王 倬，曾糧斌，袁善奎，李建軍，杜昱光*

(1.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京 100190) (2.中國農業(yè)科學院麻類研究所，湖南 長沙 410205) (3.農業(yè)部農藥檢定所，北京 100125)

幾丁質(chitin)，又名甲殼質、甲殼素，常見于甲殼類動物、昆蟲外殼以及真菌細胞壁，是自然界產量僅次于纖維素的天然多糖，年產量約為1011噸[1]。幾丁質及其脫乙?；a物殼聚糖(chitosan)因其具有的多種生物活性，良好的生物可降解性及生物相容性，已被作為一種優(yōu)秀的天然材料應用于諸多領域。然而，幾丁質及殼聚糖較差的水溶性一定程度上限制了其更廣泛的應用，其降解得到的低分子量寡糖產物(chitooligosaccharide)水溶性良好，且在抗炎、抗菌、抗癌、免疫調節(jié)、細胞修復、植物免疫誘導等多方面展現出更好的生物活性[1-4]，在醫(yī)藥、食品、化妝品以及農業(yè)等諸多行業(yè)展現出巨大的應用潛力[5-7]，相關產業(yè)近些年成長迅速。

1 分類定義

Chitooligosaccharides在中文中通常被稱為殼寡糖、幾丁寡糖或低聚殼聚糖，是由N-乙酰氨基葡萄糖及其脫乙?；a物氨基葡萄糖組成，是聚合度<20、平均分子量<3.9 kDa的低聚糖鏈[5]。如同其制備原料幾丁質與殼聚糖，chitooligosaccharides也常被分為兩類：一類是脫乙酰度(DD)>70%的，通常稱為殼寡糖(chitosan oligosaccharides)，農業(yè)上也稱為氨基寡糖素；另一類是脫乙酰度較低，<50%的，稱為幾丁寡糖(chitin oligosaccharides)。這種分類方法很大程度上源于寡糖制備工藝方法局限性。傳統工藝中，因為幾丁質不溶于水、堿和有機溶液，只溶于部分濃酸，因此甲殼類原料首先通過加入強堿脫乙酰生產可溶于稀酸的脫乙酰度>70%的殼聚糖，從而實現工業(yè)上的大規(guī)模制備。以此殼聚糖為原料降解制備殼寡糖的，其脫乙酰度也在這個范圍。隨著對chitooligosaccharide研究的進一步深入，這種分類及中文命名方式出現了一些問題，比如對脫乙酰度在50%～70%之間的寡糖缺乏定義，而這類被稱為hetero-chitooligosaccharides的寡糖由于其更優(yōu)的生物活性及物理化學性質，已成為殼寡糖研究領域及相關產業(yè)的最新熱點[1,4]。可以看出，chitooligosaccharide類寡糖的分類及中文命名存在很多定義不清以及命名混淆的狀況。在本文中為便于敘述，我們定義脫乙酰度>70%的為殼寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)；脫乙酰度<50%的為幾丁寡糖(chitin oligosaccharide，CTOS)；脫乙酰度在50%～70%之間的為HT-殼寡糖(hetero-chitooligosaccharide，HT-COS)；而這些寡糖統稱為幾丁類寡糖(chitooligosaccharide)。盡管脫乙酰度是幾丁類寡糖分類的重要依據，寡糖的聚合度(DP)、分子量(MW)、分子量分布(PD)以及乙?；植寄Ｊ?PA)等結構特征均直接影響幾丁類寡糖的生物活性，并可以依照這些特征進行更細致的分類[8]。

2 生產工藝技術研發(fā)

目前，幾丁類寡糖主要通過物理、化學方法或酶法降解殼聚糖或幾丁質制備生產。幾丁類寡糖的物理降解研究相對較少，方法主要包括超聲降解[9]及γ-輻照[10]，工業(yè)制備主要通過化學法及酶法。傳統化學法制備工藝主要使用強酸降解，包括酸解、中和、分離、干燥等步驟[11]。除了使用強酸降解，雙氧水也可以用于寡糖制備[12]。化學降解方法步驟較復雜，且較難控制寡糖產物的聚合度、脫乙酰度等結構特征，其寡糖產物的聚合度較低，而生物活性更優(yōu)的高聚合度寡糖產物較少[11]。此外，還存在副產物較多、環(huán)境不友好等問題。相較而言，酶法制備是更有效、應用更廣泛的方法。酶法制備可使用特異性的幾丁質酶和殼聚糖酶，也可以使用非特異性的糖苷酶以及蛋白酶。酶法降解具有高效、反應溫和、產物結構可控、環(huán)境友好無污染等優(yōu)點，適用于幾丁類寡糖生產制備。

