亞硝酸鈉對(duì)自然發(fā)酵哈爾濱風(fēng)干腸微生物生長(zhǎng)、脂肪氧化及揮發(fā)性化合物的影響

劉鵬雪，孔保華*

亞硝酸鈉（NaNO2）是肉制品中一種非常重要的添加成分，具有很好的呈色和抗氧化作用，可以賦予肉制品特有的紅色，抑制脂肪氧化，有效阻止“過(guò)熱味”的產(chǎn)生，使肉制品產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味[1]。例如其對(duì)脂質(zhì)氧化抑制作用可以減少醛、醇、酮和酯等物質(zhì)產(chǎn)生，減少脂肪氧化酸敗味[2]。此外，NaNO2還具一定的抑菌作用，可以抑制肉制品中的微生物生長(zhǎng)，特別對(duì)可以產(chǎn)生毒素的肉毒梭狀芽孢桿菌具有很好的抑制作用。楊君娜等[3]研究了NaNO2添加量對(duì)薩拉米香腸色澤及產(chǎn)品質(zhì)量的影響，結(jié)果表明，NaNO2添加量越大，薩拉米的顏色越好，脂肪氧化所產(chǎn)生的丙二醛含量越少，對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用越顯著（P＜0.05）。向廷建等[4]對(duì)NaNO2在中式香腸中所發(fā)揮的抑制脂肪氧化的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，當(dāng)NaNO2添加量為0.15 g/kg時(shí)，中式香腸的氧化程度遠(yuǎn)小于未添加亞硝酸鹽的對(duì)照組（P＜0.05），但與NaNO2添加量為減少50%的實(shí)驗(yàn)組相比產(chǎn)品氧化程度差異不顯著（P＞0.05）。董慶利等[5]研究了不同NaNO2添加量條件下低溫蒸煮香腸的風(fēng)味，結(jié)果表明，NaNO2的添加使產(chǎn)品的腌肉風(fēng)味得到了改善，當(dāng)NaNO2添加量為0.15 g/kg時(shí)，多種風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量明顯增加。Hospital等[6]研究了不同亞硝酸鹽和硝酸鹽添加量對(duì)發(fā)酵風(fēng)干腸中微生物以及揮發(fā)性化合物的影響，結(jié)果表明，亞硝酸鹽/硝酸鹽濃度對(duì)風(fēng)干腸中乳酸菌的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響（P＞0.05），但可以顯著影響腸桿菌科的生長(zhǎng)（P＜0.05），添加較低濃度的亞硝酸鹽/硝酸鹽增加了由碳水化合物發(fā)酵以及氨基酸降解得到的揮發(fā)性化合物的濃度。Berardo等[7]研究了抗壞血酸鈉和NaNO2對(duì)發(fā)酵風(fēng)干香腸中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化的影響，結(jié)果表明，抗壞血酸鈉和NaNO2均能夠減少風(fēng)干腸中丙二醛的形成，但它們的組合添加將導(dǎo)致產(chǎn)品中形成更多的羰基化合物。

盡管NaNO2在肉制品加工中非常重要，但是NaNO2參與亞硝基化合物如N-亞硝胺的形成，其對(duì)人體具有致突變、致畸和致癌作用，因此，使肉制品的消費(fèi)成為具有爭(zhēng)議的問(wèn)題。新鮮的紅肉和加工肉制品已經(jīng)被指出可以增加患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，這可能與鮮肉中的血紅素鐵有關(guān)，血紅素鐵可以促進(jìn)胃腸道中亞硝基化合物的合成，而向肉中添加NaNO2可以增強(qiáng)該反應(yīng)[8]。因此，NaNO2在食品工業(yè)中的使用受到嚴(yán)格限制。自從發(fā)現(xiàn)NaNO2和N-亞硝胺之間存在一定的關(guān)聯(lián)時(shí)，對(duì)NaNO2天然替代物的研究便受到越來(lái)越多的關(guān)注。最近提出的替代方案包括使用植物提取物（如芹菜）和天然抗微生物劑（如乳酸鹽、細(xì)菌素或直接添加生物保護(hù)性乳酸菌培養(yǎng)物）等[6,9]。哈爾濱風(fēng)干腸是一種傳統(tǒng)的中式自然發(fā)酵香腸，因其獨(dú)特的質(zhì)地和風(fēng)味以及較短的生產(chǎn)周期而廣受消費(fèi)者喜愛(ài)[10]。

