蘆潔坪，王艷偉，楊光參

(溫州大學(xué)數(shù)理與電子信息工程學(xué)院，浙江 溫州 325035)

DNA作為生命遺傳信息的攜帶者和傳遞者，是許多藥品的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)[1]。研究藥品或者小分子配合物同DNA之類生物大分子之間的相互作用，是如今生命科學(xué)領(lǐng)域最重視的課題之一[2]。因?yàn)榧?xì)胞中的DNA必須凝聚成特定結(jié)構(gòu)裝載到細(xì)胞核中，因此，了解DNA的凝聚并分析其形成的動力學(xué)機(jī)制，對了解DNA復(fù)制乃至生命的繁殖等過程都有十分重要的意義[3]。能夠使DNA凝聚的藥劑或者配合物有很多，例如各類多價(jià)離子、乙醇、中性聚合物、陽離子脂質(zhì)體和一些蛋白質(zhì)等，在其作用下DNA會凝聚成多種形態(tài)[4]。

DNA在良溶液中顯示為自由伸展的形態(tài)，而其折疊聚集成緊密有序的形態(tài)的過程就被稱為DNA的凝聚。從Manning平衡離子凝聚理論可知，平衡離子能中和DNA上的大部分電荷，但DNA上還有部分未被中和的電荷，DNA分子之間還存在著靜電排斥力[5]。如何克服這個(gè)剩余靜電排斥力，Wong等[6]提出了一種新的理論解釋。他們認(rèn)為，由于強(qiáng)的橫向排斥效應(yīng)，平衡離子在DNA表面形成了一種類似Wigner晶體結(jié)構(gòu)的強(qiáng)關(guān)聯(lián)流體結(jié)構(gòu)，吸附在DNA表面的平衡離子屏蔽了DNA的電荷，從而使得DNA間的排斥力減小，當(dāng)DNA之間的靜電排斥力小于靜電吸引力時(shí)，DNA發(fā)生凝聚。

對于DNA的電荷逆轉(zhuǎn)，指的是帶電物質(zhì)表面的電荷被中和為電中性后又繼續(xù)顯示為與原先相反電荷的性質(zhì)[7]。實(shí)際操作中，通常使用動態(tài)光散射設(shè)備來進(jìn)行電荷逆轉(zhuǎn)的觀察。同時(shí)，溶液中平衡離子對于帶電物質(zhì)表面電荷補(bǔ)償?shù)那闆r也可以通過此種方法來進(jìn)行討論研究[8]。

本文以動態(tài)光散射(dynamic light scattering，DLS)和單分子原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)為主要手段，詳細(xì)地研究了不同濃度的組氨酸溶液中的DNA的電泳遷移率，以及在相應(yīng)濃度下的DNA的凝聚現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)了組氨酸濃度的增加可以誘導(dǎo)DNA的電荷逆轉(zhuǎn)。同時(shí)，隨著組氨酸濃度的增加，DNA可以發(fā)生凝聚現(xiàn)象。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 動態(tài)光散射

DLS也稱光子相關(guān)光譜(photon correlation spectroscopy，PCS)，因?yàn)楣庹丈涞奖粶y物質(zhì)后會出現(xiàn)散射光，DLS就是通過觀察散射光各項(xiàng)參數(shù)的變化來研究物質(zhì)的大小和電位情況[9]。DLS儀器測量所用的實(shí)驗(yàn)藥品制作比較簡便，測量的時(shí)候不會影響到溶液中的樣品本身的屬性，所以可以對溶液中所測藥品的動態(tài)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，利用Malvern Zetasizer Nano-ZS90裝置測量DNA-Histidine復(fù)合物尺寸和電位[10]。圖1是該裝置的測量示意圖，入射激光是波長約為633 nm的He-Ne激光。

圖1 動態(tài)光散射裝置結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The diagram of dynamic light scattering installment

