馬 驪 葛倩倩 許 楊 彭素曉 李 健,3

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脊尾白蝦翻譯控制腫瘤蛋白基因克隆及自噬調(diào)控相關(guān)基因在卵巢發(fā)育期的表達(dá)*

馬 驪1,2葛倩倩2許 楊1,2彭素曉1,2李 健2,3①

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 青島 266071)

為深入了解脊尾白蝦()卵巢發(fā)育和卵黃蛋白原發(fā)生的分子機制，本研究克隆得到脊尾白蝦翻譯控制腫瘤蛋白基因，并結(jié)合自噬調(diào)控基因、、和在卵巢發(fā)育期的表達(dá)水平，闡釋脊尾白蝦卵黃蛋白原合成過程中的分子調(diào)控特征。研究顯示，脊尾白蝦基因cDNA全長為732 bp，編碼168個氨基酸，具有典型的TCTP1和TCTP2功能域以及PKC和TKⅡ等mTOR信號通路相關(guān)的磷酸化位點。同時發(fā)現(xiàn)，甲殼動物普遍缺乏在其他動植物中高度保守的C末端的cys殘基。進(jìn)化分析顯示，脊尾白蝦與中華絨螯蟹()親緣關(guān)系最近。4種自噬調(diào)控基因在脊尾白蝦卵巢發(fā)育期的表達(dá)結(jié)果顯示，肝胰腺基因從增殖期到產(chǎn)后恢復(fù)期呈遞減趨勢；肝胰腺、和基因表達(dá)趨勢相似，即從增殖期到小生長期高表達(dá)，大生長期極顯著下降，表達(dá)量最低(<0.01)，這與外源性卵黃蛋白原的合成趨勢大致相反。這些自噬調(diào)控基因可能通過自噬作用共同調(diào)節(jié)外源性卵黃蛋白原的合成。卵巢基因在小生長期表達(dá)量最高；卵巢基因從增殖期到產(chǎn)后恢復(fù)期持續(xù)升高，這與內(nèi)源性卵黃蛋白原表達(dá)趨勢相似；卵巢基因在大生長期表達(dá)量最高，與脊尾白蝦卵巢表達(dá)趨勢相似，與卵巢基因表達(dá)趨勢相反，這些自噬調(diào)控基因可能通過自噬作用共同促進(jìn)內(nèi)源性卵黃蛋白的合成。本研究表明，自噬調(diào)控基因、、和在脊尾白蝦卵巢發(fā)育時期相互協(xié)調(diào)共同作用，可能通過自噬作用調(diào)節(jié)脊尾白蝦卵黃蛋白原的合成和卵巢發(fā)育。

脊尾白蝦；；細(xì)胞自噬；卵黃蛋白；表達(dá)分析

脊尾白蝦()因繁殖周期長、卵巢可連續(xù)多次發(fā)育并抱卵繁殖而為人們所關(guān)注，是研究十足目真蝦繁殖機制的潛在模式生物。卵黃蛋白原作為卵巢成熟和胚胎發(fā)育的營養(yǎng)物質(zhì)，在卵黃合成期表達(dá)并積累，與脊尾白蝦的繁殖力緊密相關(guān)(栗治國等, 2014)。研究表明，脊尾白蝦卵黃蛋白原(Vg)的合成受溫度、激素等調(diào)控，主要在肝胰腺內(nèi)合成 (張美, 2015; 李志敏等, 2016; 梁俊平等, 2015)，這與日本沼蝦()、羅氏沼蝦()等相似，而與日本對蝦()、短溝對蝦()、中國明對蝦()等卵黃蛋白原主要在卵巢內(nèi)合成具有較大區(qū)別(Yano, 1987; Fainzilber, 1992)。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，甲殼動物卵母細(xì)胞的成熟伴隨著細(xì)胞自噬的發(fā)生：卵黃發(fā)生過程中，卵母細(xì)胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)增加，溶酶體通過吞噬線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，形成自噬溶酶體并產(chǎn)生卵黃顆粒(王玉鳳等, 1999; 趙夢然等, 2009)。Suwansa-ard等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，甲殼動物自噬標(biāo)記蛋白含有其他動物自噬蛋白的保守基序，免疫組化分析顯示，羅氏沼蝦自噬標(biāo)記蛋白Beclin1、LC3等在卵黃發(fā)生的卵母細(xì)胞質(zhì)(階段3和4)檢測呈陽性，而在卵原細(xì)胞中不明顯。這說明自噬與甲殼動物卵黃發(fā)生關(guān)系密切，但自噬在甲殼動物卵巢發(fā)育中的分子調(diào)控尚不清楚。

