鄭瑞生，莊端寧， 楊 瑩，陳健偉，吳曉菲

（泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院，福建 泉州 362002）

隨著食品安全意識(shí)的提高，民眾對(duì)食品的防腐保鮮問(wèn)題越來(lái)越重視。據(jù)估計(jì)，全世界每年約有10%～20%的食品由于腐敗而廢棄，由此造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。應(yīng)對(duì)食物防腐保鮮，人們第一反應(yīng)是使用化學(xué)防腐劑，但過(guò)量添加化學(xué)防腐劑可致癌，而使用物理防腐的方法對(duì)食品的破壞性大。為此，開(kāi)發(fā)出抗菌性強(qiáng)、安全無(wú)毒害的天然防腐劑已成為新的研究熱點(diǎn)[2]。

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡(jiǎn)稱 ε-PL）由單個(gè)賴氨酸分子在α-羧基和ε-氨基形成酰胺鍵而連接成的多聚體，有20～30個(gè)賴氨酸單體組成[3]。ε-PL抑菌譜廣、pH值范圍寬、安全性高，在高溫下穩(wěn)定，水溶性強(qiáng)，在人體內(nèi)可分解為人體必需的L-賴氨酸[4]。作為一種天然、營(yíng)養(yǎng)、安全特性的防腐劑，ε-PL已被FDA批準(zhǔn)為安全食品保鮮劑。乳酸鏈球菌素也稱乳酸鏈球菌肽或尼生素（簡(jiǎn)稱Nisin），是世界公認(rèn)的一種高效、無(wú)毒、安全的天然防腐劑，它是由牛乳和乳酪中自然存在的乳酸鏈球菌發(fā)酵而產(chǎn)生[5-7]。殼聚糖（chitosan，簡(jiǎn)寫(xiě)CTS）是甲殼素脫乙?；蟮玫降漠a(chǎn)物，是自然界中唯一能夠大量存在的堿性氨基多糖，具有抑菌的廣譜性。正因?yàn)檫@種性質(zhì)使得它作為一種天然的抗菌劑[8-10]。

本文中以ε-PL、Nisin、CTS 3種天然生物抑菌劑為材料，將食品中常見(jiàn)的腐敗菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和沙門(mén)氏菌（Salmonella）作為實(shí)驗(yàn)菌，通過(guò)控制生物抑菌劑質(zhì)量濃度、pH值以及與螯合劑（甘氨酸（Gly）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA））等復(fù)配進(jìn)行抑菌效果研究，為獲得較為安全，天然的生物保鮮技術(shù)，減少食品中腐敗菌污染，延長(zhǎng)食品保藏期提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌：均取自福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、蛋白胨：杭州微生物有限公司產(chǎn)品；牛肉浸膏、NaCl、HCl、NaOH、乙酸、葡萄糖、檸檬酸、磷酸氫二鈉、Gly、EDTA、CTS，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。ε-PL：產(chǎn)自蘭州偉日生物工程有限公司產(chǎn)品；Nisin：產(chǎn)自浙江銀象生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

YJ-875型潔凈工作臺(tái)：蘇州三興凈化有限公司產(chǎn)品；UV-1200型紫外可見(jiàn)光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；DZF-6050型真空干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、BXM-30R壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；JM-B30002型電子天平，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)產(chǎn)品；電子萬(wàn)用爐：天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C型pH計(jì)：上海雷磁儀器廠制造；SHA-B恒溫振蕩器：常州國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化與培養(yǎng) 將枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，36℃搖床培養(yǎng)24 h，活化菌種。再用平板劃線法分離單菌落，挑取單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 不同的生物抑菌劑對(duì)四種腐敗菌的最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 含抑菌劑的液體培養(yǎng)基的配制：分別取1.0 g ε-PL溶解于200 mL無(wú)菌水中；取1.0 g Nisin溶解于50 mL 0.02 mol/L稀鹽酸中，再用無(wú)菌水定容至200 mL；取1.0 g CTS溶解于50 mL 0.2 mol/L乙酸中，用無(wú)菌水定容至200 mL，調(diào)節(jié)pH值至中性，將上述3種生物抑菌劑配制成5 g/L ε-PL、Nisin、CTS的母液。 接著用無(wú)菌水稀釋為：0、0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5.0 g/L。 分別取1 mL的稀釋液于4 mL的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，混勻，配制成質(zhì)量濃度分別為：0、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0 g/L的含生物抑菌劑的液體培養(yǎng)基。

接種培養(yǎng)：分別接種經(jīng)36℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)18～24 h的4種腐敗菌液0.1 mL于上述含不同質(zhì)量濃度生物抑菌劑的培養(yǎng)基中，使接種后培養(yǎng)基中菌液的細(xì)胞濃度控制在1.0～5.0×104CFU/mL，在36℃條件下培養(yǎng)24 h后，取出菌液在600 nm波長(zhǎng)比色，記錄數(shù)據(jù)。

