張松林， 靳秀紅， 沈照波

兒童大葉性肺炎是社區(qū)獲得性肺炎較常見的疾病類型之一[1]，其發(fā)病率近幾年呈上升趨勢[2-3]，其臨床起病急，病程長，病情重，并發(fā)癥多，治療費(fèi)用高、嚴(yán)重危害兒童身體健康[4]。兒童大葉性肺炎可由多種致病原感染引起，進(jìn)而引發(fā)多種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子參與，是呈大葉性分布的急性肺泡炎性病變，具體發(fā)病機(jī)制尚未明了。目前兒童纖維支氣管鏡技術(shù)已逐漸廣泛應(yīng)用于小兒呼吸系統(tǒng)疾病的診斷及治療中[5-6]，甚至在新生兒期也可應(yīng)用[7]，且可顯著提高臨床診治水平及療效，本研究應(yīng)用兒童纖維支氣管鏡技術(shù)采取大葉性肺炎患兒肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)進(jìn)而檢測其趨化因子的表達(dá)水平。黏附分子和趨化因子是參與多種細(xì)胞炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答的兩大類重要的生物活性因子。本研究旨在檢測外周血細(xì)胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)(CD54)和肺泡灌洗液調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的細(xì)胞因子(regulated on activation，normal T cell expressed and secreted，RANTES)在大葉性肺炎患兒體內(nèi)的表達(dá)水平，進(jìn)而分析它們之間的相關(guān)性，以探討其在大葉性肺炎發(fā)病機(jī)制中的可能作用和臨床價(jià)值，為臨床更好的診治大葉性肺炎提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年7月至2016年12月鄭州兒童醫(yī)院呼吸科收治住院的呼吸系統(tǒng)疾病患兒95例為研究對象。按臨床診斷分為大葉性肺炎組35例，支氣管肺炎組30例和氣管狹窄組(對照組)30例。大葉性肺炎組中男20例，女15例；年齡1～12歲，平均(4.5±2.2)歲；支氣管肺炎組中男17例，女13例；年齡1～10歲，平均(3.6±2.6)歲，患兒經(jīng)胸部64排CT加氣道重建診斷為支氣管肺炎伴氣管狹窄，需行纖維支氣管鏡明確氣管狹窄性質(zhì)；氣管狹窄組中男14例，女16例；年齡1～8歲，平均(2.8±1.8)歲，患兒經(jīng)胸部64排CT加氣道重建診斷氣管狹窄(非肺炎)，需行纖維支氣管鏡明確氣管狹窄性質(zhì)。3組患兒在年齡、性別方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》[8]和《兒童胸部疾病影像診斷》[9]中的大葉性肺炎、支氣管肺炎、氣管狹窄的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合大葉性肺炎、支氣管肺炎、氣管狹窄的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡1～12歲；(3)患兒家屬知情同意。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素者；(2)結(jié)核、真菌、寄生蟲等特殊病原引起的大葉性肺炎者。

1.5 方法

1.5.1 主要試劑及儀器 鼠抗人CD54-PE(BioLegend公司)；RANTES試劑盒(上海吉泰依科賽生物科技有限公司)；流式細(xì)胞儀FACScan(BD公司)；Olympus BFXP60型電子纖維支氣管鏡(日本Olympus公司)。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)方法 (1)外周血采集：所有患兒均于入院次日晨起空腹4 h抽取外周靜脈新鮮全血1 mL，乙二胺四乙酸二鈉抗凝后上流式細(xì)胞儀待用；(2)肺泡灌洗液標(biāo)本采集：所有患兒均于入院3 d內(nèi)行纖維支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)，術(shù)前禁食水4～6 h，術(shù)前30 min肌注阿托品0.02 mg/kg，抑制呼吸道腺體分泌；術(shù)前5 min靜脈注射咪達(dá)唑侖0.2 mg/kg鎮(zhèn)靜；電子纖維支氣管鏡經(jīng)鼻、咽喉、聲門進(jìn)入氣道，依次檢查各段支氣管有無新生物和其他病變后，結(jié)合術(shù)前胸部CT的定位結(jié)果，尋找大葉性肺炎病變部位或者氣管狹窄部位的支氣管開口，應(yīng)用37 ℃溫生理鹽水1.0 mL/kg灌洗受累肺段至少3次，隨即負(fù)壓吸引，留取肺泡灌洗液標(biāo)本，緩慢拔出電子纖維支氣管鏡。留取3 mL肺泡灌洗液標(biāo)本于一次性無菌硅化管中儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中，備用待測；(3)外周血淋巴細(xì)胞ICAM-1檢測：采用流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用流式細(xì)胞儀收獲細(xì)胞，用Cell Quest Plot軟件程序分析數(shù)據(jù)并獲取ICAM-1表達(dá)率；(4)肺泡灌洗液RANTES濃度的檢測：采用ELISA法，按照試劑盒說明書操作，獲取肺泡灌洗液RANTES的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 3組患兒ICAM-1表達(dá)情況和RANTES水平比較 見表1。