DLS可測量樣品的電泳遷移率，所謂的電泳意味著聚電解質(zhì)在存在施加的電場的情況下沿與電荷相反的方向轉(zhuǎn)移，同介質(zhì)中的平衡離子作相對運(yùn)動的現(xiàn)象。我們假設(shè)聚電解質(zhì)所含電量大小為q，外加電場大小為E，在此影響下進(jìn)行運(yùn)動，則其所受的靜電力大小為qE。當(dāng)聚電解質(zhì)在介質(zhì)中運(yùn)動的時(shí)候，還會受到摩擦力的作用，摩擦力的大小與聚電解質(zhì)的遷移速度v成正比，運(yùn)動方向則截然相反，即摩擦力是-f阻v，其中阻力系數(shù)為f阻。對于球型的聚電解質(zhì)，按照Stokes定律

f阻=6πηr，

(1)

其中，r為半徑，η為介質(zhì)的粘度系數(shù)，則摩擦力為-6πηrv。當(dāng)聚電解質(zhì)在介質(zhì)中勻速遷移時(shí)，靜電力應(yīng)與摩擦力的大小一致，即

qE=6πηrv。

(2)

根據(jù)靜電學(xué)理論我們可以知道，對于球型的粒子，可以近似將其視為在其擴(kuò)散層中所含有的電量q和切動面上所含有的電量-q構(gòu)成一個(gè)共用同一圓心的電容器，ζ就是該電容器的電勢，所以

(3)

其中，ε是介質(zhì)的介電常數(shù)，k-1是擴(kuò)散層的厚度。

當(dāng)粒子的半徑與擴(kuò)散層的厚度比kr≤0.1時(shí)，式(3)可表示為

(4)

將上式代入(2)中可得

(5)

上式稱為Hückel公式，其中μ是粒子的電泳遷移率。式(5)是用于得出kr<0.1的球型粒子的ζ電勢。但是隨著kr的增大，式(5)不再適用。Henry把外加電場和粒子雙電層的電場整合到一起進(jìn)行分析處理，從而得到了一個(gè)公式，相當(dāng)于在式(5)的右側(cè)乘以一個(gè)校正系數(shù)F(kr)，使其變?yōu)?/p>

(6)

其中，F(xiàn)(kr)是kr的函數(shù)，稱為Henry函數(shù)，當(dāng)kr很小時(shí)，F(xiàn)(kr)趨近于1，此時(shí)，式(6)就退變?yōu)槭?5)。然而當(dāng)kr很大時(shí)，F(xiàn)(kr)趨近于1.5，此時(shí)式(6)變?yōu)?/p>

(7)

這個(gè)公式最先由Smoluchowski得到的，故稱為Smoluchowski公式。

對于zeta電位的測量，目前可以利用的方法有很多，比如電泳法、流動電位法、電滲法等等。其中以電泳法的應(yīng)用最為廣泛。DLS技術(shù)就是通過電泳法來測量觀察被測粒子的zeta電位，其原理為當(dāng)一束激光通過衰減器進(jìn)入樣品池，由于在外加電場的作用下粒子開始進(jìn)行定向運(yùn)動，散射光的頻率因此發(fā)生了一定程度的偏移，這樣就形成了一個(gè)頻率很小的調(diào)制光源，這束調(diào)制光源的頻率為參考光和散射光的頻率之差，該頻率差Δf與被測粒子的運(yùn)動速度有關(guān)：

Δf=2vsin (θ/2)/λ，

(8)

其中，v為被測粒子的運(yùn)動速度，λ為入射激光的波長，θ為散射角。檢測器通過檢測光強(qiáng)隨時(shí)間的波動的信息，從而得到拍頻，然后通過拍頻信息就可以得出被測粒子的速度，進(jìn)而就可以知道所測量物質(zhì)的電泳遷移率，再利用式(6)就能夠得出被測物質(zhì)的zeta電位。

