李建軍，余露軍，蔡磊，魏遠(yuǎn)征，苗宗余，黃韌

(廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣東廣州 510663)

目前; 國外常用實驗魚類有斑馬魚(Daniorerio)、青鳉(Oryziaslatipes)等10余種國內(nèi)除斑馬魚外，還有劍尾魚(Xiphophorusheller)、稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)、實驗紅鯽(Carassiusauratusred variety)和諸氏鯔蝦虎魚(Mugilogobiuschulae)等[1]，其中僅諸氏鯔蝦虎魚為海水魚類。諸氏鯔蝦虎魚，屬于鱸形目(Perciformes)、蝦虎魚亞目(Gobioidei)、蝦虎魚科(Gobiidae)、鯔蝦虎魚屬(Mugilogobius)，為暖水性小型海洋魚類，廣泛分布于北至日本，西至中印半島，南至菲律賓及印度尼西亞等西太平洋海域，喜棲息于沿海、河口及潮間帶淺水區(qū)域[2]。諸氏鯔蝦虎魚具有體形小、胚胎透明、繁殖量大、繁殖周期短，飼養(yǎng)簡便等特點，作為一種潛在的海洋實驗魚類，在水生態(tài)毒理評價等領(lǐng)域已有較多研究[3-4]。另外，上海、山東、沈陽等多個省市的科研院所和環(huán)評機構(gòu)也利用諸氏鯔蝦虎魚在不同領(lǐng)域開展相關(guān)研究，目前諸氏鯔蝦虎魚的應(yīng)用領(lǐng)域和使用數(shù)量呈逐年上升趨勢。近年來，國家科技部非常重視魚類資源動物的實驗動物化工作。2013年，科技部啟動國家科技支撐項目：實驗動物質(zhì)量監(jiān)測體系的完善與檢測關(guān)鍵技術(shù)研究，其中廣東省實驗動物監(jiān)測所和上海實驗動物研究中心分別承擔(dān)諸氏鯔蝦虎魚和斑馬魚的標(biāo)準(zhǔn)化研究任務(wù)；2015年諸氏鯔蝦虎魚資源培育、實驗動物化和應(yīng)用研究等再次列入國家科技支撐項目：長爪沙鼠、裸鼴鼠等資源動物種群的標(biāo)準(zhǔn)化及疾病模型機制研究，這表明諸氏鯔蝦虎魚的研究和應(yīng)用實踐已得到廣泛重視和認(rèn)可。

1 資源培育

1.1 人工馴養(yǎng)與生物學(xué)特性研究

廣東省實驗動物監(jiān)測所從20世紀(jì)90年代開始由深圳大鵬灣等地沿岸淺水區(qū)采集諸氏鯔蝦虎魚進行人工馴養(yǎng)，并系統(tǒng)研究其形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、習(xí)性、食性、生長[5]及染色體組型[6]等生物學(xué)特征，實驗數(shù)據(jù)已上傳至國家自然科技資源平臺實驗動物資源庫。2005年，在自然海域連續(xù)采樣獲得野生條件下性腺周年發(fā)育規(guī)律的基礎(chǔ)上，以生殖細(xì)胞發(fā)育為指標(biāo)，優(yōu)化生態(tài)因子、營養(yǎng)成分和餌料投喂方案，結(jié)合催產(chǎn)管理技術(shù)策略，最終突破諸氏鯔蝦虎魚室內(nèi)全人工繁殖技術(shù)，獲國家發(fā)明專利授權(quán)(ZL 201410387745.8)。諸氏鯔蝦虎魚發(fā)育快(85 d性成熟)，繁殖周期短(15 ～20 d)，繁殖力強(單次產(chǎn)卵平均2090粒，平均孵化率70%)(表1)，廣溫，廣鹽，飼養(yǎng)簡便，具有諸多實驗動物培育與應(yīng)用優(yōu)勢。