表1 3組兒童ICAM-1和RANTES檢測結(jié)果

注：與氣管狹窄組比較，aP<0.05，bP<0.01；與大葉性肺炎組比較，cP<0.05。

表1結(jié)果表明，大葉性肺炎組ICAM-1表達(dá)率顯著高于支氣管肺炎組及氣管狹窄組，支氣管肺炎組ICAM-1表達(dá)率顯著高于氣管狹窄組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大葉性肺炎組和支氣管肺炎組肺泡灌洗液RANTES水平均顯著高于氣管狹窄組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，大葉性肺炎組與支氣管肺炎組間RANTES水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 ICAM-1與RANTES相關(guān)性分析 大葉性肺炎組ICAM-1與RANTES呈正相關(guān)(r=0.781，P<0.01)，支氣管肺炎組和氣管狹窄組ICAM-1與RANTES無相關(guān)性。

3 討論

兒童大葉性肺炎常發(fā)病于3歲以上年長兒，但嬰幼兒亦可發(fā)病，可由多種致病原，如肺炎鏈球菌、肺炎支原體[10]、病毒、真菌等等，感染引起的進(jìn)而激發(fā)機(jī)體多種炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子參與，發(fā)生強(qiáng)烈的機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而引發(fā)一個(gè)肺葉，或者多個(gè)肺葉，甚至一個(gè)或多個(gè)肺段范圍內(nèi)的急性肺泡炎性病變的氣道炎癥反應(yīng)性疾病。當(dāng)肺泡炎性病變不能得到及時(shí)有效的控制時(shí)，可導(dǎo)致單個(gè)或多個(gè)肺葉、肺段的大片狀炎性病變，從而形成肺實(shí)變或者合并胸腔積液、肺膿瘍、氣胸、液氣胸、胸膜炎等并發(fā)癥，甚至引發(fā)其他肺外并發(fā)癥，如腦梗死、脾梗死、眼底病變等，嚴(yán)重影響兒童健康。

兒童大葉性肺炎的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未明了，多種細(xì)胞因子參與其發(fā)病過程。其中ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白超家族成員之一，其分布較為廣泛，生理狀態(tài)下表達(dá)甚少，但在γ干擾素、白細(xì)胞介素1、內(nèi)毒素等細(xì)胞因子的作用下，ICAM-1亦可廣泛表達(dá)于呼吸道上皮細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞表面，具有促進(jìn)氣道炎癥反應(yīng)、參與免疫反應(yīng)與調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)免疫細(xì)胞發(fā)育和分化、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)功能。ICAM-1與其配體相互作用，亦可增強(qiáng)T細(xì)胞對抗原物質(zhì)刺激的敏感性，增加細(xì)胞間接觸的穩(wěn)定性，誘導(dǎo)B細(xì)胞向漿細(xì)胞轉(zhuǎn)化而分泌抗體，在T細(xì)胞和B細(xì)胞激活與調(diào)節(jié)中均發(fā)揮著重要的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，黏附分子可以參與炎癥反應(yīng)的整個(gè)過程，如ICAM-1通過與其配體巨噬細(xì)胞表面分子抗原(CD11b/CD18)和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原1(CD11a/CD18)相結(jié)合的方式，進(jìn)而促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的初次黏附、穩(wěn)定黏附及白細(xì)胞的附壁，引發(fā)一系列相關(guān)性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使炎癥細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)重排以及炎癥細(xì)胞的活化，定向遷移，穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)，向炎癥部位移行等過程。ICAM-1表達(dá)水平的高低可以直接影響參與炎癥反應(yīng)中白細(xì)胞數(shù)量的多少，可見ICAM-1在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，已有研究報(bào)道ICAM-1在毛細(xì)支氣管炎的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[11]。而且，目前研究表明，炎癥反應(yīng)的分子細(xì)胞學(xué)機(jī)制就是基于白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的相互作用，以及細(xì)胞因子等對黏附分子表達(dá)的調(diào)節(jié)。目前研究還發(fā)現(xiàn)ICAM-1與LAF-1的結(jié)合及其相互間作用可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞與上皮細(xì)胞的黏附及部分中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞與上皮細(xì)胞的黏附，抗ICAM-1和抗LAF-1的單克隆抗體可阻斷這些細(xì)胞間的黏附。Stanciu等[12]曾報(bào)道ICAM-1在炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞黏附完成跨內(nèi)皮和穿過上皮的過程中均起到重要的作用。ICAM-1的表達(dá)率在大葉性肺炎患兒中是否異常增高，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測大葉性肺炎患兒外周血淋巴細(xì)胞表面ICAM-1的表達(dá)率，結(jié)果顯示，大葉性肺炎組表達(dá)率高于支氣管肺炎組和氣管狹窄組，支氣管肺炎組高于氣管狹窄組，提示ICAM-1可引導(dǎo)淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)并且最終黏附于支氣管內(nèi)皮細(xì)胞上起重要的作用，表明ICAM-1參與了大葉性肺炎和支氣管肺炎的炎癥反應(yīng)，并且大葉性肺炎的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度較支氣管肺炎更為劇烈，并可作為臨床評定大葉性肺炎氣道炎癥反應(yīng)程度的較客觀的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

