戎亦驪，潘永明，黃俊杰，徐孝平，朱科燕，陳方明，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所，杭州 310053)

高血壓(hypertension)是一種最常見的復(fù)雜多因素的慢性疾病，其形成與遺傳和環(huán)境因素密切相關(guān)，導(dǎo)致正常血壓調(diào)節(jié)機(jī)制失代償所造成。因此，對(duì)高血壓的發(fā)病機(jī)制和防治研究一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。流行病學(xué)和大量臨床實(shí)踐表明高脂飲食和鹽的攝入量與高血壓發(fā)病率、平均血壓水平密切相關(guān)，已成為高血壓發(fā)病的主要環(huán)境因素[1]。

近來，關(guān)于高血壓疾病動(dòng)物模型主要以大小鼠為主，多為自發(fā)性、鹽敏感性以及采用手術(shù)法結(jié)扎腎動(dòng)脈而建立的高血壓模型[2-4]。這類模型遺傳背景較明確且性狀穩(wěn)定，但與人類的種屬差異較大。此外，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型如TGR(mREN2)27轉(zhuǎn)基因大鼠[5]及敲除血管緊張素轉(zhuǎn)化酶或血管緊張素II-1型受體基因的小鼠等，僅適宜探究特定基因在高血壓發(fā)病中的機(jī)制，不能完全反映人類高血壓疾病的發(fā)生，并對(duì)技術(shù)要求較高。而小型豬的心血管、消化代謝、解剖結(jié)構(gòu)和分布等方面與人類十分相似，體型較小，易于飼養(yǎng)管理，是研究代謝性心血管疾病非常理想的動(dòng)物模型。因此，本文利用小型豬作為研究對(duì)象，采用高脂高鹽飲食環(huán)境因素更能模擬人類自然狀態(tài)下高血壓發(fā)生進(jìn)程，也能更好的適用于研究人類高血壓發(fā)生的病理機(jī)理，為高血壓的防控與治療提供新的研究手段和途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)4 ～ 5月齡巴馬小型豬18只，雄性，體重為8 ～ 10 kg，由吳江市田宇生物科技有限公司提供【SCXK(蘇)2016-0006】，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心普通級(jí)實(shí)驗(yàn)室【SYXK(浙)2013-0184】，環(huán)境溫度為(22±1)℃，相對(duì)濕度為45% ～ 65%。飼喂全價(jià)營養(yǎng)飼料和自由飲水，12 h/12 h明暗交替，所有小型豬的操作程序均符合浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理與倫理委員會(huì)要求(倫理批準(zhǔn)號(hào)：ZLL-2016-160)。

1.1.2 主要儀器和試劑

血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)等試劑盒均購自上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司；內(nèi)皮素1(ET-1)、腎素(renin)、血管緊張素II(Ang II)、水通道蛋白-2(AQP-2)、血管加壓素(AVP)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等ELISA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；全自動(dòng)生化分析儀(7020，日立公司，日本)、連續(xù)光譜酶標(biāo)儀(Thermo Varioskan Flash，Thermo Fisher 公司，芬蘭)；大動(dòng)物無創(chuàng)生理信號(hào)遙測(cè)系統(tǒng)(EMKA公司，法國)，冷凍病理切片儀(CM1900，徠卡公司，美國)，全自動(dòng)病理掃描切片儀(Nanozoomer S210，濱松公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法

適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察3周后，巴馬小型豬禁食不禁水12 h后前腔靜脈穿刺取血，測(cè)定肝腎功能、血脂等指標(biāo)均無異常者后，按體重隨機(jī)分成正常對(duì)照組(normal control group, NC)、高脂組(high fat diet group, HF)和高脂高鹽組(high fat /high salt diet group, HFHS)，每組6只。NC組每天飼喂基礎(chǔ)飼料，HF組每天飼喂高脂飼料(1.5%膽固醇，15%油脂，10%蛋黃粉，73.5%基礎(chǔ)飼料)，HFHS組每天飼喂高脂高鹽飼料(4%食鹽，1.5%膽固醇，15%油脂，10%蛋黃粉，69.5%基礎(chǔ)飼料)，各組均按體重 2.5%的飼喂量分成兩等份，一日兩次，每2周稱重并調(diào)整飼喂量。造模期間每天觀察各組巴馬小型豬的精神行為、飲食飲水和糞便尿液，記錄造模24周時(shí)小型豬體重。造模24周后處死各組動(dòng)物，取樣檢測(cè)。