細(xì)胞自噬在哺乳動物中的研究比較深入，可由氧氣缺乏、營養(yǎng)缺乏及其他應(yīng)激所引起，由溶酶體等細(xì)胞器介導(dǎo)，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、組織發(fā)育、腫瘤發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。缺氧誘導(dǎo)因子(Hif-1)是含有α和β兩種亞基的轉(zhuǎn)錄因子，可由缺氧環(huán)境誘導(dǎo)并激活上百個有利于細(xì)胞在低氧環(huán)境中生存的基因參與細(xì)胞自噬調(diào)控。翻譯控制腫瘤蛋白(TCTP)可與Hif-1α競爭結(jié)合于VHL的β結(jié)構(gòu)域，保護(hù)Hif-1α不被降解，從而促進(jìn)自噬發(fā)生(Chen, 2013)。Beclin1是哺乳動物自噬體的誘導(dǎo)和成核過程的關(guān)鍵靶位點，可與VPS34、VPS15等形成PI3KⅢ復(fù)合物正調(diào)控細(xì)胞自噬，是自噬形成的關(guān)鍵(Funderburk, 2010)。凋亡蛋白Bcl-2可以與Beclin1結(jié)合抑制PI3KⅢ復(fù)合物形成，從而負(fù)調(diào)控自噬的發(fā)生(He, 2010)。

翻譯控制腫瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein, TCTP)是一種在真核細(xì)胞中廣泛表達(dá)的高保守多功能蛋白，因在大多數(shù)癌癥細(xì)胞中高表達(dá)而聞名，以促增殖、促發(fā)育和參與免疫調(diào)節(jié)等功能而為人們所熟知(Batisti, 2012)。哺乳動物TCTP的多功能性早已得到證實，調(diào)節(jié)機制的研究也較多。TCTP的Ser46殘基磷酸化可調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架穩(wěn)定性(Yarm, 2002)。TCTP通過與Oct4啟動子的SF1位點結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞分化(Cheng, 2012)。TCTP可通過與mTOR信號通路成員的相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡等(Bommer, 2015; Chuang, 2016)。另外，Chen等(2013、2014)研究發(fā)現(xiàn)，TCTP還在哺乳動物細(xì)胞自噬中具有重要的調(diào)節(jié)作用，通過AMPK-ULK1通路激活了mTOR下游表達(dá)起始細(xì)胞自噬，同時它還可通過HIF-1α調(diào)節(jié)自噬活性。隨著Bangrak等(2004)發(fā)現(xiàn)，TCTP在對蝦抗病毒中具有重要作用，TCTP在甲殼動物中的免疫作用成為研究熱點。Leu等(2013)進(jìn)一步研究證實，對蝦Pm-fortilin(TCTP同源類似物)可被WSSV誘導(dǎo)表達(dá)，通過Bax抑制線粒體觸發(fā)的細(xì)胞凋亡。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，許多甲殼動物TCTP在其卵巢成熟的早期階段呈顯著性高表達(dá)，普遍認(rèn)為這與卵母細(xì)胞組裝細(xì)胞骨架相關(guān)。Loongyai(2007)等還發(fā)現(xiàn)，TCTP可與EF-1α形成聚合物，通過細(xì)胞增殖促進(jìn)卵巢發(fā)育。Makkapan等(2011)研究表明，5-羥色胺可通過促進(jìn)TCTP在墨吉對蝦()卵巢中的表達(dá)促進(jìn)卵巢發(fā)育，同時上調(diào)的還有甲基法尼脂。

本研究通過克隆脊尾白蝦基因，并研究自噬調(diào)控基因、、和等在脊尾白蝦卵巢發(fā)育期肝胰腺和卵巢中的表達(dá)，闡釋自噬在脊尾白蝦卵巢發(fā)育中的作用，為理解脊尾白蝦卵黃蛋白原合成的分子調(diào)控過程、提高脊尾白蝦繁殖力提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用脊尾白蝦購自山東日照海辰水產(chǎn)有限公司。