1.3.3 不同生物抑菌劑對(duì)4種腐敗菌最小致死濃度（MLC）的測(cè)定 取1..2所述生物抑菌劑質(zhì)量濃度為：0、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L的帶菌液體培養(yǎng)基，取0.1 mL于固體平板培養(yǎng)基中，混勻，放入36℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出觀察記錄平板上的菌落數(shù)。

1.3.4 不同生物抑菌劑濃度對(duì)4種腐敗菌抑菌效果的測(cè)定 取經(jīng)36℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)18～24 h的4種腐敗菌液，加到（55±5）℃的固體培養(yǎng)基中，菌液濃度控制在1.0～5.0×104CFU/mL，混勻倒入平皿，制成含菌平板。在平板上安放直徑為8 mm的牛津杯，分別加入 0.2 mL 質(zhì)量濃度為 0、1、2、3、4、5 g/L 的ε-PL、Nisin、CTS溶液注入牛津杯。置于36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待24 h后，取出并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 不同pH值條件下生物抑菌劑對(duì)4種腐敗菌的抑菌效果的測(cè)定 用0.1 mol/L，pH為3.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液和0.1 mol/L，pH為9～10的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液分別配置濃度為3 g/L的 ε-PL（pH 為 4、6、7、8、10）、3 g/L 的 Nisin（pH 為3、4、5、6）溶液、3 g/L 的 CTS（pH 為 3、4、5、6）。 分別移取不同pH的生物抑菌液0.2 mL，按1.3.4的方法加入含菌平板的牛津杯中，置于36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待24 h后，取出并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 不同螯合劑與生物抑菌劑復(fù)配對(duì)4種腐敗菌抑菌效果的測(cè)定 將表1配置好的復(fù)合抑菌劑分組分別加入牛津杯中進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，36℃培養(yǎng)24 h，取出并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。抑菌劑配方見(jiàn)表1。

表1 生物抑菌劑的螯合試驗(yàn)Table 1 Chelating experiments of bio-inhibitor

1.3.7 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)方法 采用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物抑菌劑對(duì)4種腐敗菌MIC、MLC的分析

生物抑菌劑對(duì)4種腐敗菌的MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同生物抑菌劑的MICTable 2 MIC of different bio-inhibitors

由表2 可知，ε-PL、Nisin、CTS 對(duì) 4 種腐敗菌的生長(zhǎng)均有顯著的抑制作用，并且抑制作用隨著生物抑菌劑質(zhì)量濃度的增加而增大。ε-PL對(duì)4種腐敗菌的MIC均為0.125 g/L。Nisin對(duì)蠟樣芽孢桿菌的MIC為0.125 g/L，對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC均為0.25 g/L，對(duì)沙門(mén)氏菌MIC為0.5 g/L。除金黃色葡萄球菌MIC為0.25 g/L，CTS對(duì)其余3種腐敗菌的MIC均為0.5 g/L。

ε-PL對(duì)革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌均有較好抑菌效果，這是由于ε-PL是一種陽(yáng)離子的聚合多肽，正電荷的存在有利于ε-PL與靶細(xì)胞表面上帶負(fù)電的位點(diǎn)相結(jié)合，阻止了細(xì)胞內(nèi)外間物質(zhì)的運(yùn)輸，從而達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的效果[11]。Nisin中DHA和DHB能夠和某些對(duì)應(yīng)敏感菌株細(xì)胞膜中的某些酶的巰基發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而造成敏感細(xì)胞裂解[12]。CTS對(duì)4種菌的抑菌效果相對(duì)較弱，其主要是依靠CTS的陽(yáng)離子吸附帶有負(fù)電荷的細(xì)菌，讓細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上負(fù)電荷的分布不均勻，導(dǎo)致細(xì)胞膜不能承受滲透壓的變化而變形破裂，引發(fā)細(xì)菌溶解死亡[16]。

表3 不同生物抑菌劑的MLCTable 3 MLC results of different bio-inhibitors

腐敗菌在平板上均無(wú)菌落生長(zhǎng)，相應(yīng)質(zhì)量濃度作為其MLC。由表3可知，ε-PL對(duì)枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和沙門(mén)氏菌的MLC均為0.125 g/L，對(duì)金黃色葡萄球菌的MLC為0.25 g/L。Nisin對(duì)4種腐敗菌的MLC均為3 g/L。CTS對(duì)金黃色葡萄球菌的最小致死濃度為4.0 g/L，其余3種均為5 g/L。ε-PL表現(xiàn)出的良好的抑菌性，其次是Nisin，而相對(duì)CTS的抑菌效果最差。ε-PL具有多聚陽(yáng)離子，能破壞微生物細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，引起微生物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)、能量和信息傳遞中斷，它還能與細(xì)胞內(nèi)的核糖體結(jié)合從而影響生物大分子的合成，最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡[13]。