諸氏鯔蝦虎魚室內(nèi)穩(wěn)定、可控培育是其實驗動物化的基礎(chǔ)。在全面研究諸氏鯔蝦虎魚全年均衡繁育、餌料培育、水處理、適用設(shè)施設(shè)備及環(huán)境因子監(jiān)測等技術(shù)要素的基礎(chǔ)上，經(jīng)多年運行、優(yōu)化，集成建立包括諸氏鯔蝦虎魚繁育管理、褶皺臂尾輪蟲、鹵蟲、蒙古裸腹溞和單胞藻類等配套餌料生物室內(nèi)高效培育及其可能攜帶的病原、有毒有害物質(zhì)監(jiān)測、海淡水處理監(jiān)測及環(huán)境因子調(diào)控等諸氏鯔蝦虎魚培育綜合技術(shù)體系，實現(xiàn)諸氏鯔蝦虎魚穩(wěn)定可控規(guī)?；喾庇?，為其深入研究和推廣應(yīng)用提供基礎(chǔ)保障。

表1 諸氏鯔蝦虎魚產(chǎn)卵量與孵化率*Table 1 The number of eggs and hatching rate of M. chulae

注：*引自國家科技支撐項目“魚類實驗動物新資源的開發(fā)與標(biāo)準(zhǔn)化研究No. 2015BAI09B05”項目結(jié)題報告。

Note.*The data are from Report of National Key Technology Support Program (No. 2015BAI09B05).

1.2 封閉群和近交系培育

封閉群和近交系是滿足實驗動物不同應(yīng)用需求、實現(xiàn)其應(yīng)用價值的重要載體。2009年始，在國家科技支撐項目和廣東省科技項目支持下，本實驗室從廣東省深圳大鵬灣海域采集諸氏鯔蝦虎魚原始群體，在實驗室內(nèi)馴化養(yǎng)殖后，挑選500尾健康諸氏鯔蝦虎魚(100尾雄魚、400尾雌魚)為封閉群繁殖親本，嚴(yán)格按照隨機交配原則，育成國際上首個海水實驗魚—諸氏鯔蝦虎魚封閉群。封閉群培育過程中，每一代繁殖親本維持在1000尾，總體種群數(shù)量維持在2萬余尾，目前封閉群繁育至第17代，未出現(xiàn)明顯生長和繁殖退化現(xiàn)象。

2012年，按照體型、體色等生物學(xué)性狀差異從諸氏鯔蝦虎魚封閉群挑選親本作為近交系培育基礎(chǔ)群，嚴(yán)格按照全同胞兄妹交配方式(full-sibling)，建立4個不同體征諸氏鯔蝦虎魚近交系(分別命名為SG-CB、SG-DB、OG-B、OG-D)，最高近交代數(shù)已達(dá)第12代(OG-B系)，親本數(shù)量6000余尾。采用20個優(yōu)選的微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記，利用STR分型技術(shù)對諸氏鯔蝦虎魚封閉群和近交系進行連續(xù)遺傳監(jiān)測，各群體遺傳背景清晰明確。建成國內(nèi)外規(guī)模最大的海水實驗魚種源基地，年生產(chǎn)量超過200萬尾，對外供應(yīng)量超20萬尾。

2 質(zhì)量控制

標(biāo)準(zhǔn)化是實驗動物區(qū)別于其他動物的重要特征，也是實驗動物推廣應(yīng)用的基本條件。迄今為止，我國尚無海水實驗魚質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。2009 年，《實驗動物 魚類環(huán)境與質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)》國家標(biāo)準(zhǔn)獲得立項(編號20091329-T-469)。隨后諸氏鯔蝦虎魚種質(zhì)、遺傳、微生物和寄生蟲、飼料及環(huán)境設(shè)施等方面的質(zhì)量控制技術(shù)研究全面展開。

2.1 遺傳

依據(jù)諸氏鯔蝦虎魚分類鑒定資料[2,7]和實測數(shù)據(jù)，諸氏鯔蝦虎魚的形態(tài)特征參數(shù)為：體呈紡錘形，頭扁平，體被圓鱗，第一背鰭下的頸背部有斜行帶狀條紋，尾鰭基部有兩個垂直排列的圓形或橢圓形斑點，第一背鰭第二至第四鰭棘末端延長呈絲狀，以第二和第三鰭棘最長(圖1)；第一背鰭具5 ～ 6鰭棘，第二背鰭具1鰭棘6 ～ 9鰭條，臀鰭具1鰭棘5 ～ 9鰭條，胸鰭12 ～ 17鰭條，腹鰭具1鰭棘7 ～ 11鰭條；縱列鱗28 ～ 30，橫列鱗8，背鰭前鱗11 ～ 14。諸氏鯔蝦虎魚雌、雄個體的體長和體重?zé)o明顯差異，雄魚的頭長顯著大于雌魚(P< 0.05)[5]，性成熟的雌魚腹部更為膨大(圖1-b)。

