趙振華，汪效松，魏振，何瑩超，程瓊，汪銀洲

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病之一，臨床表現(xiàn)包括靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩等運(yùn)動(dòng)癥狀以及抑郁、認(rèn)知障礙、自主神經(jīng)功能異常等非運(yùn)動(dòng)癥狀［1］。PD起病隱匿，疾病早期可無(wú)明顯臨床癥狀，診斷較為困難，但是早期使用神經(jīng)保護(hù)治療可以減少神經(jīng)元變性，從而延緩疾病進(jìn)展。一旦進(jìn)入疾病中晚期，臨床癥狀明顯，雖然診斷較為容易，但是殘余神經(jīng)元已極少，藥物治療的“蜜月期”較短，效果欠佳，并且容易出現(xiàn)各種并發(fā)癥。因此，PD早期診斷對(duì)疾病治療、延緩疾病發(fā)展及監(jiān)測(cè)疾病變化至關(guān)重要，尋找靈敏度和特異度高的診斷方法和合適的生物標(biāo)志物迫在眉睫。目前，各國(guó)學(xué)者都致力于尋找高靈敏度和特異度的生物學(xué)標(biāo)志物，用于輔助PD的早期診斷和客觀評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度。氧化應(yīng)激在PD發(fā)病機(jī)制中扮演了重要角色［2］。氧自由基（ROS）的生成過多或者清除障礙是PD患者多巴胺能神經(jīng)元丟失的一個(gè)重要因素，ROS異常增多的原因包括多巴胺代謝異常、自由基清除能力降低、離子水平紊亂及鈣超載［3］。此外，線粒體功能障礙可影響呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的正常功能，進(jìn)而導(dǎo)致三磷酸腺苷（ATP）的合成障礙，同時(shí)使ROS生成增加，異常增多的ROS又可以導(dǎo)致線粒體DNA的損傷并觸發(fā)線粒體損傷與氧化應(yīng)激之間形成惡性循環(huán)［4］。因此，氧化應(yīng)激可能成為反映PD疾病狀態(tài)的靈敏指標(biāo)。本研究旨在探討PD患者外周血漿氧化應(yīng)激的標(biāo)志物丙二醛（malonaldehyde，MDA）、8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）、DJ-1蛋白水平，以期為氧化應(yīng)激指標(biāo)在PD的診斷和疾病不同階段評(píng)估的臨床應(yīng)用價(jià)值提供新的參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年12月—2017年6月于福建省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診就診及住院的原發(fā)性PD患者40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均符合PD的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；（2）年齡60～80歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）進(jìn)行性核上性麻痹、多系統(tǒng)萎縮、皮質(zhì)基底核變性等PD疊加綜合征；（2）阿爾茨海默病或有嚴(yán)重精神疾病史；（3）合并嚴(yán)重心、腦、肺、肝、腎、血液、內(nèi)分泌代謝疾病及腫瘤。另于同期在本院收集與PD患者無(wú)血緣關(guān)系的健康體檢者40例為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡60～80歲；（2）無(wú)震顫、行動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直等表現(xiàn)；（3）無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)疾病史及PD家族史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）認(rèn)知功能下降、阿爾茨海默病或有嚴(yán)重精神疾病史；（2）合并嚴(yán)重心、腦、肺、肝、腎、血液、內(nèi)分泌代謝疾病及腫瘤。本研究經(jīng)福建省立醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者知情并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 病程評(píng)價(jià) 采用Hoehn-Yahr（H-Y）分期評(píng)估病情嚴(yán)重程度。分別為：Ⅰ期：?jiǎn)蝹?cè)受影響；Ⅱ期：雙側(cè)受影響但無(wú)姿勢(shì)平衡障礙；Ⅲ期：出現(xiàn)姿勢(shì)平衡障礙，常常容易跌倒；Ⅳ期：日常生活需要人照護(hù)，獨(dú)立行走有困難；V期：幾乎全天須依賴輪椅，或者終日無(wú)法起身［6］。將Ⅰ～Ⅱ期的患者歸為早期PD組（n=23），Ⅲ期及以上的患者歸為中晚期PD組（n=17）。