1.2 原子力顯微鏡

AFM自被研發(fā)以來就在物理學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等各科研領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。AFM的功能很廣泛，不僅僅可以直觀地得到DNA、蛋白質(zhì)的形貌特征，而且還可以在一些高水準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)中起到重要的作用，比如進(jìn)行直觀下的分子剪輯以及DNA特殊定位等。AFM具有成像清晰、分辨率高的優(yōu)點(diǎn)，因此經(jīng)常在操作單分子DNA等實(shí)驗(yàn)中得到應(yīng)用。

AFM的工作過程是通過內(nèi)部懸臂一端的極小針尖和被測樣品之間極微弱的原子間作用力，得到取樣品表面的形貌信息[11]。如圖2所示，由二極管激光器發(fā)出的一束激光經(jīng)過一系列光學(xué)器件，然后聚焦到鍍有優(yōu)良反射性質(zhì)金屬膜的探針的微懸臂背面，經(jīng)過微型懸臂梁的反面反射到光點(diǎn)探測器的光電二極管結(jié)構(gòu)上。當(dāng)儀器進(jìn)行掃描工作時(shí)，由于針尖與被測樣品表面間的微弱作用力，使得微懸臂沿著被測藥品表面進(jìn)行起伏運(yùn)動，然后反射光束也有微弱的位置偏移和強(qiáng)度變化，所以，可以通過檢測器上光斑的位置變化，進(jìn)行信號轉(zhuǎn)換，最終得到所測藥品表面的形態(tài)輪廓[12]。在這樣的成像過程中，針尖與被測樣品表面的距離始終保持在納米級，從而這也要求有一個(gè)反饋回路來到達(dá)這樣的效果。這個(gè)反饋回路就是通過檢測針尖與云母片表面的互相作用大小，來控制加載樣品掃描器上垂直方向的電壓，進(jìn)而控制它們之間的距離始終保持在納米級。這個(gè)可以反饋的回路控制系統(tǒng)可以說是AFM核心機(jī)制之一。在軟件操作中，主要依靠積分增益(IGain值)和比例增益(PGain值)以及參考電流這幾個(gè)參數(shù)的設(shè)置來實(shí)現(xiàn)此反饋系統(tǒng)的控制。

圖2 激光檢測原子力顯微鏡探針工作示意圖Fig.2 Laser detection of AFM probe

本文所用到的NanoWizardⅢ AFM購于德國JPK，其內(nèi)部設(shè)有自動機(jī)器人和一架控制裝置，還有一個(gè)BioScience控溫系統(tǒng)和NanoScience系統(tǒng)。小針頭是NanoWorld的NCHR-50探針，其具體數(shù)據(jù)為懸臂長125 μm，寬度30 μm，厚度4 μm，彈性系數(shù)2 N/m，共振頻率為320 kHz，鍍有鋁的硅探針。我們將準(zhǔn)備的藥品，放置在AFM平臺上，保持室內(nèi)溫度為25 ℃，用AC mode進(jìn)行圖像掃描。掃描時(shí)選用的尺寸為5 μm ×5 μm，掃描線率為1.0 Hz。對于每塊被測樣品，我們都選擇多處位置來掃描，這樣可以降低因溶液不夠平均造成的誤差。最后掃描獲得的圖片像素為512×512，利用自帶的4.2版本的JPK Data Processing軟件對圖片采取合適且相同的處理[13]。

2實(shí)驗(yàn)材料及樣品制備

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 λ-DNA

DNA上儲存有大多數(shù)生物的遺傳信息，大部分正常的DNA通常都是B型的右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。λ-DNA就是這樣一種標(biāo)準(zhǔn)的雙螺旋分子，鏈長大概是48 kbp，研究者最開始就是用此DNA作為克隆的載體。本實(shí)驗(yàn)中用的λ-DNA購于New England Biolabs，原始濃度為0.5 μg/μL(10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)，儲存在-20 ℃冰箱中待用[14]。