1.2.2 觀察指標(biāo)

(1)生化指標(biāo)測(cè)定

取造模后24 周各組巴馬小型豬的前腔靜脈肝素抗凝血3 mL，分離血漿，測(cè)定血糖(GLU)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)。

(2)無創(chuàng)血壓測(cè)定

在造模8周、16周和24周時(shí)，對(duì)巴馬小型豬進(jìn)行為期3 d的吊床適應(yīng)訓(xùn)練，然后固定在吊床適應(yīng)15分鐘后，采用袖套法用EMKA無創(chuàng)生理遙測(cè)系統(tǒng)監(jiān)測(cè)小型豬尾部動(dòng)脈血壓，分析收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)。

(3)ET-1、Renin、Ang-II、AQP-2、AVP和VEGF含量測(cè)定

按ELISA試劑盒說明書，檢測(cè)造模后24周時(shí)各組血漿中內(nèi)皮素1(ET-1)、腎素(Renin)、血管緊張II(Ang II)、水通道蛋白-2(AQP-2)、血管加壓素(AVP)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的水平。

(4)肝、腎重量和病理組織學(xué)觀察

造模結(jié)束后，用3%戊巴比妥鈉溶液1.0 mL/kg耳緣靜脈注射麻醉后并放血處死小型豬，取各組小型豬的肝及左右兩側(cè)腎并稱重，同時(shí)取部分肝和腎組織進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為8 μm，進(jìn)行油紅O染色，觀察肝及腎病理變化和脂質(zhì)沉積情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般觀察和生化檢測(cè)

由表1可見，在造模期間，NC組小型豬的精神行為良好，毛色光澤，飲食飲水和糞便尿液等均無明顯異常，且體重呈正常模式增長；HF組小型豬的精神行為良好，毛色油膩，飲食飲水和糞便尿液均未見明顯異常，但體重顯著高于NC組(P< 0.01)；另外，HFHS組小型豬的精神行為尚可，毛色油膩且枯燥，飲食飲水和糞便尿液亦未見異常，體重亦明顯高于NC組(P< 0.05)。與NC組比，HF組和HFHS組小型豬TC和CREA水平均顯著增加(P< 0.05,P< 0.01)；同時(shí)HFHS組BUN水平亦顯著降低(P<0.05)，其余指標(biāo)各組間差異均無顯著性(P> 0.05)。

表1 血糖血脂和肝腎功能Table 1 Blood glucose and lipids, and liver and kidney function of the n=6)

注：與NC組比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the NC group,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.2 血壓變化

由圖1可見，在造模期間，NC組SBP和DBP均穩(wěn)定在一定的水平，未見明顯的變化。但造模8周后HF組和HFHS組小型豬的血壓均明顯升高，其中HFHS組造模8周時(shí)SBP已超過130 mmHg且DBP達(dá)到80 mmHg以上，已達(dá)到臨床1級(jí)高血壓標(biāo)準(zhǔn)，造模至24周時(shí)SBP能繼續(xù)穩(wěn)定在130 mmHg以上且DBP有繼續(xù)升高并達(dá)到95 mmHg以上，而HF組SBP在高脂飼喂24周時(shí)血壓剛達(dá)到130 mmHg且DBP亦超過90 mmHg以上；且HFHS組SBP和DBP的上升曲線均高于HF組。與NC組比，造模后24周時(shí)SBP和DBP均顯著高于NC組(P< 0.05，P< 0.01)。

注：A和B分別為造模8,16,24周時(shí)各組收縮壓和舒張壓的變化曲線；C和D分別為造模24周時(shí)各組收縮壓和舒張壓變化。與NC組比，*P< 0.05,**P< 0.01。(下圖同)圖1 收縮壓及舒張壓變化Note. Figures A and B are the changes of systolic pressure and diastolic pressure in each group at 8, 16, and 24 weeks after modeling, respectively. Figures C and D are the changes of systolic pressure and diastolic pressure in each group at 24 weeks after modeling. Compared with the NC group,*P< 0.05,**P< 0.01.(The same in the following Figures)Figure 1 Changes of systolic and diastolic blood pressures in the minipigs