1.2.2 統(tǒng)一帕金森病評(píng)定量表第3部分（UPDRS-Ⅲ）測(cè)評(píng) 旨在評(píng)價(jià)PD患者的運(yùn)動(dòng)障礙程度，包括言語(yǔ)、面部表情、靜止性震顫、手部動(dòng)作性/姿勢(shì)性震顫、強(qiáng)直、手指拍打試驗(yàn)、手動(dòng)作、輪替動(dòng)作、腿部靈活性、坐椅起立、姿勢(shì)、步態(tài)、姿勢(shì)平衡、軀體少動(dòng)14個(gè)條目，每個(gè)條目分為5個(gè)等級(jí)，分別計(jì)為0～4分，分?jǐn)?shù)越高，運(yùn)動(dòng)障礙越嚴(yán)重［7］。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè) 由本院護(hù)士清晨抽取5 ml患者空腹肘靜脈血，常規(guī)分離血漿，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎昧虼捅韧姿岱z測(cè)血漿中MDA水平，采用ELISA法檢測(cè)血漿中8-OHdG、DJ-1蛋白水平。操作步驟均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。MDA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，8-OHdG ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，DJ-1蛋白ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（x ±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組基本情況比較 3組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；早期、中晚期PD組UPDRS -Ⅲ評(píng)分、病程比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 3組基本情況比較Table 1 Demographic characteristics of the participants

2.2 3組血漿氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 3組血漿MDA、8-OHdG水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，早期、中晚期PD組MDA水平高于對(duì)照組，早期PD組8-OHdG水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。3組血漿DJ-1蛋白水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。

表2 3組血漿氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較（x±s，μg/L）Table 2 Levels of MDA，8-OHdG and DJ-1 protein in the controls，mild PD patients and moderate-to-severe PD patients

3 討論

PD是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，PD的主要病理學(xué)特點(diǎn)是腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元變性壞死，黑質(zhì)紋狀體通路退化，而導(dǎo)致這一改變的確切病因尚不十分清楚。環(huán)境因素、遺傳因素、免疫學(xué)異常以及氧化應(yīng)激反應(yīng)等可能參與多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡過程［8-9］。氧化應(yīng)激學(xué)說認(rèn)為，正常體內(nèi)細(xì)胞不斷產(chǎn)生自由基，引起脂質(zhì)過氧化，對(duì)蛋白質(zhì)、DNA均可產(chǎn)生氧化損傷；同時(shí)，人體內(nèi)存在酶性和非酶性兩種抗氧化防御系統(tǒng)來清除這些自由基，保護(hù)大腦免受氧化損傷。氧化與抗氧化功能處于動(dòng)態(tài)平衡，如果氧化與抗氧化系統(tǒng)功能平衡失調(diào)則導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性死亡［10］。

3.1 8-OHdG ROS可以直接造成DNA的氧化損傷，8-OHdG是最具有代表性的損傷產(chǎn)物之一［11］。ROS攻擊DNA中的鳥嘌呤的第8位碳原子，使脫氧鳥苷轉(zhuǎn)換為8-OHdG。由于8-OHdG只通過上述途徑形成，不是細(xì)胞更新產(chǎn)物，并且可以在體內(nèi)穩(wěn)定存在，在體液中的水平不受飲食等因素影響，因此是可靠的DNA氧化損傷的標(biāo)志物［11］。ISOBE等［12］采用高效液相色譜法檢測(cè)了20例PD患者腦脊液的8-OHdG水平，發(fā)現(xiàn)患者的8-OHdG水平顯著高于對(duì)照組，并且與疾病病程明顯相關(guān)，說明8-OHdG是靈敏可靠的標(biāo)志物。雖然腦脊液檢查可以直接反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)環(huán)境，但是不適合隨訪及多次采樣。BOLNER等［13］同樣采用高效液相色譜法檢測(cè)受試者的尿8-OHdG水平，發(fā)現(xiàn)PD患者明顯高于對(duì)照組。CHEN等［14］比較了211例PD患者和135例正常個(gè)體的外周血8-OHdG水平，同樣發(fā)現(xiàn)PD患者的8-OHdG水平明顯升高，并且中晚期PD患者中8-OHdG水平隨著HY分期的升高而逐漸升高。國(guó)內(nèi)采用8-OHdG作為PD生物標(biāo)志物的研究仍比較少。本研究結(jié)果顯示，PD患者的血漿8-OHdG水平高于對(duì)照組，且早期PD患者8-OHdG水平升高更為顯著，這提示PD患者早期階段DNA氧化應(yīng)激損傷的程度可能更為嚴(yán)重，抗氧化應(yīng)激治療應(yīng)及早應(yīng)用。