2.1.2 組氨酸簡介

組氨酸是配位能力最強(qiáng)的氨基酸之一，分子結(jié)構(gòu)如圖3所示。在組氨酸殘基中有一個(gè)咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)，我們可以看到里面有2個(gè)N原子，其中一個(gè)在pH范圍6～ 7時(shí)實(shí)現(xiàn)去質(zhì)子化[15]。當(dāng)組氨酸是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的一部分時(shí)，這個(gè)咪唑基就是其和一些過渡離子進(jìn)行作用的主要靶點(diǎn)。本文中所用組氨酸(H8)購于上海強(qiáng)耀生物科技有限公司，配置純度為95%。

圖3 組氨酸分子結(jié)構(gòu)圖Fig.3 The Molecular structure of Histidine

2.1.3 溶液及其他實(shí)驗(yàn)材料

(1)緩沖液Tris(10 mmol/L，pH 8.0)。

(2)超純水，取自Milli-Q系統(tǒng)(美國Millipore)。

(3)配置1 mmol/L的MgCl2·6H2O。

2.2 樣品制備

2.2.1 DLS實(shí)驗(yàn)樣品制備

DLS樣品制備步驟如下：

(1)用10 mmol/L的Tris配置不同濃度的組氨酸液體1 000 μL于離心管內(nèi)；

(2)用離心管中加入2μL λ-DNA，用手指輕彈，使之混合均勻后室溫下培育10 min；

(3)最后用移液器將步驟(2)中的混合液體移出，轉(zhuǎn)移到Zeta電位毛細(xì)管樣品池(圖4)中，然后放在動態(tài)光散射樣品槽中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[16]。

圖4 Zeta電位毛細(xì)管樣品池Fig.4 Zeta potential capillary sample pool

2.2.2 AFM實(shí)驗(yàn)樣品制備

AFM樣品制備方法如下(圖5)：

(1)剪取合適大小的雙面膠，利用其將事先切割好的1 cm×1 cm大小的云母片平整地貼到載玻片中間；

(2)用磨砂膠帶仔細(xì)解離云母直至表層平滑完整；

(3)用移液器移取50 μL待測溶液，輕輕滴在剛剛解離好的云母表面，室溫下培育5 min，將玻璃皿蓋在載玻片上方，防止樣品被污染；

(4)沉積完成后，將云母片表面余液吸走，用約50 μL去離子水清洗10次左右，用氮?dú)廨p輕吹干，置于干燥箱里約1 h待掃描。

圖5 原子力樣品制備步驟示意圖Fig.5 Procedure of the sample preparation for AFM

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 DNA電泳遷移率測量結(jié)果

從B.I.Shklovskii研究小組的理論可知，當(dāng)多價(jià)抗衡離子的濃度達(dá)到一個(gè)臨界值時(shí)，結(jié)合在DNA表面的抗衡離子的總電荷大于DNA的表面電荷，使得DNA的凈電荷的符號發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，這種現(xiàn)象就叫做DNA的電荷逆轉(zhuǎn)。

通過DLS實(shí)驗(yàn)，DNA的電泳遷移率測量結(jié)果如表1和圖6所示。表1是DNA在不同濃度組氨酸溶液中的電泳遷移率，圖6是根據(jù)表1中數(shù)值所畫出的曲線圖?？梢钥闯觯S著組氨酸濃度的改變，DNA的電泳遷移率逐漸變大然后趨于穩(wěn)定達(dá)到飽和狀態(tài)，當(dāng)組氨酸濃度為0.1 mg/mL時(shí)，DNA的電泳遷移率為-0.62×10-4cm2·V-1·S-1左右，而當(dāng)組氨酸濃度為1 mg/mL時(shí)，DNA的電泳遷移率變?yōu)?.51×10-4cm2·V-1·S-1左右，這是因?yàn)殡S著組氨酸濃度的升高，溶液中正電荷增多，中和了DNA表面的負(fù)電荷，增強(qiáng)靜電相互作用，所以遷移率由負(fù)變?yōu)檎珼NA發(fā)生電荷逆轉(zhuǎn)。

