王青 羅歡 徐麗麗 王賓 劉煥娜 楊乃龍

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 青島 266003

他汀類(lèi)藥物(statins)在臨床上多用于高脂血癥及心腦血管疾病的治療，此前有研究表明，他汀類(lèi)藥物能促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)的表達(dá)，修復(fù)骨微細(xì)結(jié)構(gòu)，對(duì)骨代謝有一定影響[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是指當(dāng)機(jī)體處于缺血缺氧、氧化應(yīng)激、功能蛋白基因突變、鈣離子失衡、脂質(zhì)合成紊亂等情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)失去正常的生理功能，通過(guò)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)性應(yīng)答反應(yīng)，是細(xì)胞的適應(yīng)性調(diào)節(jié)過(guò)程[2]。近幾年研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路可能參與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，從不同途徑影響骨代謝平衡，但其具體機(jī)制仍未明確，與骨質(zhì)疏松的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)擬研究阿托伐他汀鈣對(duì)3T3-E1細(xì)胞增殖及分化的影響，進(jìn)一步探討該過(guò)程與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系，為骨質(zhì)疏松的臨床治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

3T3-E1細(xì)胞(由中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供)；α-DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清、雙抗(美國(guó)Hyclone公司)；TRIZOL(美國(guó)Gibco公司)；Cell Counting Kit-8細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)>試劑盒、堿性磷酸酶染色試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒(北京天根生化科技公司)；引物(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；阿托伐他汀鈣(輝瑞制藥有限公司，商品名：立普妥)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.13T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)：將-80 ℃冰箱凍存的細(xì)胞立即投入37～40 ℃水浴箱，水中晃動(dòng)直至凍存液全部融化。細(xì)胞懸液移入離心管內(nèi)，加培養(yǎng)液5 mL并吹打混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀里加10%FBS的α-DMEM5 mL，輕輕混合均勻后接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，每?jī)商鞊Q液一次，當(dāng)細(xì)胞匯合至80%左右時(shí)傳代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK-8比色法測(cè)定阿托伐他汀鈣對(duì)細(xì)胞增殖的影響：細(xì)胞懸液以1×105/mL密度接種到96孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，加入含不同濃度阿托伐他鈣0 mol/L(對(duì)照組)、10-8、10-7、10-6mol/L的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，作用24 h分別于每孔加10 μLCCK-8試劑，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值(OD值)。

1.2.3堿性磷酸酶活性檢測(cè)：成骨細(xì)胞懸液以1×105/mL密度接種到96孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板，測(cè)定孔加入0 mol/L(對(duì)照組)、10-8、10-7、10-6mol/L阿托伐他汀鈣處理24 h后的上清液5 μL，測(cè)定孔均設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。按堿性磷酸酶試劑盒步驟加入同比例的緩沖液和基質(zhì)液，充分混合均勻，37 ℃水溶15 min，加入150 μL顯色劑，輕輕振搖孔板混勻，于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)定各孔吸光度(OD值)。

1.2.4RT-PCR法檢測(cè)成骨細(xì)胞Bip、PERK、Eif2a基因的相對(duì)表達(dá)水平：向細(xì)胞中加入終濃度10-6mol/L阿托伐他汀鈣干預(yù)細(xì)胞24 h，用Trizol法提取細(xì)胞樣本中總RNA。RNA定量后按照試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：總體積20 μL，包括：2*SuperReal PreMix Plus10 μL，上游、下游引物各0.6 μL，Cdna 2 μL，50*ROX Reference Dye0.4 μL，RNase-Free ddH2O 6.4 μL補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃15 min，95℃10 s，58℃30 s，72℃30 s，40個(gè)循環(huán)。基因引物及序列見(jiàn)表1，應(yīng)用熔解度曲線法鑒定產(chǎn)物的片段大小與特異性，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的Ct值與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各標(biāo)本所含基因的模板量，mRNA的相對(duì)表達(dá)量以公式2-△△Ct計(jì)算。