圖2 ET-1、Renin、Ang-II、AQP-2、AVP和VEGF含量Figure 2 The contents of ET-1 (A), renin (B), Ang II (C), AQP-2 (D), AVP (E) and VEGF (F) in the minipigs

2.3 ET-1、Renin、Ang-II、AQP-2、AVP和VEGF含量

由圖2可見，與NC組比，HF組除ET-1含量顯著升高(P< 0.05)外，其余指標(biāo)亦有升高趨勢(shì)，但差異無顯著性(P> 0.05)，而HFHS組的ET-1、Renin、Ang-II、AQP-2、AVP的含量均顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)，且VEGF含量亦有升高趨勢(shì)，但差異無顯著性(P> 0.05)。

2.4 肝、腎指數(shù)與組織病理學(xué)觀察

由圖3A/C可見，與NC組比，HF組和HFHS組小型豬肝和腎臟指數(shù)均顯著增加(P< 0.05，P< 0.01)；油紅“O”染色顯示，NC組肝、腎未見明顯的脂質(zhì)沉積和異常的病理改變，HF組和HFHS組小型豬肝肝小葉和腎間質(zhì)中均有脂質(zhì)沉積，但HF組肝和腎組織中脂肪沉積均高于HFHS組(圖3B/D)；同時(shí)HF組和HFHS組小型豬腎小球直徑增大，腎小管擴(kuò)張和腎小動(dòng)脈管壁增厚； HFHS組腎內(nèi)有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(圖3B)。

注：圖A為各組腎臟系數(shù)，圖C為各組肝臟系數(shù)，圖B和圖D為腎組織及肝組織油紅O染色，黑色箭頭所示為脂質(zhì)沉積。圖3 肝、腎指數(shù)與組織油紅“O”染色病理變化Note. A. The kidney coefficient in each group. C. The liver coefficient in each group. B,D. Pathological changes of kidney and liver in each group, oil red O staining. The black arrow shows lipid deposition.Figure 3 Liver and kidney coefficients and pathological changes revealed by oil red “O” staining

3 討論

隨著人們生活水平的提高和飲食方式的改變，高脂、高鹽飲食在當(dāng)前人類飲食譜中普遍存在，但隨之而來的各種代謝性疾病的發(fā)生率呈高發(fā)趨勢(shì)，如高血壓、高血脂和冠心病等，嚴(yán)重影響著人類的生命健康。在我國，北方和寒冷地區(qū)的人群鹽攝入量高于南方和沿海地區(qū)，其人群的平均血壓及高血壓患病率也相應(yīng)較高[6]。另一方面長期攝入高脂食物的人易發(fā)生肥胖，而肥胖的人皮下脂肪會(huì)增厚，使毛細(xì)血管擴(kuò)充，血液循環(huán)量相對(duì)增加，在心率正常的情況下，心搏出量大為增加，長期負(fù)擔(dān)過重則會(huì)誘發(fā)左心肥厚，從而引起血壓升高[7]。由此可見，高鹽和高脂的攝入與高血壓患病率均密切相關(guān)，故從環(huán)境因素—飲食的角度，研究并建立高血壓疾病動(dòng)物模型，對(duì)高血壓疾病的預(yù)防和干預(yù)具有重要意義。本研究采用高脂高鹽飲食建立巴馬小型豬高血壓模型，本研究發(fā)現(xiàn)小型豬高脂高鹽飲食后表現(xiàn)出體重增加、TC和CREA水平均顯著升高，BUN水平降低，并出現(xiàn)肝、腎指數(shù)升高等生理變化，表明高脂高鹽飲食能導(dǎo)致小型豬脂質(zhì)代謝和腎代謝功能的紊亂，并在誘導(dǎo)8周后SBP達(dá)到(131.67±5.27)mmHg，DBP達(dá)到(86.15±3.67)mmHg，已達(dá)到最新美國高血壓指南中高血壓1期的標(biāo)準(zhǔn)[SBP：(130～139) mmHg/DBP：(80～89) mmHg為1級(jí)高血壓][8]，繼續(xù)造模至24周時(shí)SBP略有上升且維持在130 mmHg以上，同時(shí)DBP水平持續(xù)升高并達(dá)到(95.17±3.68)mmHg；同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)單純高脂飲食誘導(dǎo)后小型豬血壓亦有所增高，但病程發(fā)展較緩慢，直到造模至24周時(shí)才達(dá)到高血壓1級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，即SBP為(130.18±4.51)mmHg，DBP為(90.44±2.56)mmHg。由此可見，高脂高鹽飲食能明顯縮短小型豬高血壓造模時(shí)間，加速血壓升高。