2.2 不同生物抑菌劑質(zhì)量濃度對(duì)4種腐敗菌的抑菌效果

由圖1～4可知，在pH值相同條件下，隨著抑菌劑的質(zhì)量濃度增大，對(duì)4種腐敗菌的抑菌效果也逐漸增強(qiáng)。ε-PL對(duì)4種腐敗菌的抑菌效果最為明顯，生長(zhǎng)趨勢(shì)差異極顯著（P＜0.01）。Nisin其次，差異也達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。CTS的抑菌效果相對(duì)較差，在質(zhì)量濃度3～5 g/L時(shí)差異不顯著（P＞0.05）?？梢?jiàn)，ε-PL對(duì)4種腐敗菌均能起到很好的抑制作用。這是因?yàn)棣?PL是一種靠肽鍵連接羧基與氨基基團(tuán)的多聚L-賴氨酸，具有廣譜抗菌性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌均有抑制作用。據(jù)研究，ε-PL可直接吸附到細(xì)胞膜上，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，或者抑制細(xì)菌的呼吸作用，同時(shí)作用于細(xì)胞膜和蛋白合成系統(tǒng)，與核糖體結(jié)合抑制蛋白質(zhì)和酶的合成，從而達(dá)到殺菌目的[14-15]。而Nisin是一種由乳酸乳球菌核糖體上合成的并經(jīng)過(guò)一系列酶學(xué)修飾的以含有羊毛硫氨酸和β-甲基羊毛硫氨酸等稀有氨基酸為特征的抗菌肽，Nisin與細(xì)胞膜通過(guò)結(jié)合，插入和孔道形成等多步過(guò)程形成孔道復(fù)合物，從而引起細(xì)胞液滲漏。Nisin的抑菌效率取決于其分子結(jié)構(gòu)，受目標(biāo)控制菌及其系統(tǒng)性質(zhì)的影響，如Nisin抗性、膜干擾劑、亞致死傷害、陽(yáng)離子、溫度、pH、蛋白水解酶和其它防腐劑，能夠抑制許多引起食品腐敗的革蘭陽(yáng)性菌[16]。而CTS的抑菌效果不穩(wěn)定可能受其分子量和脫乙酰度的影響，隨分子量的變化表現(xiàn)出不規(guī)則的變化，且不同的分子量段有不同的變化趨勢(shì)，導(dǎo)致抑菌效果不盡相同。

圖1 不同生物抑菌劑對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial effects of different bio-inhibitors against Bacillus subtilis

圖2 不同生物抑菌劑對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial effects of different bio-inhibitors against Bacillus cereus

圖3 不同抑菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial effects of different bio-inhibitors against Staphylococcus aureus

圖4 不同生物抑菌劑對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌效果Fig.4 Antibacterial effects of different bio-inhibitors against Salmonella

2.3 不同pH值對(duì)4種腐敗菌的抑菌效果

由圖5～圖8可知，ε-PL對(duì)4種腐敗菌的抑菌圈大小隨著pH升高呈先上升后減少的趨勢(shì)，在中性條件下（pH=7）抑菌圈直徑最大，抑菌效果最好。而在酸性及堿性條件下，ε-PL的抑菌活性較差，差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。這可能是由于聚賴氨酸作為賴氨酸的聚合物在酸性和堿性條件下易分解的緣故。Nisin和CTS在中性和堿性的情況下難溶，在酸性情況下溶解度較大，因此實(shí)驗(yàn)的pH值控制在3～6。隨著pH值降低，Nisin和CTS對(duì)4種腐敗菌的抑制作用越好，Nisin和CTS在pH值3～4時(shí)抑制作用最好，但隨著pH值的增加，抑制作用逐漸減弱。據(jù)研究表明，酸性條件下Nisin的活性較強(qiáng)，其對(duì)原生質(zhì)的作用方式會(huì)使細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的失活，導(dǎo)致細(xì)胞溶解，細(xì)胞質(zhì)如三磷酸腺苷的滲出，最終導(dǎo)致細(xì)菌的死亡。而CTS是一種堿性聚合物電解質(zhì)，pH值的變化對(duì)CTS有效抑菌基團(tuán)的數(shù)量及其抑菌效果的發(fā)揮有重要影響。當(dāng)pH值高于6時(shí)，CTS分子中的氨離子會(huì)被氫氧根所中和，使得其分子中的有效抑菌基團(tuán)的數(shù)量下降，進(jìn)而導(dǎo)致其抗菌效果降低；而當(dāng)pH低于6時(shí)，CTS所帶的正電荷，會(huì)和帶負(fù)電荷的微生物細(xì)胞膜上的陰離子相結(jié)合，影響微生物細(xì)胞壁的發(fā)育和細(xì)胞膜質(zhì)代謝，增大細(xì)胞膜的通透性，引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的外泄，從而干擾微生物細(xì)胞正常的生理功能，達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的目的[17]。

