葉善平，李太原，鐘武，張磊，方傳發(fā)，夏來陽

(1 贛州市人民醫(yī)院，贛州341000；2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

結(jié)直腸癌(CRC)是一種常見的消化道惡性腫瘤，對人類健康存在嚴重威脅，臨床確診時多處于中晚期[1]。治療方案仍是以手術(shù)為主的綜合治療模式，其中術(shù)前新輔助化療的重要性受到越來越多重視，可以提高根治切除率和延長患者生存期，但同一方案在不同個體間療效卻大相徑庭[2]。大多數(shù)化療藥物阻止腫瘤的生長是通過破壞腫瘤細胞的DNA，而腫瘤細胞卻可通過增強DNA修復(fù)來產(chǎn)生耐藥。DNA切除修復(fù)交叉互補基因-1(ERCC1)是與DNA修復(fù)密切關(guān)聯(lián)的基因，與腫瘤的耐藥相關(guān)[3]。相關(guān)研究顯示，肺癌、頭頸部癌、胃癌等惡性腫瘤中，ERCC1表達升高提示患者對鉑類化療藥物的療效較差[4, 5]。本研究通過RT-qPCR技術(shù)檢測化療前結(jié)直腸癌組織內(nèi)ERCC1 mRNA水平，分析其與結(jié)直腸癌患者術(shù)前XELOX方案新輔助化療療效的相關(guān)性，為臨床個體化治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年6月～2014年8月在南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理證實為結(jié)直腸癌的42例初治患者的新鮮腸鏡標本(癌組織及癌旁正常組織)，臨床病理資料完整，知曉并同意行術(shù)前XELOX方案新輔助化療，美國東部腫瘤協(xié)作組(ECOG)評分≤2分，已通過醫(yī)院倫理委員會審核。42例患者中男25例、女17例，年齡31～64歲、中位年齡49歲。

1.2 治療方法 患者均接受3個周期奧沙利鉑+卡培他濱(XELOX)方案術(shù)前新輔助化療。按體表面積給藥(奧沙利鉑130 mg/m2，靜滴2 h，第1天；卡培他濱1 000 mg/m2，口服，2次/d，第1～14天)，3周后重復(fù)。化療結(jié)束后第4周復(fù)查增強CT、MRI和腸鏡，采用RECIST實體瘤療效評定標準[6]評價療效，完全緩解(CR)和部分緩解(PR)為有效組，病情穩(wěn)定(SD)和疾病進展(PD)為無效組。

1.3 組織中ERCC1 mRNA表達水平的檢測 采用RT-qPCR法。48例患者均初診時取腸鏡活檢組織4塊迅速置入經(jīng)DEPC水(1 g/L)處理過的EP管中,標記后放入液氮罐保存。①總RNA提?。?2例樣本均冰凍切片6張，光學(xué)顯微鏡標記腫瘤密集區(qū)，以確保有足夠的RNA，采用TRIzol試劑(購自Invitrogen公司)提取總RNA，取RNA提取液2 μL，用紫外分光光度計UV-2800AH檢測RNA濃度，OD260/OD280比值1.8～2.0；②基因組cDNA合成：采用TaKaRa RR047A(PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按試劑盒說明書步驟把上述總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)液于-20 ℃保存。③qPCR：采用TaKaRa RR420A(SYBR@ Premix Ex Taq)試劑盒，PCR反應(yīng)體系為20 μL：SYBR@Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) 10 μL，PCR Forward/ Reverse Primer各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL，上述cDNA 2.0 μL，dH2O 6.8 μL，樣品管和內(nèi)參管均設(shè)3個復(fù)管。使用ABI StepOnePlusTM型熒光定量PCR儀進行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s。其中ERCC1和β-actin引物序列在Genbank數(shù)據(jù)庫查找，用Premier 5.0軟件設(shè)計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。目的基因ERCC1正向引物5′-GGGAATTTGGCGACGTAA-3′，反向引物5′-GCGGAGGCTGAGGAACA-3′；參照基因β-actin正向引物5′-GAGCGCGGCTACAGCTT-3′，反向引物5′-TCCTTAATGTCACGCACGA-3′。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒均購自TaKaRa公司。ABI StepOnePlusTMSDS Software自動分析熒光信號并將其轉(zhuǎn)換Ct值。Ct值取三個復(fù)管的平均值。ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值的差值，ΔΔCt=ΔCt-(陰性對照樣品Ct值-內(nèi)參Ct值)，基因相對表達量以2-ΔΔCt表示。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者XELOX方案新輔助化療療效 接受3個周期化療者42例，其中CR 2例、PR 22例、SD 7例、PD 11例，化療有效率為57.14%。有效組24例，無效組18例。

2.2 結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中ERCC1表達水平比較 結(jié)直腸癌患者癌組織中均有ERCC1 mRNA表達，擴增曲線呈現(xiàn)典型的S型，溶解曲線呈單峰狀，排除了非特異性擴增，表達水平0.92～6.53，均值約為3.10。癌旁正常組織表達水平2.14～7.88，均值為4.9。兩者比較,P<0.05。