3.2 MDA ROS攻擊脂質(zhì)類主要產(chǎn)生MDA、酮基、羥基、羰基、氫過氧基等。MDA是脂質(zhì)過氧化的降解產(chǎn)物，其水平也可以間接反映細(xì)胞損傷的程度。DEXTER等［15］通過尸檢發(fā)現(xiàn)PD患者黑質(zhì)部位的MDA水平要高于患者腦組織其他部位，同時(shí)也高于正常個(gè)體黑質(zhì)的MDA水平。這說明MDA可能是一個(gè)可靠的反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)脂質(zhì)氧化損傷的指標(biāo)。DE FARIAS等［16］對(duì)血清中脂質(zhì)氫過氧化物水平、MDA水平、一氧化氮代謝產(chǎn)物水平、巰基水平、過氧化氫酶活性、超氧化物歧化酶活性、對(duì)氧磷酶1活性等幾種氧化應(yīng)激產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)PD患者的MDA水平較正常個(gè)體明顯升高，并且靈敏度和特異度均高于其他幾種標(biāo)志物。葉心國(guó)等［17］對(duì)86例PD患者的血漿超氧化物歧化酶、谷胱甘肽及MDA水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)患者的MDA水平明顯高于正常個(gè)體。但是，周紅等［18］的研究結(jié)果卻未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)改變。本研究發(fā)現(xiàn)，PD患者的血漿MDA水平較對(duì)照組升高，提示這些PD患者的氧化應(yīng)激損傷可能在疾病發(fā)展過程中逐漸增強(qiáng)，有必要注重抗氧化的藥物治療，比如加用較大劑量的輔酶Q10、維生素E等，可能有助于減緩疾病進(jìn)展。

3.3 DJ-1蛋白 DJ-1蛋白在抗氧化應(yīng)激方面具有重要作用。發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，DJ-1蛋白的106位半胱氨酸殘基會(huì)被氧化修飾，位于胞漿的DJ-1蛋白進(jìn)入到線粒體內(nèi)，通過直接清除ROS和調(diào)節(jié)其他抗氧化酶的活性發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［19］。目前，對(duì)于外周DJ-1蛋白能否作為PD的合適的生物標(biāo)志物尚存在爭(zhēng)議。WARAGAI等［20］檢測(cè)了104例PD患者血漿DJ-1蛋白，發(fā)現(xiàn)PD患者明顯高于對(duì)照組，并且蛋白水平的升高與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。但是，SHI等［21］的研究卻并未發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果。何丹等［22］對(duì)215例PD患者的血清DJ-1蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，并未發(fā)現(xiàn)患者與正常對(duì)照存在差別，并且DJ-1蛋白水平與疾病嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)。本研究也未發(fā)現(xiàn)DJ-1蛋白水平在各組中存在顯著差別。究其原因，可能與DJ-1蛋白容易受到外周血污染有關(guān)［23］。因此，有些學(xué)者嘗試檢測(cè)外周血中其他形式的DJ-1蛋白，比如氧化DJ-1蛋白［24］、DJ-1蛋白的同形體［25］，希望能夠更好地反映PD的氧化應(yīng)激障礙和病情的嚴(yán)重程度，但是這些結(jié)果仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，PD患者存在過度異常的氧化應(yīng)激損傷。外周血檢測(cè)8-OHdG水平和MDA水平可能作為輔助PD患者診斷并了解病程嚴(yán)重程度的生物學(xué)預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究樣本量有限，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、增加隨訪的時(shí)間和增加個(gè)體自身指標(biāo)的比較來進(jìn)一步驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)：趙振華進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)整理和撰寫論文；魏振和何瑩超進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理、數(shù)據(jù)收集；汪效松和汪銀洲進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析及論文的修訂；程瓊進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)、質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。