侯改霞，肖國強，習(xí)雪峰，劉倩倩

(1. 河南大學(xué)體育學(xué)院，河南 開封 475001； 2. 華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，廣州 510006)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)與糖尿病心血管疾病的高發(fā)生率和高病死率密切相關(guān)。心肌纖維化是DCM最突出的病理組織學(xué)變化之一。臨床藥理研究[1]認(rèn)為晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs)與糖尿病心肌纖維化密切相關(guān)。AGEs除可與心肌間質(zhì)成分發(fā)生直接交聯(lián)打亂組織間質(zhì)正常生理功能外，還可與其受體RAGE(receptor for advanced glycation end products，RAGE)結(jié)合進一步介導(dǎo)AGEs的主要致病作用[2]。糖尿病心肌纖維化是一種連續(xù)變化的過程[3]，隨著糖尿病的發(fā)展，心肌纖維化程度逐漸加重。鑒于心肌AGEs/RAGE與糖尿病心肌纖維化的密切關(guān)系，心肌AGEs/RAGE水平在心肌纖維化進程中是否存在漸進增加的變化？心肌AGEs/RAGE水平與心肌纖維化的程度是否存在有正相關(guān)關(guān)系？這方面的研究比較少見。本課題通過高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素(STZ)復(fù)制Ⅱ型糖尿病大鼠模型，并在造模成功后第4，8和12周時檢測大鼠血液和心肌相關(guān)指標(biāo)，探討Ⅱ型糖尿病大鼠心肌纖維化和心肌AGEs/RAGE水平的變化規(guī)律及其相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠(SPF級，6周齡，體重160 ～ 180 g)，購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心【SCXK(豫)2010-0002】，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實驗動物房【SYXK(豫)2010-0016】。大鼠分籠飼養(yǎng)，自然晝夜節(jié)律變化，自由飲食。室溫23±2℃，相對濕度40% ～ 60%。普通飼料：購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。高糖高脂飼料：64.8%基礎(chǔ)飼料、20%蔗糖、10%豬油、5%蛋黃粉、0.2%膽酸鈉。由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心配制。

1.2 實驗方法

1.2.1 STZ溶液的配制

0.4% STZ的配制：在避光、低溫、干燥環(huán)境中快速稱取1 g STZ溶于250 mL 4℃預(yù)冷的檸檬酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 4.0)中，充分溶解后立即使用。

1.2.2 Ⅱ型糖尿病大鼠模型的構(gòu)建

參照Reed等[4]、Srinivasan等[5]、上官若男等[6]方法并稍加改良建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型。雄性SD大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分成2組：正常對照組(18只)和高脂飲食組(76只)，正常對照組繼續(xù)飼喂普通飼料，高脂飲食組改為高脂飼料喂養(yǎng)。飼喂6周后，高脂飲食組大鼠過夜空腹12 h，腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ，30 mg/kg)，STZ溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，30 min完成注射。注射后72 h檢測大鼠隨機血糖濃度，隨機血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠暫時成模標(biāo)準(zhǔn)。剔除血糖不達標(biāo)大鼠。1周后復(fù)查暫時成模大鼠，隨機血糖仍≥16.7 mmol/L為建模成功，剔除不達標(biāo)大鼠。共有72只大鼠造模成功，成功率94.7%。

實驗分組：4周正常對照組(4C)、4周糖尿病對照組(4D)、8周正常對照組(8C)、8周糖尿病對照組(8D)、12周正常對照組(12C)、12周糖尿病對照組(12D)，每組動物6只。

1.2.3 動物取材

在造模成功后第4、8和12周周末，正常對照組(4C，8C，12C)和糖尿病對照組(4D，8D，12D)大鼠過夜禁食12 h后，稱重后腹腔麻醉，剖腹，從腹主動脈取血，3000 r/min離心20 min，取血清置于-80℃冰箱保存檢測FBG、insulin。取部分左心室置于4%多聚甲醛中固定以備Masson染色和RAGE免疫組化檢測，另取部分左心室置于-80℃冰箱保存以做AGEs、Hyp含量檢測。