盡管有大量關(guān)于肉制品中NaNO2替代物的研究，但迄今為止還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何一個(gè)單一的化合物可以履行其所有的功能。因此，NaNO2在肉制品加工中仍是常見(jiàn)的添加劑。然而，為了減少人體內(nèi)NaNO2的過(guò)量積累以及亞硝胺的形成，必須控制其攝入量和殘留水平，因此有必要評(píng)估降低NaNO2的添加量對(duì)肉制品所產(chǎn)生的影響。本實(shí)驗(yàn)研究不同添加水平的NaNO2對(duì)自然發(fā)酵哈爾濱風(fēng)干腸微生物、NaNO2殘留量、顏色、脂肪氧化及揮發(fā)性化合物的影響，為進(jìn)一步進(jìn)行NaNO2替代物的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料肉 哈爾濱北大荒肉業(yè)；輔料 市購(gòu)；NaNO2（食品級(jí)） 哈爾濱億人食品添加劑公司；亞硝酸鹽試劑盒 南京建成生物工程研究所；營(yíng)養(yǎng)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；MRS（Man-Rogosa-Sharpe）培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；鹽酸、丙酮、甲醇（均為分析純）哈爾濱盛達(dá)化驗(yàn)儀器銷售公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL-104型精密電子天平 上海精科實(shí)業(yè)有限公司；FE20K型pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司；722可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ZE-6000電子色差儀 日本電色工業(yè)株式會(huì)社；Aqua Lab水分活度測(cè)定儀 美國(guó)Decagon公司；GC-3L小型灌腸機(jī) 瑞安市鴻飛機(jī)械有限公司；6890氣相色譜儀/5973質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 自然發(fā)酵哈爾濱風(fēng)干腸的制備

原料：精瘦肉（豬臀肉）4.5 kg、肥肉（豬背膘）0.5 kg。輔料：鹽0.125 kg、曲酒0.05 kg、綿白糖0.05 kg、姜粉0.025 kg、味素0.025 kg、淀粉0.025 kg、純凈水0.05 kg、混合調(diào)料（花椒、大料、桂皮、丁香等）0.15 kg，NaNO2根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)添加，其添加量按瘦肉計(jì)分別為0.15、0.10 g/kg和0.05 g/kg以及不添加亞硝酸鹽的對(duì)照組。

工藝要點(diǎn)：瘦肉剔除淋巴、筋腱、血管等結(jié)締組織并切丁后，加入鹽和用純凈水溶解的NaNO2進(jìn)行腌制，肥肉切丁，將腌制好的瘦肉丁和肥肉丁混合均勻后，加入調(diào)味料混勻，進(jìn)行灌制，灌制好的風(fēng)干腸在（25±2）℃條件下風(fēng)干24 h，相對(duì)濕度為30%～50%，然后轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕箱中進(jìn)行發(fā)酵，溫度為（25±2）℃，相對(duì)濕度為70%～75%，在發(fā)酵0、3、6、9 d和12 d測(cè)定pH值、水分活度、微生物、NaNO2殘留量、紅度值a*、亮度值L*和脂肪氧化值，在0 d和12 d測(cè)定揮發(fā)性化合物的相對(duì)含量。

1.3.2 pH值和水分活度的測(cè)定

pH值：參照GB/T 9695.5—2008《肉與肉制品pH測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定；水分活度：將剪碎的風(fēng)干腸鋪滿樣品盒底部后推入水分活度儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 微生物的測(cè)定

稱取10 g剪碎的風(fēng)干腸，加入90 mL生理鹽水（0.85%），于4 ℃條件下放置30 min，從該樣液中制備連續(xù)10 倍的稀釋液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。參照Hospital等[6]的方法，使用平板計(jì)數(shù)瓊脂進(jìn)行總菌落計(jì)數(shù)的測(cè)定，MRS培養(yǎng)基進(jìn)行乳酸菌菌落計(jì)數(shù)的測(cè)定，雙層結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂進(jìn)行大腸桿菌菌落計(jì)數(shù)的測(cè)定。

1.3.4 NaNO2殘留量的測(cè)定

10 g剪碎的風(fēng)干腸，加入90 mL純凈水，于4 ℃條件下放置30 min，取上清液依次加入測(cè)試盒中的試劑，0.5 cm光徑比色杯，于波長(zhǎng)550 nm處測(cè)吸光度，通過(guò)比色可間接換算NaNO2殘留量，按公式（1）計(jì)算：

式中：標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100 μmol/L。

1.3.5 風(fēng)干腸顏色的測(cè)定

通過(guò)ZE-6000色差計(jì)進(jìn)行測(cè)定。儀器經(jīng)零點(diǎn)校正和白板（L*=95.26、a*=-0.89、b*=1.18）校正后，將去除腸衣和肥肉的中心樣品混勻，鋪滿色差杯底部，置于載物臺(tái)測(cè)定風(fēng)干腸的L*值和a*值，每個(gè)樣品同一方向旋轉(zhuǎn)3 次，測(cè)定3 次后輸出平均值并記錄。

