趙凱，葛菁華，王海

(青島蔚藍生物集團有限公司，山東 青島 266101)

植酸酶是一類特殊的磷酸單酯酶，能夠將植酸和植酸鹽中的磷酸基團逐一水解，最終釋放出肌醇和無機磷。飼料中磷以植酸磷的形式存在[1]，植酸磷很難被動物分解利用，未利用的磷從糞便中排出，不僅造成磷資源的浪費，而且對周圍的水體和環(huán)境造成污染。同時，植酸磷是一種抗營養(yǎng)因子，能降低動物對營養(yǎng)物質的利用[2-4]。在動物飼料中添加植酸酶能夠降解植酸鹽，從而改善磷和其他養(yǎng)分的消化吸收，減少養(yǎng)分排泄。植酸酶在飼料養(yǎng)殖中的應用，能夠增加磷的利用率，增加養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益，對提高畜禽生產效益及降低植酸磷對環(huán)境的污染有重要作用。

巴斯德畢赤酵母是被廣泛用來表達外源蛋白的甲醇營養(yǎng)型酵母表達系統(tǒng)。周晨研等[5]將黑曲霉XZ-3S木聚糖酶Xyn43A成熟肽基因通過表達載體轉化畢赤酵母，獲得兩株重組菌GS115/Xyn43A(Mut～+)和KM71/Xyn43A(Mut～s)，并對其發(fā)酵條件進行了初步優(yōu)化。王停停等[6]將來源于PaenibacilluscampinasensisG1-1的木聚糖酶編碼基因成功整合到畢赤酵母GS115基因組上，構建了高產木聚糖酶XynG1-1的畢赤酵母工程菌，采用響應面法對該工程菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。孫瑋遙等[7]以甲醇誘導型重組畢赤酵母NCY-2為研究菌株，在搖瓶水平上首先考察了誘導時間、甲醇含量、誘導pH及誘導溫度對蛋清溶菌酶表達的影響，然后通過正交試驗設計優(yōu)化出了該菌株的最佳發(fā)酵條件，并進一步研究了搖瓶發(fā)酵過程中的菌體生長和酶活力隨時間的變化規(guī)律。

通過重組畢赤酵母高密度發(fā)酵生產植酸酶以提高其發(fā)酵酶活是目前植酸酶研究的熱點之一。宋瑪麗等[8]對來源于大腸桿菌的植酸酶基因appA 進行突變獲得植酸酶基因突變體appA-2QN，為提高該植酸酶的表達量，降低植酸酶的生產成本，對表達該酶的重組酵母菌GS115 /appA-2QN 進行了高密度發(fā)酵研究。黃魁英等[9]對植酸酶畢赤酵母基因工程菌PEY-2的發(fā)酵條件進行研究，在搖瓶中對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，并在此基礎上實現(xiàn)了50 L發(fā)酵罐的高密度發(fā)酵。Meenakshisundaram等[10]將來源于AspergillusficuumNRRL 3135的植酸酶基因 PhyA整合到畢赤酵母GS115上，初步優(yōu)化后，在4 L發(fā)酵罐上進行發(fā)酵，酶活是野生型菌的509倍。武婕等[11]對近年畢赤酵母工程菌高密度發(fā)酵研究做了綜述報道，并對畢赤酵母工程菌高密度發(fā)酵進行了展望。從已發(fā)表的文獻中可以看到，畢赤酵母高密度發(fā)酵表達外源蛋白已成為大多數(shù)研究者的共識并被廣為采用，然而對不同菌密度對畢赤酵母表達植酸酶的影響的相關研究未見報道。本文對誘導前不同菌密度對發(fā)酵產植酸酶的影響進行了優(yōu)化，旨在找到最優(yōu)發(fā)酵菌密度。

1 研究方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

重組畢赤酵母基因工程菌(Mut+)，由本公司自行構建，分泌表達植酸酶。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基為BSM培養(yǎng)基(用葡萄糖替換甘油)。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

將保藏菌種接種到50 mL的YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24 h，再按照10%接種量接種YPD培養(yǎng)基擴培16～24 h，然后按照8%接種量接入發(fā)酵罐BSM培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.2 發(fā)酵控制

發(fā)酵實驗在50 L發(fā)酵罐中進行，流加氨水控制pH 5.0，底糖耗盡后通過流加糖(60%葡萄糖，含12 mL/L PTM1)增加濕重，根據(jù)實驗需求分別將濕重增加至180、240、300、350 g/L，隨后以相同方式流加甲醇誘導植酸酶表達。

1.2.3 分析方法

細胞濕重測定：10 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min后棄上清稱重；植酸酶酶活測定：GB/T 18634—2009飼用植酸酶活性的測定分光光度法[12]。