1.2 實驗試劑

Trizol試劑購自美國Ambion公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primescript RT Reagent Kit with gDNA Eraser、SmartTMRACE cDNA Amplification Kit、PMD18-T載體、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、定量試劑盒SYBR?Premix ExTM和dNTP購自大連TaKaRa公司；HiFi酶購自TransGen Biotech公司；DL2000 Marker購自天根生物有限公司；瓊脂糖凝膠膠回收試劑盒購自康為世紀(jì)有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 脊尾白蝦基因克隆 取健康活潑個體的組織，按照Trizol試劑說明書提取脊尾白蝦總RNA，檢測其完整性及含量。按照Primescript RT Reagent Kit with gDNA Eraser說明書合成cDNA第一鏈。按照SmartTMRACE cDNA Amplification Kit說明書合成RACE-Ready-cDNA。

參照脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組和NCBI上Blast的比對結(jié)果，利用Primer 5.0軟件設(shè)計特異性引物，對中間片段進(jìn)行克隆，以合成的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)體系為Premix ExTM5 μl；正反向引物各0.4 μl；模板0.5 μl；滅菌雙蒸水3.7 μl。反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 35 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。擴增產(chǎn)物電泳檢測，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，與轉(zhuǎn)錄組序列比對驗證。

3￠/5￠RACE以擴增出來的中間片段為參考，設(shè)計3￠RACE引物和5￠RACE引物。以RACE-Ready-cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)體系為模板0.5 μl，dNTP 0.8 μl，UPM引物2.5 μl，3￠/5￠RACE引物0.5 μl，HiFi Buffer(10×)1 μl，HiFi酶0.1 μl，滅菌雙蒸水4.5 μl。反應(yīng)程序為95℃ 4 min；95℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 1 min，每循環(huán)降落0.5℃，共11個循環(huán)；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共24個循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)膠回收試劑盒說明書對電泳的目的條帶進(jìn)行切膠回收?；厥盏腄NA溶液與pMD18-T載體連接，用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選，挑取陽性克隆單一菌落，菌落PCR驗證并測序。

將3￠/5￠RACE以及中間片段的測序結(jié)果利用DNAstar軟件拼接，獲得脊尾白蝦cDNA全長并找到ORF，翻譯為氨基酸序列，將該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的同源序列進(jìn)行比對驗證。

1.3.2 脊尾白蝦TCTP同源序列的多重比對和進(jìn)化樹分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫中查找不同物種TCTP的同源序列，運用軟件ClustalX 2.0.11和DNAMAN對不同動物TCTP的氨基酸序列進(jìn)行多重比對分析。再根據(jù)比對信息，利用MEGA 5.0軟件的Neighbor- joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.3 脊尾白蝦TCTP蛋白的生物信息學(xué)分析 脊尾白蝦TCTP蛋白理化性質(zhì)分析，用Protparam軟件預(yù)測脊尾白蝦TCTP蛋白的氨基酸組成、等電點、分子量、分子式、脂溶指數(shù)和不穩(wěn)定指數(shù)等；通過Predictprotein軟件從PROSITE數(shù)據(jù)庫搜索模體，預(yù)測該蛋白的潛在功能域等；運用NCBI的Conserved domain search功能預(yù)測該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

1.3.4 脊尾白蝦基因的Real-time PCR定量檢測 根據(jù)栗治國等(2014)對卵巢發(fā)育的分期，對健康脊尾白蝦的肝胰腺和卵巢組織取樣，并進(jìn)行熒光定量分析。參照脊尾白蝦轉(zhuǎn)錄組，通過在NCBI數(shù)據(jù)庫比對，找到自噬調(diào)控基因(和)的部分序列，并利用Primer 5.0軟件設(shè)計熒光定量引物(表1)。以18S為內(nèi)參，按照熒光定量試劑盒的說明書加樣，使用ABI 7500 Fast Real-time儀器測定結(jié)果，采用2?DDCt法計算脊尾白蝦自噬調(diào)控基因在卵巢發(fā)育過程中的相對表達(dá)量，用SPSS17.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