注：a. 雄魚，200日齡，體重0.72 g，體長3.27 cm；b. 雌魚，200日齡，體重0.34 g，體長2.70 cm。(bar=1 cm)圖1 諸氏鯔蝦虎魚Note. a. Male, 200 d, 0.72 g in body weight (BW) and 3.27 cm in total length (TL). b. Female, 200 d, 0.34 g in body weight (BW) and 2.70 cm in total length (TL). Scale bar=1 cm.Figure 1 Gross appearance of Mugilogobius chulae

由于蝦虎魚個體小，種類多(蝦虎魚科多達(dá)1800余種，僅鯔蝦虎魚屬就有32種)，體色退化、鰭條殘缺情況常見，僅憑形態(tài)特征，難免誤判。因此，在形態(tài)學(xué)種類鑒定方法的基礎(chǔ)上，通過測定、驗證諸氏鯔蝦虎魚及其近緣種的全線粒體DNA序列[8-9]，建立基于DNA條形碼技術(shù)的諸氏鯔蝦虎魚種質(zhì)鑒別方法。

采用磁珠富集法、轉(zhuǎn)錄組測序及簡化基因組測序(RAD-seq)技術(shù)，獲得諸氏鯔蝦虎魚多態(tài)性SSR標(biāo)記，并對諸氏鯔蝦虎魚野生群和封閉群進行STR分型檢測，優(yōu)選20對SSR標(biāo)記，建立基于無偏期望雜合度/純合度的諸氏鯔蝦虎魚遺傳質(zhì)量監(jiān)測方法，為諸氏鯔蝦虎魚遺傳質(zhì)量評估提供依據(jù)[10-11]。

諸氏鯔蝦虎魚封閉群和野生群STR分型結(jié)果顯示，其平均等位基因數(shù)(Na)和平均有效等位基因數(shù)(Ne)分別為7.3500和8.700、3.6824和4.0188，平均期望雜合度(He)分別為0.6924和0.7197。諸氏鯔蝦虎魚封閉群和野生群遺傳多樣性均較為豐富，諸氏鯔蝦虎魚封閉群遺傳多樣性低于野生群。諸氏鯔蝦虎魚封閉群遺傳雜合度在0.5 ～ 0.7之間，符合實驗動物封閉群雜合度要求。 諸氏鯔蝦虎魚近交群體STR分型結(jié)果顯示，SG系近交群體第1代、第4代和第7代平均期望遺傳純合度(EHom)分別為0.4940、0.6629和0.6748；OG系近交群體第1代、第2代、第5代和第8代平均期望遺傳純合度分別為0.4264、0.5587、0.6510和0.6897。

2.2 微生物與寄生蟲

對諸氏鯔蝦虎魚野生群和封閉群110個樣本病原調(diào)查(表2)及致病性分析結(jié)果表明，遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)[12]、河流弧菌(Vibirofluvialis)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)為諸氏鯔蝦虎魚野生環(huán)境下常見病原(表2)[12]。馴養(yǎng)過程諸氏鯔蝦虎魚曾感染副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、眼點淀粉卵鞭蟲(Amyloodiniumocellatum)、匹里蟲(Pleistophoraspp.)等病原。在此基礎(chǔ)上，制定諸氏鯔蝦虎魚病原監(jiān)控要求，并驗證了相關(guān)病原檢測方法。根據(jù)2008年農(nóng)業(yè)部公告《一、二、三類動物疫病病種名錄》和病原對諸氏鯔蝦虎魚的致病性，擬將嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華菌、刺激隱核蟲、眼點淀粉卵鞭蟲列為普通級(CV)諸氏鯔蝦虎魚監(jiān)測病原，將創(chuàng)傷弧菌、副溶血環(huán)境、河流弧菌、匹里蟲列為無特定病原體級(SPF)諸氏鯔蝦虎魚監(jiān)測病原。

表2 諸氏鯔蝦虎魚微生物和寄生蟲檢測結(jié)果*Table 2 Results of microbiological and parasitological detection of the M. chulae

注：*引自國家科技支撐項目“魚類實驗動物新資源的開發(fā)與標(biāo)準(zhǔn)化研究No. 2015BAI09B05”項目結(jié)題報告。

Note.*The data are from the Report of National Key Technology Support Program (No. 2015BAI09B05).