2 結果與討論

2.1 對照180 g/L濕重開始甲醇誘導

發(fā)酵液底料中含有30 g/L葡萄糖，葡萄糖耗盡之后溶氧回升，此時開始流加60%的葡萄糖直至誘導所需濕重180 g/L(大約發(fā)酵時間24 h)，之后停止流加葡萄糖，饑餓30 min左右，開始流加甲醇誘導產酶。甲醇流加速度從1 g/(L·h)開始，每兩小時提高0.5 g/(L·h)，直到甲醇流加速度為4.5 g/(L·h)時，停止繼續(xù)提高，并以該流速至發(fā)酵結束。

圖1 對照酶活濕重曲線Fig.1 Enzyme activity and wet cell weight profile of the control group

由圖1可知，發(fā)酵38 h時(大約誘導后12 h左右)，濕重192 g/L，酶活963 U/mL，隨后酶活和濕重隨發(fā)酵時間一直增加，至發(fā)酵182 h時下罐，此時濕重461 g/L，酶活19 222 U/mL。

2.2 240 g/L濕重開始甲醇誘導

底糖及流加糖階段與180 g/L相同，流加60%的葡萄糖直至誘導所需濕重240 g/L，之后誘導階段調控策略與180 g/L相同。

圖2 240 g/L濕重開始甲醇誘導時的酶活濕重曲線Fig.2 Enzyme activity and wet cell weight profile under the condition of initial methanol induction wet cell weight of 240 g/L

由圖2可知，發(fā)酵38 h時，濕重243 g/L，酶活1 377 U/mL，隨后酶活和濕重隨發(fā)酵時間一直增加，至發(fā)酵182 h時下罐，此時濕重487 g/L，酶活20 383 U/mL。

2.3 300 g/L濕重開始甲醇誘導

底糖及流加糖階段與180 g/L相同，流加60%的葡萄糖直至誘導所需濕重300 g/L，之后誘導階段調控策略與180 g/L相同。

由圖3可知，發(fā)酵38 h時，濕重294 g/L，酶活1 726 U/mL，隨后酶活和濕重隨發(fā)酵時間一直增加，至發(fā)酵182 h時下罐，此時濕重506 g/L，酶活21 666 U/mL。

圖3 300 g/L濕重開始甲醇誘導時的酶活濕重曲線Fig.3 Enzyme activity and wet cell weight profile under the condition of initial methanol induction wet cell weight of 300 g/L

2.4 350 g/L濕重開始甲醇誘導

底糖及流加糖階段與180 g/L相同，流加60%的葡萄糖直至誘導所需濕重350 g/L，之后誘導階段調控策略與180 g/L相同。

圖4 350 g/L濕重開始甲醇誘導時的酶活濕重曲線Fig.4 Enzyme activity and wet cell weight profile under the condition of initial methanol induction wet cell weight of 350 g/L

由圖4可知，發(fā)酵38 h時，濕重340 g/L，酶活1 285 U/mL，隨后酶活和濕重隨發(fā)酵時間一直增加，至發(fā)酵182 h時下罐，此時濕重513 g/L，酶活19 194 U/mL。

3 結論

隨著初始誘導濕重的增加，最終發(fā)酵酶活呈現(xiàn)出先增后降的拋物線趨勢，以180、240、300、350 g/L初始誘導濕重誘導，最終下罐酶活分別為19 222、20 383、21 666、19 194 U/mL，最終下罐濕重分別為461、487、506、513 g/L。本文初始誘導濕重300 g/L時，發(fā)酵酶活最高，達到21 666 U/mL，分別比180、240、350 g/L高12.7%、6.3%、12.9%。由此可以推測該菌最適誘導濕重在240～350 g/L之間，而考慮到初始誘導濕重越高，最終發(fā)酵液中菌體含量越高，相應發(fā)酵上清酶液越少，植酸酶收率越低，所以應該平衡好酶活提高及濕重增加之間的關系，本文最適誘導濕重300 g/L，建議最適誘導濕重范圍240～300 g/L。

初始誘導濕重的不同，影響發(fā)酵過程中菌體密度，而高密度發(fā)酵是畢赤酵母基因工程菌提高外源表達量的重要策略之一。從本文結果來看，菌體發(fā)酵密度也并不是越高越好，而是有一個最適濕重區(qū)間，而發(fā)酵結束時的高濕重對后處理及酶的收率也有很大的影響。因此，對不同的菌種采用不同的誘導濕重是很有必要的，應在菌體生長和產酶之間找到最優(yōu)的發(fā)酵方案。