表1 本研究所用引物序列

Tab.1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 脊尾白蝦TCTP基因克隆及分析

本研究克隆得到脊尾白蝦基因cDNA序列，命名為，該基因全長為732 bp (GenBank No. KY411921)，包括5￠非編碼區(qū)76 bp、3￠非編碼區(qū)149 bp以及開放閱讀框507 bp，共編碼168個氨基酸，理論等電點為4.48，分子量約為18.769 kDa (圖1)。具有TCTP1和TCTP2兩個保守結(jié)構(gòu)域。

2.2 EcTCTP同源氨基酸序列多重比對和生物進(jìn)化樹分析

不同物種TCTP氨基酸序列進(jìn)行多重比對結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，不同物種TCTP既有高保守序列也有一定的差異序列。脊尾白蝦TCTP與中華絨螯蟹()序列一致性最高，各種屬之間的TCTP序列保守性較好，但不同種屬(如甲殼動物和哺乳動物)之間卻有明顯差異，比如：甲殼動物TCTP不含半胱氨酸殘基(Cys)。

圖1 脊尾白蝦TCTP基因序列和氨基酸序列

ATG為起始密碼子，TAG為終止密碼子，下劃線為蛋白激酶C磷酸化位點，橢圓為酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點

ATG is the start codon, TAG is the stop codon, protein kinase C phosphorylation sites is underlined, casein kinase Ⅱ phosphorylation sites is indicated by ellipse

構(gòu)建進(jìn)化樹如圖3，哺乳動物聚為一支，甲殼動物聚為一支；甲殼動物中脊尾白蝦與同為抱卵亞目的中華絨螯蟹進(jìn)化關(guān)系最近，置信度為82；產(chǎn)卵亞目的中國明對蝦、印度明對蝦、凡納濱對蝦和日本對蝦聚為一支。

2.3 自噬調(diào)控基因在脊尾白蝦卵巢發(fā)育過程中的表達(dá)

2.3.1基因在脊尾白蝦卵巢發(fā)育過程中的表達(dá)

基因在脊尾白蝦卵巢發(fā)育過程中的組織表達(dá)見圖4。如圖4所示，肝胰腺中的基因在卵巢發(fā)育增殖期表達(dá)量最高并顯著高于其他時期(<0.05)，然后持續(xù)下降，在產(chǎn)后恢復(fù)期達(dá)到最低值。卵巢中基因在增殖期表達(dá)量最低，在小生長期表達(dá)量達(dá)到最高值并顯著高于成熟期和產(chǎn)后恢復(fù)期(<0.05)，從小生長期到產(chǎn)后恢復(fù)期表達(dá)量持續(xù)下降。肝胰腺中的表達(dá)總量是卵巢中表達(dá)總量的60倍左右。

2.3.2基因在脊尾白蝦卵巢發(fā)育過程中的表達(dá)基因在脊尾白蝦卵巢發(fā)育過程中的組織表達(dá)見圖5。如圖5所示，肝胰腺中的在卵巢發(fā)育增殖期和小生長期表達(dá)量最高，且無顯著性差異，在大生長期急劇下降到最低值并極顯著低于前2期(<0.01)，大生長期與成熟期無顯著差異，但顯著低于產(chǎn)后恢復(fù)期(<0.05)。卵巢中的基因在卵巢發(fā)育的增殖期表達(dá)量最低，顯著低于小生長期(<0.05)，從小生長期到產(chǎn)后恢復(fù)期持續(xù)升高，并在產(chǎn)后恢復(fù)期表達(dá)量達(dá)到最高，其中，小生長期和大生長期表達(dá)量無顯著性差異。肝胰腺中的整體表達(dá)量約為卵巢中表達(dá)量的26倍。

圖2 脊尾白蝦TCTP與其他物種TCTP氨基酸序列多重比對

圖3 不同物種TCTP氨基酸序列進(jìn)化樹

圖4 EcTCTP在脊尾白蝦卵巢各發(fā)育期的相對表達(dá)

H：肝胰腺；O：卵巢；Ⅰ：增殖期；Ⅱ：小生長期；Ⅲ：大生長期；Ⅳ：成熟期；Ⅴ：產(chǎn)后恢復(fù)期。下同 H: Hepatopancreas; O: Ovary;Ⅰ: Proliferative phase;Ⅱ: Niche long term; Ⅲ: Long term; Ⅳ: Maturity;Ⅴ: Postpartum recovery period. The same as below