1.2.4 指標(biāo)測試

(1)測試指標(biāo)及測試方法

空腹血糖(FBG)測試采用磷鉬酸法，羥脯氨酸(Hyp)測定采用堿水解法，胰島素(insulin)、AGEs采用酶聯(lián)免疫法(ELISA法)，操作檢測流程嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。

(2)Masson染色圖像采集與分析處理

Masson染色后，在Olympus顯微鏡400倍光鏡視野下，每張切片隨機選出6個視野并獲取圖像，采用Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析系統(tǒng)分析。測量每個視野中藍色膠原纖維染色的面積，計算膠原面積與心肌組織總面積的比值，取其均值即為每只大鼠膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF，%)。含膠原豐富的冠脈細小血管區(qū)域不納入測量范圍內(nèi)[7]。

(3)免疫組化圖像采集與分析處理

AGEs、RAGE：Olympus顯微鏡低倍選準(zhǔn)位置，高倍觀察并拍照。陽性細胞胞膜、胞漿顯色為棕黃色。每張切片隨機選出6個視野，在400倍光鏡視野下獲取圖像，采用Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析系統(tǒng)分析，得出每個視野的平均光密度值(IOD/area)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Ⅱ型糖尿病大鼠在第4，8和12周時血液FBG、Insulin、體重水平的變化

造模成功后第4，8和12周，糖尿病對照組(4D，8D，12D)FBG均較正常對照組(4C，8C，12C)顯著升高(P﹤0.01)，糖尿病對照組(4D，8D，12D)體重均較正常對照組(4C，8C，12C)顯著下降(P﹤0.05或P﹤0.01)。造模成功后第4，8周，糖尿病對照組(8D，4D)大鼠Insulin與正常對照組(4C，8C)相比無顯著差異(P﹥0.05)；在第12周時，糖尿病對照組(12D)大鼠insulin顯著高于同周次正常對照組(12C)(P﹤0.05)和4周時糖尿病對照組(4D)(P﹤0.01)。見表1。

表1 Ⅱ型糖尿病大鼠在第4、8和12周時血液FBG、Insulin、體重水平的變化Table 1 Changes of FBG, insulin of the diabetic rats at 4th, 8th and 12th

注：*P﹤0.05，**P﹤0.01，表示與同周次正常對照組比較；#P﹤0.05，##P﹤0.01，表示與4周糖尿病對照組(4D)比較；△P﹤0.05，△△P﹤0.01，表示與8周糖尿病對照組(8D)比較。(下表/圖同)

Note.*P﹤0.05,**P﹤0.01, compared with the group C at the same weeks;#P﹤0.05,##P﹤0.01, compared with the group 4D;△P﹤0.05,△△P﹤0.01, compared with the group 8D. (The same in the following Tables and Figures)

2.2 Ⅱ型糖尿病大鼠在第4、8和12周時心肌Hyp、AGEs含量的變化

第4周時，糖尿病對照組(4D)心肌Hyp、AGEs含量與正常對照組(4C)相比差異無顯著性(P﹥0.05)；但在第8周時，糖尿病對照組(8D)心肌Hyp、AGEs含量與正常對照組(8C)相比差異有顯著性(P﹤0.05 或P﹤0.01)，且8周糖尿病對照組(8D)心肌Hyp、AGEs含量高于4周糖尿病對照組(4D)(P﹤0.05或P﹤0.01)；12周糖尿病對照組(12D)心肌Hyp、AGEs含量高于12周正常對照組(12C)和4周、8周糖尿病對照組(4D，8D)(P﹤0.01)。見表2。