2.3 營養(yǎng)與飼料

比較了不同配方配合飼料和生物飼料對諸氏鯔蝦虎魚生長、發(fā)育和繁殖的影響[13-14]，確定了諸氏鯔蝦虎魚配方飼料適宜粗蛋白含量為42%～48%、粗脂肪含量≥6%、粗纖維≥5%、粗灰分≤16%、鈣≤3.5%、總磷為1.0%～1.6%。30日齡前的仔、稚魚投喂褶皺臂尾輪蟲，其后的幼、成魚及親魚投喂鹵蟲無節(jié)幼體可滿足其營養(yǎng)需求。諸氏鯔蝦虎魚飼料配方獲國家發(fā)明專利：一種諸氏鯔蝦虎魚生長配合飼料及其制備方法(ZL 201610525654.5)。

2.4 環(huán)境設(shè)施

通過研究諸氏鯔蝦虎魚適宜鹽度、pH范圍及非離子氨、亞硝酸鹽氮對諸氏鯔蝦虎魚仔魚的安全濃度，結(jié)合多年養(yǎng)殖過程中的環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)，諸氏鯔蝦虎魚養(yǎng)殖的適宜環(huán)境因子為：水溫22 ～ 30℃、日溫差≤4℃、瞬時溫差≤2℃、pH7.5 ～ 8.5、溶解氧≥6.0 mg/L、鹽度為10‰ ～ 30‰、非離子氨≤0.04 mg/L、亞硝酸鹽(NO2-)≤0.4 mg/L、水面照度為54 ～ 324 lx、晝夜明暗交替時間為14 ～ 12 h/10 ～ 12 h。改進后的斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(海水腐蝕性強；更換部分防腐材質(zhì))可用于飼養(yǎng)30日齡以上的諸氏鯔蝦虎魚。

3 應(yīng)用

3.1 海洋油氣開發(fā)排海廢物毒性檢測

在大量開展海洋石油鉆井液[3]、生產(chǎn)水、標(biāo)準(zhǔn)毒物[15]等對諸氏鯔蝦虎魚的毒性試驗的基礎(chǔ)上，建立諸氏鯔蝦虎魚急性毒性試驗方法，為諸氏鯔蝦虎魚的海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性評價應(yīng)用提供了技術(shù)依據(jù)。諸氏鯔蝦虎魚毒性試驗設(shè)施獲國家實用新型專利：一種水生生物養(yǎng)殖及毒性試驗用恒溫水浴槽(ZL 201620925426.2)。目前，蝦虎魚已被GB/T 18420.2-2009“海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性 第2部分：檢驗方法”和GB 30980-2014“海洋傾倒物質(zhì)評價規(guī)范 疏浚物”推薦為生物毒性評價受試生物，國內(nèi)多家海洋環(huán)境監(jiān)測機構(gòu)應(yīng)用蝦虎魚開展相應(yīng)的檢驗工作，僅南海海域海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性檢測蝦虎魚年使用量超過30萬尾。相當(dāng)于其他蝦虎魚，諸氏鯔蝦虎魚具有諸多應(yīng)用優(yōu)勢，隨著海洋油氣產(chǎn)業(yè)的持續(xù)快速發(fā)展和國家海洋環(huán)保監(jiān)管部門對海洋環(huán)境日益嚴(yán)格的要求，諸氏鯔蝦虎魚在海洋石油勘探開發(fā)污染物、疏浚泥等生物毒性評價中的應(yīng)用需求將呈增加趨勢。此外，諸氏鯔蝦虎魚攝食抑制效應(yīng)試驗方法在標(biāo)準(zhǔn)毒物十二烷基硫酸鈉、重鉻酸鉀及典型海洋石油勘探開發(fā)污染物的生物毒性評價中得到驗證，對提高該類污染物生物毒性檢測的敏感性和時效性具有重要意義，該方法獲國家發(fā)明專利：一種基于水生動物攝食抑制度測定水污染物的方法(ZL 201610529697.0)。