圖5 Hif-1α基因在脊尾白蝦卵巢各發(fā)育期的相對表達(dá)

2.3.3基因在脊尾白蝦卵巢發(fā)育過程中的表達(dá) 脊尾白蝦基因()在卵巢發(fā)育過程中的組織表達(dá)如圖6所示，肝胰腺中的從增殖期到小生長期表達(dá)量上升，大生長期表達(dá)量極顯著下降(<0.01)并達(dá)到最低，從大生長期到產(chǎn)后恢復(fù)期表達(dá)量回升(<0.05)。卵巢中的從增殖期到小生長期表達(dá)量上升，大生長期表達(dá)量極顯著上升并達(dá)到最高(<0.01)，成熟期和產(chǎn)后恢復(fù)期的表達(dá)量極顯著下降(<0.01)。

圖6 Ec-Beclin1在脊尾白蝦卵巢各發(fā)育期的相對表達(dá)

2.3.4基因在脊尾白蝦卵巢發(fā)育過程中的表達(dá)

基因在脊尾白蝦卵巢發(fā)育發(fā)育過程中的表達(dá)量如圖7所示：肝胰腺中基因從增殖期到小生長期表達(dá)極顯著上調(diào)(<0.01)，大生長期極顯著下降并達(dá)到最低值(<0.01)，成熟期和產(chǎn)后恢復(fù)期表達(dá)量逐漸升高但差異不顯著。卵巢中基因從增殖期到小生長期表達(dá)量上升，但差異不顯著，大生長期表達(dá)極顯著下降(<0.01)并達(dá)到最低，成熟期和產(chǎn)后恢復(fù)期表達(dá)量均發(fā)生極顯著上升(<0.01)，在大生長期表達(dá)量最低，產(chǎn)后恢復(fù)期表達(dá)量最高。

圖7 Bcl-2基因在脊尾白蝦卵巢各發(fā)育期的相對表達(dá)

3 討論

通過序列多重比對發(fā)現(xiàn)，不同物種TCTP都具有保守功能域TCTP1和TCTP2，而且發(fā)現(xiàn)Glu12、Leu74、Glu132等位點的保守性極高。Dong等2009)研究表明，Glu12等構(gòu)成了人類TCTP的GTPase結(jié)合槽，可通過與Rheb的Lys45形成鹽橋，交換鳥嘌呤激活Rheb的GTPase活性，從而調(diào)控mTOR信號通路。功能域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，脊尾白蝦TCTP蛋白含有蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點和酪氨酸激酶Ⅱ(KTⅡ)磷酸化位點等，而PKC和KTⅡ都是mTOR信號通路成員，可以通過該通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長增殖和存活(Guertin, 2006)。所以，脊尾白蝦TCTP可能通過與免疫生長相關(guān)的mTOR信號通路參與生命活動的調(diào)節(jié)。

在卵巢各發(fā)育時期，自噬相關(guān)基因在脊尾白蝦卵黃蛋白原合成器官中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。卵巢發(fā)育期，脊尾白蝦肝胰腺基因在增殖期表達(dá)量最高，之后表達(dá)量持續(xù)下降，這與脊尾白蝦肝胰腺甲基法尼脂轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)趨勢具有相似性(李志敏等, 2016)，且與墨吉對蝦基因在卵巢中的表達(dá)趨勢具有一致性(Loongyai, 2007)。脊尾白蝦在卵巢發(fā)育的小生長期表達(dá)量最高，這與栗治國等(2014)發(fā)現(xiàn)的脊尾白蝦卵巢小生長期開始出現(xiàn)內(nèi)源性卵黃合成期卵母細(xì)胞相符。Makkapan等(2011)用5-羥色胺(5-HT)處理刀額新對蝦()卵巢，發(fā)現(xiàn)5-HT可促進(jìn)甲基法尼脂(MF)釋放入血淋巴，并促進(jìn)卵巢發(fā)育至卵黃成熟期，還可使卵巢外植體中的基因表達(dá)上調(diào)。