本研究發(fā)現(xiàn)高鹽和高脂飲食雖無明顯引起小型豬肝功能的異常，但本研究采用相同的喂養(yǎng)方式且小型豬吃這兩種飲食能量和代謝情況也相差無幾，卻意外發(fā)現(xiàn)HFHS組小型豬的體重增長卻低于HF組，這是否提示鹽飲食對(duì)消化效率有著相對(duì)顯著的影響，鹽可能減少機(jī)體對(duì)食物中脂肪的吸收，而這一現(xiàn)象在油紅O病理染色中也同樣觀察到HFHS組肝和腎脂肪沉積均低于HF組；而這結(jié)果與Benjamin 等[9]發(fā)現(xiàn)鈉飲食能抑制高脂飲食小鼠的體重較為一致，表明鈉降低消化道對(duì)食物中脂肪的吸收有關(guān)。

大量的研究已證實(shí)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在調(diào)節(jié)血壓和水鹽代謝環(huán)節(jié)中起著樞紐作用，其中Ang II是維持和升高血壓的關(guān)鍵核心因子，不僅能引起血管的收縮，還能促進(jìn)細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的增多，并能誘導(dǎo)血管壁產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能的紊亂等[10-11]。本研究中同樣觀察到高脂高鹽飲食后小型豬體內(nèi)血漿內(nèi)皮素-1、腎素和血管緊張素II水平均明顯升高，但單純高脂飲食組僅表現(xiàn)出血漿內(nèi)皮素-1水平的升高，對(duì)腎素和血管緊張素II水平雖有升高趨勢(shì)但未見明顯差異，這也表明高鹽的因素加入不僅促進(jìn)高脂飲食誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能紊亂，還激活了RAS系統(tǒng)，導(dǎo)致高血壓的發(fā)生。

近來研究發(fā)現(xiàn)高脂高鹽飲食或鹽飲食能促進(jìn)大鼠腎的損傷[12-13]，并在鹽性高血壓大鼠中腎AQP-2表達(dá)明顯增加[14]。腎是調(diào)節(jié)機(jī)體水平衡的主要器官，其AQPs含量最為豐富，而AQP-2僅見于腎集合管主細(xì)胞管腔側(cè)膜及胞內(nèi)囊泡內(nèi)，是水通道蛋白家族中的主要成員之一，是腎重吸收水分、尿液濃縮、調(diào)節(jié)水平衡的關(guān)鍵蛋白，也是腎內(nèi)外參與水代謝有關(guān)紊亂性疾病重要的分子基礎(chǔ)[15]。因此，AQP-2在調(diào)節(jié)機(jī)體腎水平衡時(shí)發(fā)揮重要的作用。但最近發(fā)現(xiàn)血管加壓素(AVP)靶向通過環(huán)磷酸腺苷(cAMP)機(jī)制調(diào)節(jié)AQP-2的表達(dá)，進(jìn)而影響水的重吸收，導(dǎo)致水鈉潴留[16]，故AQP-2是AVP依賴性水通道蛋白，且加壓素受體2能通過激活蛋白激酶A，調(diào)節(jié)腎集合管對(duì)水的通透性[17]。在本研究中發(fā)現(xiàn)長期高脂高鹽飲食后小型豬的腎指數(shù)增加且CREA水平也明顯升高，腎間質(zhì)有脂質(zhì)沉積，腎小管擴(kuò)張以及腎小動(dòng)脈管壁增厚和腎小球直徑增加等病理改變，這些異常改變證實(shí)了高脂高鹽飲食能導(dǎo)致靶器官腎損傷。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)高脂高鹽飲食后小型豬血漿AQP-2和AVP水平也出現(xiàn)顯著性升高，而在高脂組中差異無顯著性，提示高脂高鹽飲食能激活小型豬機(jī)體的AVP系統(tǒng)，導(dǎo)致水鈉潴留增加，進(jìn)一步使得舒張壓升高，促進(jìn)血壓上升。