3.2 重金屬毒理學(xué)研究

海淡水環(huán)境的差異，如鹽度和離子差異等，直接影響重金屬等污染物的結(jié)構(gòu)形態(tài)或解吸附效應(yīng)等，從而改變污染物的毒性大小，諸氏鯔蝦虎魚作為海洋水生態(tài)毒理評價模型具有淡水實驗魚類不可替代的作用。李建軍等[16]、Cui等[17]研究了Hg2+、Cd2+、Cr2+、Pb2+、Zn2+等對諸氏鯔蝦虎魚的單一和聯(lián)合毒性效應(yīng)，Guo等[4]、Zhang等[18]研究了鎘和砷在諸氏鯔蝦虎魚體內(nèi)的累積毒性效應(yīng)和遷移規(guī)律；Miao等[19]篩選了諸氏鯔蝦虎魚腸道HSP70基因作為水體中重金屬檢測的分子標(biāo)志物，為諸氏鯔蝦虎魚對水環(huán)境中重金屬的急、慢性毒性評價應(yīng)用積累了相關(guān)資料。

3.3 多環(huán)芳烴PHAs、內(nèi)分泌干擾物等毒性評價

以諸氏鯔蝦虎魚為模型，Cai等[20]對諸氏鯔蝦虎魚苯并芘暴露的轉(zhuǎn)錄組進行了分析和研究，篩選諸氏鯔蝦虎魚CYP2K3、PAP和MRP1基因作為海洋多環(huán)芳烴檢測的分子標(biāo)志物，該方法已申報國家發(fā)明專利：一種利用基因表達(dá)變化快速檢測海水或海洋沉積物中多環(huán)芳烴的方法(申請?zhí)枺篊N201710654529.9)。余露軍等[21]研究了雌二醇E2對諸氏鯔蝦虎魚的遺傳毒性效應(yīng)；Li等[22]評價了納米ZnO對諸氏鯔蝦虎魚胚胎的致死、致畸等發(fā)育毒性效應(yīng)；蔡文超等[23]探討了海洋石油鉆井液對諸氏鯔蝦虎魚抗氧化酶的影響，為諸氏鯔蝦虎魚對水環(huán)境污染物毒性評價應(yīng)用提供了基礎(chǔ)資料。

3.4 疾病感染模型

建立了諸氏鯔蝦虎魚遲緩愛德華菌感染模型，對其敏感性、病理特征進行了比較研究，分析了溫度、鹽度、pH等環(huán)境因子對其易感性的影響，為感染模型的標(biāo)準(zhǔn)化提供了技術(shù)依據(jù)。此外，通過GFP標(biāo)記技術(shù)探討了遲緩愛德華菌對諸氏鯔蝦虎魚的感染動力學(xué)，為諸氏鯔蝦虎魚在感染機制、藥物評價等方面的研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)(待發(fā)表)。

4 展望

4.1 諸氏鯔蝦虎魚質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定

目前，諸氏鯔蝦虎魚種質(zhì)、遺傳、微生物和寄生蟲、飼料及環(huán)境設(shè)施等的質(zhì)量控制技術(shù)已在實驗室驗證、實施多年，其標(biāo)準(zhǔn)化進程亟待推進，應(yīng)盡快制定相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)，為諸氏鯔蝦虎魚的質(zhì)量控制及其應(yīng)用提供保障。

4.2 近交系培育及應(yīng)用

近交系實驗動物是生命科學(xué)研究重要的實驗材料。目前多個諸氏鯔蝦虎魚近交系仍處在培育之中，其“個性化”生物學(xué)特征也有待進一步分析和挖掘。魚類實驗動物近交系培育是一個周期長、投入大的工程，目前廣東省實驗動物監(jiān)測所已在諸氏鯔蝦虎魚的研發(fā)應(yīng)用和近交系培育上打下堅實基礎(chǔ)，為盡早培育多個遺傳純度高、滿足不同科研需求的近交系，還需政府及有關(guān)單位群策群力，加大支持力度。

4.3 功能基因組開發(fā)及應(yīng)用

諸氏鯔蝦虎魚全基因組測序工作已啟動。諸氏鯔蝦虎魚全基因組信息將提供大量重要性狀相關(guān)的功能基因和分子標(biāo)記，有利于從功能基因組角度揭示魚類生長、發(fā)育、營養(yǎng)、代謝、繁殖、遺傳、免疫等重要生命現(xiàn)象的分子機制，有利于拓展諸氏鯔蝦虎魚在海水魚育種、疾病模型、藥物篩選、功能基因及轉(zhuǎn)基因工具魚等模式動物研究領(lǐng)域的應(yīng)用。