脊尾白蝦基因在肝胰腺中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于卵巢，肝胰腺的表達(dá)趨勢與外源性卵黃蛋白原的表達(dá)趨勢大致相反，即在外源性卵黃蛋白原表達(dá)量低的時期(增殖期和小生長期)，肝胰腺表達(dá)量高，在外源性卵黃蛋白原表達(dá)量高的時期(大生長期和成熟期)，肝胰腺表達(dá)量低；卵巢的表達(dá)趨勢與內(nèi)源性卵黃蛋白原的表達(dá)趨勢基本一致，均是從增殖期到產(chǎn)后恢復(fù)期持續(xù)增高(梁俊平等, 2015)。這說明，適當(dāng)?shù)娜毖跷h(huán)境可能是脊尾白蝦卵巢發(fā)育所必需的。栗治國等(2014)發(fā)現(xiàn)，脊尾白蝦卵巢無隔室，無血管和血竇，并猜測這與脊尾白蝦卵巢體積小、氧氣便于運輸相關(guān)，本研究從一定程度上驗證了該猜測。

脊尾白蝦肝胰腺中的基因與基因的表達(dá)趨勢相一致。唐中園等(2015)研究上皮性卵巢癌時發(fā)現(xiàn)，低氧下敲除后，表達(dá)下降，并認(rèn)為低氧可誘導(dǎo)表達(dá)，促進(jìn)卵巢自噬的發(fā)生。基因可介導(dǎo)其他自噬蛋白定位于前自噬小體，是自噬發(fā)生的關(guān)鍵靶點(段振玲等, 2007)。因此，脊尾白蝦肝胰腺基因可能在的調(diào)節(jié)下參與自噬的發(fā)生，并與外源性卵黃蛋白原合成相關(guān)。卵巢中基因的表達(dá)從增殖期到大生長期表達(dá)量不斷升高，并在大生長期達(dá)到最高，在成熟期和產(chǎn)后恢復(fù)期基因的表達(dá)量又下降，這與脊尾白蝦蛻皮激素受體()在卵巢中的表達(dá)趨勢相似(梁俊平, 2015)，可能與蛻皮激素受體的表達(dá)具有相關(guān)性。梁俊平等(2015)認(rèn)為，脊尾白蝦卵巢和肝胰腺中EcR均參與了卵黃蛋白原合成，且可能對卵巢的多次成熟具有調(diào)節(jié)作用。因此，脊尾白蝦自噬相關(guān)基因可能在肝胰腺和卵巢合成卵黃蛋白原的過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

脊尾白蝦肝胰腺基因小生長期表達(dá)量最高，整個表達(dá)趨勢與基因一致。研究表明，凋亡蛋白Bcl-2可通過BH3結(jié)構(gòu)域與Beclin1蛋白相結(jié)合，從而抑制細(xì)胞自噬作用，可能對細(xì)胞最終走向自噬凋亡起著關(guān)鍵作用(Pattingre, 2005; He, 2010; 葉挺等, 2013)。這說明脊尾白蝦肝胰腺Bcl-2可能通過與Beclin1結(jié)合抑制發(fā)育早期自噬的發(fā)生并促進(jìn)大生長期和成熟期發(fā)生自噬。研究表明，大生長期和成熟期是肝胰腺外源性卵黃蛋白原合成旺盛期(梁俊平等, 2015)，這說明肝胰腺Bcl-2可能通過對自噬的調(diào)節(jié)促進(jìn)外源性卵黃蛋白原的合成。脊尾白蝦卵巢基因在卵巢發(fā)育大生長期表達(dá)量最低，整體表達(dá)趨勢與脊尾白蝦卵巢基因的表達(dá)趨勢相反。Bcl-2蛋白可以通過抑制Beclin1與VPS34共結(jié)合發(fā)揮抑制自噬的作用，說明脊尾白蝦卵巢基因與基因協(xié)同作用，共同促進(jìn)大生長期發(fā)生自噬，而抑制其他時期的自噬。又由于小生長期和大生長期是內(nèi)源性卵黃蛋白合成期卵母細(xì)胞主要存在的時期(栗治國等, 2014)，因此，和基因在卵巢中的表達(dá)共同促進(jìn)自噬的發(fā)生可能與參與內(nèi)源性卵黃蛋白原的合成相關(guān)。