表1 DNA在不同濃度組氨酸溶液中的電泳遷移率Table 1 The electrophoresis mobility of DNA in Histidine solution with different concentrations

圖6 不同濃度的組氨酸對DNA電泳遷移率的影響Fig.6 Electrophoretic mobility of DNA as a function of the concentration of Histidine

3.2 AFM觀察結(jié)果

改變組氨酸的濃度，觀察到DNA呈現(xiàn)出如圖7的形貌特征(實(shí)驗(yàn)時(shí)，混合溶液中添加的1 mmol/L Mg2+是為了使DNA更好地吸附到云母表面上，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會產(chǎn)生影響)。

從圖7中可以看出，隨著組氨酸濃度的升高，DNA的形貌變的越來越緊密。圖7a中組氨酸濃度為0.01 mg/mL，DNA呈自由松散的線狀，圖7b中組氨酸濃度為0.1 mg/mL，DNA的形狀相較于圖7a已有明顯的折疊聚集現(xiàn)象，圖7c中組氨酸濃度為1 mg/mL，DNA已經(jīng)凝聚成緊湊的球狀。

圖7 不同濃度的組氨酸與1 mmol/L Mg2+混合溶液中的DNA構(gòu)象Fig.7 DNA conformations at different concentrations of Histidine and in 1 mmol/L Mg2+ buffer

由于AFM掃描得到的是干燥狀態(tài)下的DNA結(jié)構(gòu)，這也許會與溶液中DNA的實(shí)際形貌有所不同，但是，根據(jù)AFM所掃描出的圖像可以得出，吸附在云母表面上的DNA只是高度會被壓縮，橫向的尺寸并不會有所改變，因此AFM只是將體系中的DNA壓扁，結(jié)構(gòu)不會發(fā)生變化。由于組氨酸溶液顯酸性，所以根據(jù)組氨酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)，我們推測，隨著組氨酸濃度的升高，其攜帶的正電荷越來越多，質(zhì)子化能力加強(qiáng)，中和了DNA表面的負(fù)電荷，導(dǎo)致DNA凝聚。

4 結(jié)論

本文主要通過DLS和AFM兩種實(shí)驗(yàn)方法，研究了組氨酸對DNA凝聚及電荷逆轉(zhuǎn)的作用。首先用DLS技術(shù)對DNA的電泳遷移率進(jìn)行測量，觀察到當(dāng)組氨酸濃度升高至1 mg/mL時(shí)，電泳遷移率由負(fù)變?yōu)檎珼NA發(fā)生電荷逆轉(zhuǎn)。同時(shí)，AFM實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著組氨酸濃度的升高，DNA分子逐漸堆積折疊，直至在組氨酸濃度為1 mg/mL時(shí)凝聚成球，說明了組氨酸可以導(dǎo)致DNA凝聚和電荷逆轉(zhuǎn)。由于組氨酸的等電位點(diǎn)為7.59，組氨酸殘基中的咪唑環(huán)包含兩個(gè)N原子，其中一個(gè)在具有重要生物學(xué)意義的pH范圍6～7時(shí)質(zhì)子化，所以可以相信組氨酸側(cè)鏈的質(zhì)子化和去質(zhì)子化對其帶電狀態(tài)起調(diào)節(jié)作用。像組氨酸這樣的聚胺類試劑對于DNA凝聚的作用，在生命體內(nèi)具有較高的借鑒意義，這對DNA凝聚的理論解釋進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)上的補(bǔ)充，也為研究組蛋白與DNA之間的相互作用提供了參考。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)溶液pH的變化也能夠?qū)NA凝聚的形貌產(chǎn)生影響，這將是今后的研究方向。