2.3 Ⅱ型糖尿病大鼠在第4、8和12周時心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)變化

第4周時，糖尿病對照組(4D)心肌CVF與正常對照組(4C)相比差異無顯著性(P﹥0.05)；但在第8周時，糖尿病對照組(8D)心肌CVF與正常對照組(8C)相比差異有顯著性(P﹤0.05)，且8周糖尿病對照組(8D)心肌CVF顯著高于4周糖尿病對照組(4D)(P﹤0.05)；12周糖尿病對照組(12D)心肌CVF顯著高于12周正常對照組(12C)和4周、8周糖尿病對照組(4D，8D)(P﹤0.01)。見圖1、2。

表2 Ⅱ型糖尿病大鼠在第4、8和12周時心肌Hyp、AGEs含量的變化Table 2 Changes of Hyp, AGEs of the myocardium of diabetic rats at the 4th, 8th and 12th

圖1 Ⅱ型糖尿病大鼠在第4、8和12周時心肌CVF的變化Figure 1 Changes of CVF of the myocardium of diabetic rats at the 4th, 8th and 12th weeks

注：a. 4周正常對照組； b. 4周糖尿病對照組； c. 8周正常對照組； d. 8周糖尿病對照組； e. 12周正常對照組； f. 12周糖尿病對照組。圖2 Ⅱ型糖尿病大鼠在第4、8和12周時心肌膠原的變化(Masson染色，×400)Note. a. Group 4C. b. Group 4D. c. Group 8C. d. Group 8D. e. Group 12C. f. Group 12D.Figure 2 Changes of myocardial collagen fibers of the diabetic rats at the 4th, 8th and 12th weeks (Masson staining, ×400)

2.4 Ⅱ型糖尿病大鼠在第4、8和12周時心肌RAGE蛋白表達的變化

第4周時，糖尿病對照組(4D)心肌RAGE蛋白表達與正常對照組(4C)相比差異無顯著性(P﹥0.05)；但在第8周時，糖尿病對照組(8D)心肌RAGE蛋白表達與正常對照組(8C)相比差異有顯著性(P﹤0.01)，且8周糖尿病對照組(8D)心肌RAGE蛋白表達顯著高于4周糖尿病對照組(4D)(P﹤0.01)；12周糖尿病對照組(12D)心肌RAGE蛋白表達顯著高于12周正常對照組(12C)(P﹤0.01)和4周、8周糖尿病對照組(4D，8D)(P﹤0.01)。見圖3、4。

2.5 Ⅱ型糖尿病大鼠心肌AGEs/RAGE水平與CVF相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析，Ⅱ型糖尿病大鼠心肌AGEs水平與CVF呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.825，P﹤0.01)，心肌RAGE水平與CVF也呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.816，P﹤0.01)。

圖3 Ⅱ型糖尿病大鼠在第4，8和12周時心肌RAGE蛋白表達的變化Figure 3 Changes of RAGE in the diabetic rat myocardium at the 4th, 8th and 12th weeks

注：a. 4周正常對照組； b. 4周糖尿病對照組；c. 8周正常對照組；d. 8周糖尿病對照組； e. 12周正常對照組；f. 12周糖尿病對照組。圖4 Ⅱ型糖尿病大鼠在第4、8和12周時心肌RAGE免疫組化染色的比較(DAB顯色，×400)Note. a. Group 4C. b. Group 4D. c. Group 8C. d. Group 8D. e. Group 12C. f. Group 12D.Figure 4 Changes of RAGE in the myocardium of diabetic rats at 4th, 8th and 12th weeks (DAB staining, ×400)

3 討論

心血管系統(tǒng)疾病是造成糖尿病病人晚期死亡的主要原因之一，是非糖尿病人群死于心血管系統(tǒng)疾病機率的2 ～ 4倍[8]。DCM與糖尿病心血管疾病的高發(fā)生率和高病死率密切相關(guān)。DCM是由糖尿病獨立引起的心肌相關(guān)結(jié)構(gòu)和功能的變化，典型變化表現(xiàn)為舒張功能不全，且隨著時間的推移，逐漸表現(xiàn)為收縮功能不全，易發(fā)生充血性心力衰竭[9-10]。DCM最突出的病理組織學(xué)變化是心肌纖維化[11-12]，是引起心肌舒張功能受損及收縮功能不全的重要因素。

