和caspase-3的mRNA表達量隨毒素濃度的升高而增加，具有顯著的劑量依賴關系。

表4 ZEA對雞脾臟淋巴細胞培養(yǎng)上清液中Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3含量的影響Table 4 Effects of ZEA on contents of Bc1-2, p53, Bax, Bak-1 and caspase-3 in supernatants of chicken splenic lymphocytes

表5 ZEA對雞脾臟淋巴細胞Bc1-2、p53、Bax、Bak-1和caspase-3 mRNA表達的影響Table 5 Effects of ZEA on mRNA expression of Bc1-2, p53, Bax, Bak-1 and caspase-3 in chicken splenic lymphocytes

3 討 論

本實驗室前期研究表明，ZEA在體內試驗中可以誘導小鼠腎臟細胞、腦細胞和肝臟細胞的凋亡[8-11]，在體外試驗中可以誘導豬脾臟淋巴細胞凋亡[12]。在本試驗中，ZEA可以誘導體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞凋亡，結果和前期試驗結果一致。

線粒體在氧化代謝過程中產生大量ROS。在自由基產生過多或抗氧化防御系統(tǒng)作用減弱時，機體不能有效清除線粒體內ROS，造成蓄積，過量蓄積的ROS可氧化線粒體滲透性轉運孔上的相應氧化還原敏感位點，導致線粒體膜電位降低、線粒體腫脹和進一步產生ROS，進而造成線粒體的氧化損傷[13]。本研究結果表明ZEA染毒使雞脾臟淋巴細胞內ROS大量積累，線粒體膜電位極顯著下降，和上述研究一致。

細胞凋亡的信號傳導途徑是經過特殊的死亡信號激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶系統(tǒng)來實現的[14]。caspase-3是在多種誘導劑刺激后導致凋亡的關鍵酶，它的活化預示著細胞凋亡執(zhí)行階段的開始。正常情況下，它以酶原形式存在于胞質中，當細胞接受凋亡刺激時，它被系列反應激活，進而誘導細胞發(fā)生凋亡[15-17]。ZEA可誘導豬卵巢顆粒細胞凋亡依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶凋亡通路[18]。本研究結果顯示，ZEA能夠誘導體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細胞caspase-3的mRNA表達量增加，分泌在上清液中的caspase-3蛋白也增加，且呈劑量效應關系，和上述試驗結果一致。

在細胞凋亡過程中，p53蛋白起著至關重要的作用。p53蛋白主要集中于核仁區(qū)，能與DNA特異結合，具有明顯的細胞轉化抑制作用，對保護細胞基因組DNA的完整性具有重要作用。如果DNA受到外來損傷，p53可作為轉錄因子誘導一系列下游基因的表達，介導細胞停止在G期，使DNA有足夠的時間得到修復。如果DNA損傷嚴重，修復失敗、并且不可逆則p53啟動凋亡程序誘導細胞凋亡[19]。Ayed Boussema等[20]研究ZEA對人的肝細胞是激活p53，通過p53途徑以劑量依賴方式誘導細胞凋亡。Yu等[6]研究ZEA對RAW264.7巨噬細胞的毒性作用，其中p53的激活起到了關鍵作用。Bouaziz等[21]研究ZEA對人的肝癌細胞的毒性，得出ZEA引發(fā)p53依賴的凋亡通路致細胞凋亡的分子機制。本試驗結果也表明ZEA從基因水平改變了雞脾臟淋巴細胞p53的表達，干擾了p53凋亡通路的調控，從而誘發(fā)雞脾臟淋巴細胞凋亡。

Bcl-2家族蛋白在調節(jié)通過線粒體使細胞凋亡過程中起著至關重要的作用，Bcl-2蛋白主要分布于線粒體膜、核膜及內質網膜上，參與維持線粒體膜的完整性，防止細胞色素C的釋放，阻止凋亡的“內源性激活”，是細胞的抗凋亡成員[22]。當Bax形成同源二聚體Bax-Bax時，誘導細胞凋亡，隨著Bcl-2表達量的上升，越來越多的Bax二聚體分開，與Bcl-2形成比Bax-Bax二聚體更穩(wěn)定的Bax-Bcl-2的異二聚體，從而中和了Bax-Bax二聚體調節(jié)細胞凋亡的作用，即細胞內Bax/Bcl-2的值對于決定細胞接受刺激信號后存活與否起關鍵作用。Bcl-2過量表達細胞存活，Bax過量表達則細胞凋亡[23]。Yuan等[24]研究得出ZEA誘導小鼠雄性生殖細胞的凋亡基因Bax的mRNA的表達增加，Bcl-2的mRNA表達減少。Yu等[25]研究ZEA對人的乳腺癌MCF-7細胞的研究，發(fā)現ZEA顯著抑制細胞凋亡，存在劑量依賴性，Western blot和多重RT-PCR分析顯示，抗凋亡的Bcl-2蛋白和mRNA水平上調，促凋亡的Bax下調，說明ZEA具有雌激素活性，并能促進MCF-7細胞通過細胞周期由G0/G1期減少和S期的顯著增加的進展，通過Bcl-2表達調控抑制細胞凋亡。本試驗結果顯示，在ZEA對雞脾臟淋巴細胞作用下，Bak-1的表達均有所升高，Bax/Bcl-2值也增加，其蛋白含量也隨之增加或減少。

4 結 論

① 本試驗表明，隨ZEA濃度升高，細胞凋亡調控蛋白p53、Bax、Bak-1和caspase-3的含量升高，Bcl-2含量卻下降；ZEA上調Bcl-2家族基因(Bax和Bak-1)、p53基因和caspase-3基因表達，抑制Bcl-2家族基因中Bcl-2基因表達。

② ZEA通過激活p53和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶通路而誘導細胞凋亡增加，并且凋亡是由氧化應激引起。