而RANTES屬于CC趨化因子亞家族成員之一，它通過趨化炎癥細(xì)胞以及調(diào)節(jié)這些細(xì)胞的功能從而在炎癥免疫反應(yīng)應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。RANTES除了對細(xì)胞遷移的影響外，還能活化T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及單核細(xì)胞等，參與炎癥反應(yīng)過程。RANTES對多種不同種類的細(xì)胞都具有強(qiáng)烈的趨化作用，其通過趨化誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞的定向趨化游走，介導(dǎo)細(xì)胞在炎癥部位募集、活化，促使炎癥細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞上黏附，激活和誘導(dǎo)T細(xì)胞的增殖，因而，RANTES是參與炎癥反應(yīng)性疾病中具有重要作用的趨化因子之一。目前在體外研究也發(fā)現(xiàn)，CC趨化因子(如RANTES)能夠迅速使嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒釋放組胺，趨化因子的這種作用可能與非IgE介導(dǎo)的組織損傷及炎癥反應(yīng)有關(guān)聯(lián)，目前具體機(jī)制尚未明了[13]。RANTES在炎癥反應(yīng)過程中的作用貫穿于炎癥細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的整個(gè)過程，它的產(chǎn)生亦是炎癥反應(yīng)的特征之一[14]。RANTES能夠趨化誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞并向特定組織部位浸潤和聚集，至少通過兩種作用機(jī)制發(fā)揮趨化作用，首先是直接的趨化作用，其次是使炎癥細(xì)胞因子與它們的受體在內(nèi)皮細(xì)胞上相互結(jié)合而起到間接的趨化作用。本研究中，大葉性肺炎組肺泡灌洗液RANTES水平高于氣管狹窄組，支氣管肺炎組高于氣管狹窄組，但大葉性肺炎組和支氣管肺炎組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示RANTES可能是通過趨化炎癥細(xì)胞募集到氣道上皮，參與了氣道的炎癥反應(yīng)過程，在大葉性肺炎和支氣管肺炎的炎癥反應(yīng)過程中均起重要的作用，且研究還發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Met-RANTES可封閉RANTES受體，阻斷其炎癥反應(yīng)過程[15]，為我們今后可能臨床應(yīng)用Met-RANTES治療大葉性肺炎提供了新的思路。目前研究還發(fā)現(xiàn)，RANTES等趨化因子可刺激誘導(dǎo)黏附分子整合素的活化及其水平的上調(diào)，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞在血管內(nèi)皮附壁，進(jìn)而游走到局部組織參與炎癥反應(yīng)過程[16]。本研究中也發(fā)現(xiàn)大葉性肺炎組RANTES與ICAM-1相關(guān)性研究分析表明它們呈正相關(guān)，提示兩者通過趨化黏附炎癥細(xì)胞在大葉性肺炎發(fā)病機(jī)制中起相互協(xié)同作用，與既往相關(guān)理論研究相符。

總之，本研究表明，我們可以通過檢測大葉性肺炎患兒外周血淋巴細(xì)胞ICAM-1及其肺泡灌洗液RANTES表達(dá)水平，可作為評定大葉性肺炎患兒體內(nèi)炎癥反應(yīng)程度較客觀的臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，二者的異常表達(dá)可能是兒童大葉性肺炎發(fā)生發(fā)展的重要發(fā)病機(jī)制之一。理論上我們可以通過免疫調(diào)節(jié)法(如抗RANTES抗體、ICAM-1單克隆抗體等)或Met-RANTES治療兒童大葉性肺炎，以縮短其病程，減少其并發(fā)癥的發(fā)生，減輕患兒痛苦，但其可行性仍需我們進(jìn)一步深入研究。