Ⅱ型糖尿病動物模型的成功構(gòu)建是研究Ⅱ型糖尿病心肌纖維化的基礎(chǔ)。高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素(STZ)是目前國內(nèi)外尤其是國內(nèi)復(fù)制Ⅱ型糖尿病動物模型的常用方法，按此方法復(fù)制的Ⅱ型糖尿病動物模型具有高血糖、高胰島素和胰島素抵抗等Ⅱ型糖尿病的主要臨床特征，價格相對來說較便宜，方法簡單。本文采用高脂飲食飼喂SD大鼠6周加一次性腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg/(kg·bw)成功構(gòu)建Ⅱ型糖尿病大鼠模型。在造模成功后第4、8和12周時檢測大鼠血液FBG、insulin和心肌膠原代謝Hyp、CVF水平，發(fā)現(xiàn)本實驗所復(fù)制的Ⅱ型糖尿病大鼠模型具備高血糖、高胰島素血癥和胰島素抵抗的主要臨床特征，且從第8周開始，Ⅱ型糖尿病大鼠心肌纖維化開始凸顯，至第12周時，已表現(xiàn)出明顯的心肌纖維化。

AGEs主要是由還原糖如葡萄糖等的羰基與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA的游離氨基端通過非酶糖基化作用(Mailard反應(yīng))形成Schiff堿，Schiff堿進一步化學(xué)重排形成較穩(wěn)定的Amadori產(chǎn)物，Amadori產(chǎn)物經(jīng)過復(fù)雜的脫水、重排、凝聚、氧化等形成的不可逆終末產(chǎn)物(即AGEs)。表2顯示，隨著糖尿病病程的延長，Ⅱ型糖尿病大鼠心肌AGEs含量呈上升趨勢。造模成功后第4周時，正常對照組(C)與糖尿病對照組(D)心肌AGEs含量的差別還不明顯，但從第8周開始，糖尿病對照組心肌AGEs含量開始大幅增加，明顯高于同周次正常對照組。由于Maillard反應(yīng)的發(fā)生需幾周甚至幾個月的時間，因此Ⅱ型糖尿病大鼠心肌AGEs含量的這種變化趨勢可能與其形成的時間特點有關(guān)。

RAGE是細胞表面具有的特定化學(xué)基團、并能結(jié)合AGEs的蛋白。RAGE是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)多肽，AGEs/RAGE結(jié)合介導(dǎo)AGEs的主要致病作用。正常情況下機體RAGE表達量很低，但在高血糖狀態(tài)下，RAGE表達量顯著增加。有證據(jù)顯示，在糖尿病血管中AGEs沉積多的地方，RAGE的表達也增多[13]。可見，AGEs與RAGE的結(jié)合形成了一個正反饋回路，放大了隨后由受體介導(dǎo)的細胞活化。圖3、4顯示，隨著Ⅱ型糖尿病病程的延長，Ⅱ型糖尿病大鼠心肌RAGE蛋白表達逐漸升高，大體趨勢與AGEs含量增加趨勢一致。原因可能是RAGE的蛋白表達受其配體的調(diào)控，配體含量的增加至少可以部分的刺激其蛋白表達上升。

總之，本研究所構(gòu)建的Ⅱ型糖尿病大鼠隨著病程的發(fā)展，心肌纖維化呈逐漸上升趨勢，從第8周開始，心肌纖維化速度明顯加快，且心肌AGEs/RAGE水平與心肌纖維化的變化趨勢大體一致，提示Ⅱ型糖尿病大鼠心肌AGEs/RAGE的水平上升可能是導(dǎo)致糖尿病心肌纖維化的主要因素之一。