表1 基因序列及其引物Table 1 The sequence of gene primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 3T3-E1細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

復(fù)蘇培養(yǎng)24 h后細(xì)胞呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)，胞質(zhì)豐富，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，形態(tài)近似為梭形、多角形等。如圖1。

2.2 阿托伐他汀鈣對(duì)3T3-E1細(xì)胞增殖和ALP活性的影響

不同濃度的阿托伐他汀鈣(0、10-8、10-7、10-6mol/L) 作用于細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組比較，各組的3T3-E1細(xì)胞OD值及ALP活性均增加，且以高濃度組的阿托伐他汀鈣(10-6mol/L)增加最明顯(P<0.05)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度阿托伐他汀鈣對(duì)3T3-E1細(xì)胞增殖和ALP活性的影響Table 2 Effects of atorvastatin calcium with different concentrations on proliferation and ALP activity of 3T3-E1 cells

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001; 實(shí)驗(yàn)組間比較，P<0.05

圖1 3T3-E1細(xì)胞形態(tài)觀察(×100)注:箭頭()所指為典型的梭形成骨前體細(xì)胞(3T3-E1細(xì)胞)Fig.1 Morphology of 3T3-E1 cell(×100)

2.3 阿托伐他汀鈣對(duì)3T3-E1細(xì)胞Bip、PERK、Eif2a基因表達(dá)的影響

選取對(duì)細(xì)胞增殖及分化能力作用最佳的10-6mol/L的阿托伐他汀鈣干預(yù)3T3-E1細(xì)胞24 h，RT-PCR結(jié)果顯示，3T3-E1細(xì)胞Bip、PERK、eIF2α基因mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 阿托伐他汀鈣(10-6 mol/L)對(duì)3T3-E1細(xì)胞Bip、PERK、Eif2a基因表達(dá)的影響

注：與對(duì)照組(0 mol/L)相比，*P<0.05

3 討論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP) 是以低骨量、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，引起骨質(zhì)脆性增加和易于發(fā)生骨折的全身性代謝性疾病。目前中國(guó)60歲以上人口>2.1億，65歲以上人口>1.4億，已居全球老年人口絕對(duì)數(shù)最高[3]。他汀類(lèi)藥物屬于3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(MG-CoA)還原酶抑制劑，可以減少肝內(nèi)膽固醇的生物合成，降低血清膽固醇濃度，是臨床最常用的調(diào)脂藥物之一[4]。數(shù)年前Mundy等[5]最早發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)藥物可激活成骨細(xì)胞，誘導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)基因表達(dá)，刺激骨形成。動(dòng)物研究表明，他汀類(lèi)藥物能夠介導(dǎo)堿性磷酸酶活性的增強(qiáng)，以及促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、血管上皮生長(zhǎng)因子和骨鈣素在成骨細(xì)胞中的表達(dá)，促進(jìn)來(lái)自小鼠顱蓋骨的3T3-E1細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化和礦化[6]。他汀類(lèi)藥物的合成代謝作用，類(lèi)似于飲食所賦予的具有抗破骨細(xì)胞活性和骨保護(hù)活性的類(lèi)異戊二烯，具有HMG CoA還原酶抑制活性的生育三烯酚，它們能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞生成，抑制破骨細(xì)胞分化并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，這些作用提示他汀類(lèi)藥物作為3-羥基3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，可能與骨代謝有關(guān)[7]。Meier[8]、Wang等[9]多項(xiàng)回顧性分析與調(diào)查結(jié)果顯示，他汀類(lèi)藥物能恢復(fù)骨骼細(xì)微結(jié)構(gòu)，增加骨密度、降低骨折風(fēng)險(xiǎn)。Meta分析結(jié)果亦有顯示，他汀類(lèi)藥物能夠提高糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥患者的腰椎、Ward三角區(qū)、GBP骨密度，但對(duì)股骨頸、大轉(zhuǎn)子、及粗隆的骨密度提高不明顯。對(duì)于糖尿病合并骨質(zhì)疏松癥的患者，雖然他汀類(lèi)藥物在實(shí)際臨床工作中應(yīng)用的整體療效不是很理想，但此為今后的關(guān)于他汀類(lèi)藥物作為一種調(diào)脂藥物是否能夠應(yīng)用于骨質(zhì)疏松領(lǐng)域提供了參考[10]。他汀類(lèi)藥物可謂是一種具有潛力的促進(jìn)骨形成藥物。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞重要的膜性細(xì)胞器，主要負(fù)責(zé)蛋白的合成、修飾與加工、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外鈣離子穩(wěn)態(tài)。各種應(yīng)激能夠破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)非折疊蛋白與錯(cuò)誤折疊的蛋白過(guò)度蓄積，由此引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)[11,12]，UPR的出現(xiàn)可能提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。UPR是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78/BIP(glucose-regulated protein78/immunoglobulin binding protein，GRP78/BiP)與PERK、IRE-1、ATF6 3個(gè)感受蛋白介導(dǎo)，生理狀態(tài)下，GRP78/BiP與PERK、ATF6、IRE-1感受蛋白結(jié)合，處在無(wú)活性狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，未折疊蛋白于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積，導(dǎo)致GRP78/BiP從上述3種感受蛋白上解離，進(jìn)而結(jié)合未折疊蛋白，解離后的感受蛋白被活化，并啟動(dòng)UPR，減少未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的堆積，最終恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能[13,14]。