1.3.6 脂肪氧化的測(cè)定

1.3.6.1 過(guò)氧化物值（peroxide value，POV）的測(cè)定

參照Vareltzis等[11]的方法并稍作修改，準(zhǔn)確稱取2.0 g剪碎的樣品放入50 mL離心管中，加入15 mL貯藏于4 ℃的氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液11 000 r/min高速均質(zhì)30 s，再加入3 mL體積分?jǐn)?shù)為0.5%的NaCl溶液，4 ℃、4 000×g離心5 min，樣品分為兩相，從下層液相中取出5 mL溶液轉(zhuǎn)移到潔凈試管中，加入5 mL貯藏于4 ℃的氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液，渦旋混勻3 s，再加入25 μL氯化亞鐵溶液和25 μL硫氰酸銨（30%）溶液，渦旋混勻3 s，室溫靜置5 min，取上清液在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)吸光度，以還原鐵粉的吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的POV。

1.3.6.2 硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）的測(cè)定

參照Wang等[12]的方法，略作修改，準(zhǔn)確稱取2.0 g剪碎的樣品放入試管中，加入3 mL硫代巴比妥酸溶液和17 mL三氯乙酸-鹽酸溶液，混勻后沸水浴中加熱30 min，取出后迅速冷卻至室溫，吸取5 mL反應(yīng)后的上清液加入等體積的氯仿，1 000×g離心10 min，于波長(zhǎng)532 nm處測(cè)量上清液的吸光度。TBARS以每千克脂質(zhì)氧化樣品中丙二醛的質(zhì)量表示，按公式（2）計(jì)算：

式中：A532nm為樣品的吸光度；Ms為樣品的質(zhì)量/g。

1.3.7 揮發(fā)性化合物的測(cè)定

采用頂空固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）對(duì)自然發(fā)酵風(fēng)干腸中的揮發(fā)性化合物進(jìn)行提取，利用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀進(jìn)行風(fēng)味成分分析。在分析取樣之前，萃取頭在GC進(jìn)樣口進(jìn)行老化處理，老化溫度為280 ℃，時(shí)間為60 min。取5 g剪碎的風(fēng)干腸裝入20 mL樣品瓶中，放在取樣臺(tái)上于60 ℃條件下平衡20 min后，將萃取頭插入到樣品瓶中，推出纖維頭，吸附40 min。

利用GC-MS進(jìn)行揮發(fā)性化合物的分析檢測(cè)，參照宋永等[13]的方法，將樣品瓶中已經(jīng)吸附好的纖維頭抽回，并將萃取頭從樣品瓶中拔出，進(jìn)而插入GC儀并推出纖維頭，260 ℃解吸5 min。GC條件：HP-1毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，1.0 μm）；分流進(jìn)樣，分流比為10∶1；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；接口溫度280 ℃；兩段式程序升溫：起始溫度38 ℃，保持2 min，然后以3 ℃/min升溫至100 ℃；再以10 ℃/min升溫至240 ℃，并保持2 min。使用質(zhì)量選擇性檢測(cè)器得到MS圖。MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度200 ℃；激活電壓350 V；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～450。

1.4 數(shù)據(jù)處理

共進(jìn)行3 批實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)，結(jié)果表示為 ±s。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1（分析軟件，StPaul，MN）軟件包中Linear Models程序進(jìn)行，差異顯著性（P＜0.05）分析使用Tukey HSD程序，采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值和水分活度測(cè)定結(jié)果

表1 風(fēng)干腸發(fā)酵過(guò)程中pH值和水分活度的變化Table 1 Changes in pH and water activity in air-dried sausages during fermentation

如表1所示，4 組風(fēng)干腸的pH值均從6.23左右顯著降低到5.53左右（P＜0.05），0～3 d下降速率較快，3～12 d下降速率減慢，這可能是由于在發(fā)酵初期一些優(yōu)勢(shì)乳酸菌的代謝產(chǎn)物乳酸促進(jìn)了風(fēng)干腸pH值的下降，而在后期由于微生物的代謝產(chǎn)生了一些堿性物質(zhì)，如氨和三甲胺等，阻礙了風(fēng)干腸pH值的降低[14]。對(duì)于水分活度而言，4 組風(fēng)干腸的水分活度均從0.94左右顯著降低到0.80左右（P＜0.05），且下降趨勢(shì)相似（P＞0.05），0～3 d下降速率較慢，3～12 d下降速率較快，這可能與pH值的變化有關(guān)，風(fēng)干腸pH值的降低會(huì)使肌肉蛋白發(fā)生變性，促進(jìn)蛋白質(zhì)的凝膠化，從而使蛋白的持水性降低[15]。在本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，添加不同水平亞硝酸鹽的風(fēng)干腸的pH值和水分活度在風(fēng)干發(fā)酵期間均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明NaNO2的添加對(duì)風(fēng)干腸的pH值和水分活度無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。其他研究者也報(bào)道了類似的結(jié)果。Maha等[16]研究了亞硝酸鹽和檸檬酸對(duì)牛肉香腸化學(xué)成分及pH值的影響，結(jié)果表明，添加NaNO2的牛肉香腸的pH值與未添加NaNO2的牛肉香腸相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。Hospital等[6]也研究發(fā)現(xiàn)，不同NaNO2濃度的風(fēng)干腸在風(fēng)干發(fā)酵期間pH值和水分活度均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 微生物分析