2.3 癌組織中ERCC1表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 ERCC1 mRNA表達水平與結(jié)直腸癌患者性別、年齡、分化程度、是否穿透臟層腹膜、腫瘤大體類型、ECOG評分無關(guān)(P均>0.05)，與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 癌組織中ERCC1表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與結(jié)直腸癌患者化療療效的關(guān)系 淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者新輔助化療有效率為53.3%(16/30)，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患者的化療有效率為66.7%(8/12)。兩者比較,χ2=0.622,P>0.05。

2.5 ERCC1表達與結(jié)直腸癌患者化療療效的關(guān)系 有效組ERCC1 mRNA表達水平為2.332±0.370，無效組為4.113±1.673。有效組低于無效組(P<0.05)。

3 討論

目前，新輔助化療已成為治療中晚期結(jié)直腸癌的主要方法，主流化療方案以氟尿嘧啶類藥物及鉑類藥物為基礎(chǔ)。相關(guān)研究顯示，相同病理特征的患者接受相同方案化療，療效差異較大[7]。隨著分子生物學(xué)進展，研究發(fā)現(xiàn)消化道腫瘤患者的預(yù)后與癌基因和(或)抑癌基因異常表達密切相關(guān)。其中ERCC1為近年來臨床關(guān)注較多且也頗有爭議的一項指標。本研究探討了腫瘤分子標志物ERCC1 mRNA對結(jié)直腸癌患者新輔助化療效果的影響。

ERCC1基因位于人染色體19q13.32上，基因全長15 kBp，包含12個外顯子，編碼的蛋白質(zhì)含有297個氨基酸[8]。ERCC1是人類DNA損傷修復(fù)基因，在核苷酸切除修復(fù)途徑中起著關(guān)鍵作用[4, 9]。胃癌使用鉑類藥物化療時，ERCC1 mRNA的表達水平與患者總生存期(OS)及化療療效相反[10]。Luo等[11]在分析中晚期胃癌患者ERCC1、胸苷酸合成酶等基因表達水平與化療藥物敏感性時發(fā)現(xiàn)，ERCC1 mRNA表達水平較低者鉑類藥物化療療效好。研究[12]發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者使用鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療方案時，ERCC1 mRNA低表達的患者療效更佳。Joon等[13]研究奧沙利鉑聯(lián)合氟尿嘧啶治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者ERCC1表達情況時發(fā)現(xiàn)，高表達的患者療效更差且OS更短。本研究新輔助化療方案為XELOX方案，有效率為57.14%，和目前國內(nèi)同方案化療療效相當。本研究采用RT-qPCR方法檢測42例結(jié)直腸癌患者術(shù)前ERCC1 mRNA的相對表達水平，其表達水平范圍0.92～6.53，高于癌旁正常組織。提示ERCC1參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)患者的ERCC1 mRNA表達水平與淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，表達水平較高的相對易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移，而與其他臨床病理特征關(guān)系不密切，所以ERCC1 mRNA高表達的患者在淋巴清掃方面是否需要加強有待進一步研究。本研究結(jié)果顯示有效組ERCC1 mRNA表達水平高于無效組。提示ERCC1與化療療效有關(guān)。ERCC1是核苷酸外切修復(fù)家族中的重要成員，主要參與損傷DNA鏈的切割與修復(fù)，ERCC1與DNA修復(fù)酶缺乏互補基因F(DNA-XPF)形成異源二聚體ERCC1-XPF，從而識別損傷并切除Pt-DNA加合物，然后在協(xié)同修復(fù)的作用下恢復(fù)基因的完整結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，正常細胞ERCC1 mRNA高表達預(yù)示著DNA損傷后修復(fù)能力較強，不易形成腫瘤；而腫瘤細胞高表達則會對奧沙利鉑等鉑類藥物導(dǎo)致的損傷進行更強修復(fù)從而產(chǎn)生耐藥性，降低療效。ERCC1 mRNA高表達的結(jié)直腸癌細胞修復(fù)能力更強，進入淋巴系統(tǒng)后更難被NK細胞等殺傷，更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，本研究中淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移患者新輔助化療有效率為53.3%，低于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患者的化療有效率66.7%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與樣本量較少有關(guān)，本研究為臨床指導(dǎo)結(jié)直腸癌患者的個體化治療提供了實驗依據(jù)。

綜上所述，ERCC1 mRNA可能是接受XELOX方案化療的結(jié)直腸癌患者的療效預(yù)測因子，ERCC1 mRNA高表達的患者從奧沙利鉑等鉑類抗腫瘤藥獲益的概率較低表達的患者低，從而指導(dǎo)臨床提高化療療效并能減少化療相關(guān)不良反應(yīng)。局限于本研究入組患者數(shù)量有限，ERCC1 mRNA的表達水平在晚期結(jié)直腸癌中的預(yù)測作用有待于大規(guī)模臨床試驗進一步驗證。