PERK是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，與GRP78/BiP解離后可以促進(jìn)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外側(cè)的真核細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯起始復(fù)合體2α(eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，磷酸化之后的eIF2α能抑制大多數(shù)mRNA的翻譯，并減少蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的加工負(fù)荷，利于恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[15]。Zhang等[16,17]利用可阻止PERK下游的eIF2α去磷酸化的化合物Salubrinal進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，揭示了由Salubrinal作用后增加的eIF2α磷酸化降低了小鼠骨髓細(xì)胞中破骨細(xì)胞分化，通過(guò)PERK-eIF2α-ATF4信號(hào)通路增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化，首次報(bào)道了通過(guò)增加eIF2α磷酸化發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松活性。Hamamura等[18]研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過(guò)調(diào)節(jié)ATF4/CHOP信號(hào)通路進(jìn)而增強(qiáng)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化能力。這些實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與骨骼發(fā)育可能和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)，推測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能成為骨骼疾病的治療靶點(diǎn)[19,20]。

本試驗(yàn)通過(guò)體外給予不同濃度的阿托伐他汀鈣干預(yù)培養(yǎng)3T3-E1細(xì)胞，24 h后觀察到阿托伐他汀鈣可促進(jìn)細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞ALP活性，在10-6mol/L作用最顯著。以終濃度10-6mol/L阿托伐他汀鈣干預(yù)細(xì)胞，RT-PCR法觀察Bip、PERK、Eif2a基因表達(dá)均相對(duì)增加。

綜上所述，該體外實(shí)驗(yàn)所選擇的藥物濃度及作用時(shí)間下，利于成骨細(xì)胞增殖，可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路的標(biāo)志性基因Bip、PERK、Eif2a的表達(dá)，推測(cè)阿托伐他汀鈣發(fā)揮骨保護(hù)作用的機(jī)制可能與Bip-PERK-Eif2a等信號(hào)通路有關(guān)，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作為有效靶點(diǎn)參與骨質(zhì)疏松的機(jī)制尚需進(jìn)一步證實(shí)。目前多數(shù)研究局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，人體實(shí)驗(yàn)缺少循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，缺乏多中心、大樣本、前瞻性的規(guī)范性研究，且他汀類(lèi)藥物主要通過(guò)肝腎代謝，如何提高他汀類(lèi)藥物對(duì)靶組織的作用以促進(jìn)藥物吸收、發(fā)揮促骨形成作用還有待研究[21]。