3 植物免疫誘導活性研究與應用

研究發(fā)現，幾丁類寡糖具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調節(jié)、降血脂以及降血壓等多種生理活性[13,14]，在醫(yī)療、保健、食品等領域已有廣泛的應用(表1)。在農業(yè)應用方面，幾丁類寡糖因為具有激活植物免疫系統的活性，而被作為植物誘導劑廣泛應用(表1)。研究表明，幾丁類寡糖的植物免疫誘導活性受其濃度、聚合度、脫乙酰度、施用方法、植物生長周期等多方面因素影響[15]。幾丁寡糖的植物作用活性研究開展較早，其在植物上的特異性受體也已發(fā)現[16,17]。研究表明，聚合度>3的幾丁寡糖具有較強的植物誘導活性，與相同聚合度的殼寡糖相比活性更好。幾丁寡糖的活性更高的原因或在于其主要由N-乙酰氨基葡萄糖組成，而單糖上的乙?；鶊F對于寡糖與受體的結合至關重要。因此，更高聚合度的幾丁寡糖往往活性更強。但是，高聚合度(DP>8)的幾丁寡糖在水和有機溶液中的溶解性均很低，且目前幾丁寡糖生產工藝較為復雜，限制了其更廣泛的應用。相較而言，殼寡糖在植物免疫誘導活性方面的研究更為深入，在我國已有多種氨基寡糖素類農藥獲得了登記許可。殼寡糖的植物免疫誘導作用機制可能與幾丁寡糖存在差異，其在植物上的特異性受體也尚未發(fā)現。目前認為，殼寡糖暴露的氨基所攜帶的正電荷是其活性的重要基礎，殼寡糖或通過此特性與細胞膜結合，或進入細胞內與核酸結合影響相關基因的表達[15]。盡管殼寡糖的作用機制尚待更多研究確定，但在多種植物上的研究及應用證明，殼寡糖可以促進植物生長[18]、激活植物天然免疫系統[6,15]，從而提高植物抗病、抗蟲能力，增強抗逆性(抗旱、抗寒、耐鹽)。此外，在實際應用中我們發(fā)現，殼寡糖可以促進植物降解農藥從而降低農產品的農藥殘留。因此殼寡糖作為天然、無毒、環(huán)境友好的新型生物農藥、肥料及生長調節(jié)劑，已被廣泛應用于農業(yè)生產。與幾丁寡糖類似，研究發(fā)現聚合度≥3的殼寡糖具有較高的植物免疫誘導活性[19]。

表1 國內幾丁類寡糖產品信息匯總

注：*產品分類參照本文分類定義方法；本表數據參考農業(yè)行業(yè)標準NY/T2889.1-2016、行業(yè)標準HG/T 4926-2016、國家衛(wèi)生計生委公告(2014年第6號)

4 構效關系研究

近期研究表明，脫乙酰度50%及68%的HT-殼寡糖植物誘導活性比傳統殼寡糖更強[20]。目前研究認為，HT-殼寡糖既有足夠數量的乙酰基團參與植物表面受體結合，從而更有效的激活植物免疫系統，其所具有的正電荷也可以發(fā)揮殼寡糖的活性作用，同時在較高聚合度(DP>8)的情況下仍具有較好的水溶性，因此已成為幾丁類寡糖最新的研究方向。此外，HT-殼寡糖的脫乙?；潭雀咏谧匀唤缰姓婢毎趲锥≠|/殼聚糖的脫乙酰度范圍，這一特征也可能是其優(yōu)良植物免疫誘導活性的結構基礎，因為真菌細胞壁組分正是植物天然免疫系統的識別信號。然而，這種脫乙酰度范圍也帶來HT-殼寡糖結構上的復雜性，給HT-殼寡糖的分離純化與結構鑒定帶來挑戰(zhàn)。以脫乙酰度50%的雜殼四糖為例，在聚合度和脫乙酰度相同的情況下，其單體均由2個氨基葡萄糖和2個N-乙酰氨基葡萄糖組成，但從糖鏈還原端到非還原端不同的單糖排列順序可以產生6種不同結構的寡糖單體。這一新的發(fā)現極大增加了幾丁類寡糖的結構復雜性(圖1)。近期研究通過使用特定的幾丁質酶、殼聚糖酶及脫乙酰酶，結合分離純化方法的改進，以及質譜、NMR等結構鑒定技術的發(fā)展，制備了種類多樣、結構確定的HT-殼寡糖單體[21,22]，為HT-殼寡糖構效關系的深入研究及應用奠定了基礎。令人驚訝的是，體外植物細胞活性實驗表明，僅僅一個乙?；稽c不同，這些寡糖同分異構體的生物活性相差很大[23]。我們近期也開發(fā)了基于特定酶的幾丁類寡糖綠色清潔化生產工藝，制備了聚合度、脫乙酰度、乙酰化分布模式可控，結構明確的HT-殼寡糖及幾丁寡糖。室內及田間試驗表明，這些寡糖展現出良好的植物免疫誘導活性，其免疫誘導抗病、抗蟲活性是傳統高脫乙酰度殼寡糖產品的數倍。

圖1 幾丁類寡糖結構特征示意圖

5 討論

綜上所述，幾丁類寡糖在健康產業(yè)、農業(yè)等方面已顯現出巨大的應用價值，以聚合度為主要特征的第一代高脫乙酰度(DD>70%)殼寡糖產品在多個領域被成功開發(fā)，在農業(yè)應用上已有60多種氨基寡糖素農藥獲得登記證。然而，目前幾丁類寡糖產品類型單一，所開發(fā)的農藥、飼料添加劑及功能食品產品均屬于本文所述殼寡糖的范疇(表1)。此外，目前產品結構表征相對不足，一般僅對聚合度和脫乙酰度有較為籠統的限定，造成相關產品質量水平良莠不齊。越來越多的研究表明，寡糖的生物活性受聚合度、脫乙酰度、乙?；植寄Ｊ降冉Y構特征的影響而產生巨大差別。因此，對于殼寡糖類產品需要更科學系統的結構表征及分類規(guī)范。HT-殼寡糖因其結構與天然免疫誘導結構更近似帶來高活性特點，目前隨著綠色清潔化可控酶解制備工藝的成熟，第二代聚合度可控，脫乙酰度范圍更接近自然狀況的殼寡糖類產品即將面世。而隨著定點脫乙酰化技術的不斷成熟及制備、檢測技術的完善，未來還將出現三大結構特征明確可控(即聚合度、脫乙酰度、乙?；稽c)的第三代殼寡糖類產品。這些寡糖產品對制備技術提出了更高、更科學的要求，但也將具有更廣闊的應用前景。