綜上所述，卵巢發(fā)育時期脊尾白蝦自噬調(diào)控基因、、和相互協(xié)調(diào)，可能通過自噬作用參與脊尾白蝦卵黃蛋白原的調(diào)節(jié)促進(jìn)卵巢發(fā)育。

4 小結(jié)

本研究克隆得到了脊尾白蝦基因全長并對該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了預(yù)測。另外，通過研究卵巢發(fā)育期自噬相關(guān)基因在脊尾白蝦肝胰腺和卵巢中的表達(dá)，闡述了卵黃蛋白原合成過程中4種自噬相關(guān)基因的調(diào)控趨勢。為闡明脊尾白蝦卵黃蛋白原合成的分子調(diào)控過程、提高脊尾白蝦繁殖力提供了理論基礎(chǔ)，也為環(huán)境測評和毒理學(xué)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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(編輯 馬璀艷)

Cloning of the Translationally Controlled Tumor Protein Gene () and Expression Analysis of Autophagy Regulatory Related Genes During the Development of Ovary in

MA Li1,2, GE Qianqian2, XU Yang1,2, PENG Suxiao1,2, LI Jian2,3①

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071)

In order to understand the regulatory mechanism of ovarian development in, we used RACE (Rapid amplification of cDNA ends) technology to clone the translationally controlled tumor protein () gene. The full-length cDNA ofgene in() is 732 bp long with an intact open reading frame of 507 bp encoding a polypeptide of 168 amino acids. Six kinds of functional sites were identified in, including one N-glycosylation site, three protein kinase C phosphorylation sites, six casein kinase Ⅱ phosphorylation sites, three N-myristoylation sites, TCTP domain signature 1, and TCTP domain signature 2. Multiple alignment analysis and phylogenetic tree revealed that EcTCTP has the highest similarity to TCTP from. The results demonstrated that the cysteine (Cys) residue at the C terminal is highly conserved in all the animals, except the crustaceans. The lack of Cys residue might affect the oxidation resistance and the formation of TCTP dimers in crustaceans. The expression profile of 4 kinds of autophagy-related genes during the ovarian development period showed that: (1)gene in the hepatopancreas from proliferative stage to postpartum recovery period decreased. (2) Expression ofgene in the ovary was the highest during the minor growth phase. Furthermore, the expression profile of,, andin hepatopancreas showed a similar trend, that is, high expression from proliferative period to minor growth phase, the lowest expression during the major growth phase with an increase during the mature period. The expression level of the genein the ovary was similar to that of the gene vitellogenin in the ovary, which increased from the proliferative phase to the postpartum recovery period. The expression level of the genein the ovarian cells increased from the proliferative stage to the major growth phase, and reached the highest level during the major growth phase, which was consistent with the synthesis of endogenous vitellogenin during the late development stage in prawn. The expression of the genein the ovary was the lowest during the major growth phase. The results illustrated that the autophagy-related genes might function together in the ovarian development ofby regulating autophagy during the synthesis of vitellogenin.

;; Autophagy; Vitellogenin; Expression analysis

LI Jian, E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

10.19663/j.issn2095-9869.20170328003

* 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項資金(CARS-48)、泰山產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才工程項目(LJNY2015002)、中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(20603022016009)和青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實驗室鰲山科技創(chuàng)新計劃項目(2015ASKJ02)共同資助[This work was supported by China Agriculture Research System (CARS-48), Program of Shandong Leading Talent (LNJY2015002), Special Scientific Research Funds for Central Non-Profit Institutes, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences (20603022016009), and the Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology].馬 驪, E-mail: malidj093@qq.com

李 健，研究員，E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

2017-03-28,

2017-04-20

S917.4

A

2095-9869(2018)04-00101-09

馬驪, 葛倩倩, 許楊, 彭素曉, 李健.脊尾白蝦翻譯控制腫瘤蛋白基因克隆及自噬調(diào)控相關(guān)基因在卵巢發(fā)育期的表達(dá). 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(4): 101–109

Ma L, Ge QQ, Xu Y, Peng SX, Li J. Cloning of the translationally controlled tumor protein gene () and expression analysis of autophagy regulatory related genes during the development of ovary in. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(4): 101–109