圖5 不同pH值對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial effects of different pH values on Bacillus subtilis

圖6 不同pH值對(duì)蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果Fig.6 Antibacterial effects of different pH values on Bacillus cereus

圖7 不同pH值對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.7 Antibacterial effects of different pH values on Staphylococcus aureus

圖8 不同pH值對(duì)沙門(mén)氏菌的抑菌效果Fig.8 Antibacterial effects of different pH values on Salmonella

2.4 不同螯合劑與生物抑菌劑復(fù)配對(duì)4種腐敗菌的抑菌效果

由圖9～圖11 可知，單獨(dú)使用 ε-PL、Nisin、CTS對(duì)四種腐敗菌具有良好的抑菌效果，其中，尤以ε-PL的抑菌效果最佳。而單獨(dú)使用Gly基本無(wú)抑制作用。單獨(dú)使用EDTA，雖能對(duì)4種腐敗菌起到一定的抑制作用，但是抑制的效果不長(zhǎng)，容易發(fā)生反復(fù)，即初期效果明顯，培養(yǎng)一段時(shí)間后細(xì)菌有恢復(fù)生長(zhǎng)的現(xiàn)象。Gly與3種生物抑菌劑復(fù)配效果無(wú)明顯的變化，但產(chǎn)生的抑菌圈有更為清晰持久，表明Gly對(duì)3種生物抑菌劑有一定的增效作用。將3種生物抑菌劑和EDTA復(fù)合使用抗菌作用顯著增強(qiáng)，尤其以ε-PL最為顯著，ε-PL綜合了EDTA的抑制作用，可以增大抑菌圈范圍，起到良好的抑制作用。3種生物抑菌劑與Gly和EDTA復(fù)配也能起到良好的協(xié)同增效作用，但效果不如生物抑菌劑與EDTA復(fù)配明顯，表明EDTA的協(xié)同抗菌增效顯著。

圖9 螯合劑對(duì)聚賴氨酸抑菌效果影響Fig.9 Inhibitory effects of chelating agents with ε-PL

圖10 螯合劑對(duì)Nisin抑菌效果影響Fig.10 Inhibitory effects of chelating agents with Nisin

圖11 螯合劑對(duì)CTS抑菌效果影響Fig.11 Inhibitory effects of chelating agents with chitosan

3 結(jié)語(yǔ)

以食品中4種常見(jiàn)腐敗菌 （枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌）為實(shí)驗(yàn)菌，研究ε-PL、Nisin、CTS在不同條件下對(duì)腐敗菌的抑制效果。結(jié)果如下：

ε-PL、Nisin、CTS均能對(duì) 4種腐敗菌的生長(zhǎng)起到抑制作用，其中以ε-PL的效果最好，Nisin其次，CTS由于受溶解性及pH影響，抑菌效果不太理想。ε-PL對(duì)枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌的MIC，均為0.125 g/L，MLC除沙門(mén)氏菌為0.2 g/L，其余均為0.125 g/L；Nisin對(duì)4種腐敗菌的 MIC分別為依次分別為 0.125、0.25、0.25、0.5 g/L；MLC 分別為 2.5、3.0、2.5、3.0 g/L。 CTS 對(duì) 4種菌的MIC除沙門(mén)氏菌為0.5 g/L外，其余均為0.25 g/L，MLC除金黃色葡萄球菌為4.0 g/L，其余均為5.0 g/L。ε-PL、Nisin對(duì)4種腐敗菌均有良好的抑菌效果，抑菌劑質(zhì)量濃度1～5 g/L的范圍內(nèi)，抑菌效果隨質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)；CTS的抑菌效果相對(duì)較差，在質(zhì)量濃度3～5 g/L時(shí)對(duì)4種腐敗菌抑制效果差異不顯著（P＞0.05）。不同pH值對(duì)生物抑菌劑抑菌活性有著很大的影響。在pH值為7時(shí)，ε-PL對(duì)4種腐敗菌的抑制效果最佳，隨著酸性或堿性的增強(qiáng)，ε-PL的抑菌效果均有所下降。Nisin和CTS的抑菌效果隨pH的降低而升高，表明酸性條件能夠增強(qiáng)Nisin和CTS的抑菌能力。

3種生物抑菌劑與螯合劑復(fù)配的抑菌效果不盡相同：與Gly復(fù)配無(wú)明顯的協(xié)同增效作用，但能提高抑菌效果的持久性；與EDTA的復(fù)配對(duì)腐敗菌抑制具有較明顯的增效作用，尤其是ε-PL與EDTA復(fù)配抑菌效果顯著且穩(wěn)定。