圖1 風(fēng)干腸發(fā)酵過(guò)程中典型的微生物菌落總數(shù)的變化Fig. 1 Changes in total bacterial count in sausages during fermentation

如圖1所示，NaNO2添加量對(duì)風(fēng)干腸中總菌落數(shù)和乳酸菌菌落數(shù)無(wú)顯著影響（P＞0.05），各組風(fēng)干腸的總菌落數(shù)均在0～3 d內(nèi)迅速增加并在3～6 d內(nèi)保持穩(wěn)定，6～12 d呈逐漸下降趨勢(shì)，乳酸菌菌落數(shù)均在0～6 d內(nèi)呈持續(xù)上升趨勢(shì)并在第6天時(shí)達(dá)到最大值，隨后呈下降趨勢(shì)，這可能與風(fēng)干腸中水分活度變化有關(guān)，王俊等[17]指出，當(dāng)水分活度低于0.90時(shí)，大部分腐敗菌便不能生長(zhǎng)。但NaNO2添加量對(duì)大腸桿菌菌落數(shù)有顯著影響（P＜0.05），主要體現(xiàn)在發(fā)酵初期（0～3 d），當(dāng)NaNO2添加量為0.05 g/kg時(shí)，雖然在整個(gè)風(fēng)干發(fā)酵期間其大腸桿菌菌落數(shù)均低于對(duì)照組，但在0～3 d內(nèi)仍有所增加，說(shuō)明當(dāng)NaNO2添加量為0.05 g/kg時(shí)，大腸桿菌仍能生長(zhǎng)，而當(dāng)NaNO2添加量大于0.05 g/kg時(shí)，風(fēng)干腸中的大腸桿菌菌落數(shù)在0～12 d內(nèi)均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，且添加量越大，對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用越顯著（P＜0.05）。Hospital等[6]研究發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽的濃度不影響風(fēng)干腸中乳酸菌的生長(zhǎng)，但當(dāng)亞硝酸鹽添加量較低時(shí)，腸桿菌科在風(fēng)干腸的發(fā)酵期間數(shù)量增加，這與本研究結(jié)果一致。

2.3 NaNO2殘留量分析

圖2 風(fēng)干腸發(fā)酵過(guò)程中NaNO2殘留量的變化Fig. 2 Changes in residual sodium nitrite in sausages during fermentation

添加到肉制品中的亞硝酸鹽一部分通過(guò)螯合氧被氧化成硝酸鹽，一部分與肌紅蛋白結(jié)合形成熱穩(wěn)定的亞硝基肌紅蛋白，其他的部分還可以與肉中的蛋白質(zhì)和脂肪或其他物質(zhì)結(jié)合[18]。如圖2所示，添加了NaNO2的3 組風(fēng)干腸在0～3 d內(nèi)NaNO2殘留量均超出了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)所限定的最大殘留量30 mg/kg，且NaNO2殘留量在0～6 d下降速率較快，6～12 d下降速率較慢，F(xiàn)ernández-López等[19]研究西班牙發(fā)酵風(fēng)干腸中的NaNO2殘留量的變化，其研究結(jié)果與本研究一致。此外，發(fā)酵結(jié)束后，3 組添加NaNO2的風(fēng)干腸之間的NaNO2殘留量差異不顯著（P＞0.05），不受NaNO2添加量的影響，Hospital等[6]指出，發(fā)酵肉制品中亞硝酸鹽的殘留量與添加量沒(méi)有明顯的相關(guān)性。但有學(xué)者研究表明風(fēng)干腸中亞硝胺的生成量與NaNO2添加量呈正相關(guān)[20]。從圖2還可以看出，對(duì)照組風(fēng)干腸中NaNO2殘留量在0～3 d內(nèi)呈上升趨勢(shì)，隨后呈逐漸下降趨勢(shì)，含量的增加可能是由于水分含量降低所導(dǎo)致。與對(duì)照組相比，3 組添加NaNO2的風(fēng)干腸在第12天時(shí)其NaNO2殘留量約為對(duì)照組樣品的2～3 倍。較高的NaNO2殘留量易導(dǎo)致產(chǎn)品中形成更多的N-亞硝胺，特別是將其加熱時(shí)[6]。

2.4 顏色變化結(jié)果

表2 風(fēng)干腸發(fā)酵過(guò)程中a*值和L*值的變化Table 2 Changes in a* values and L* values of sausages during fermentation

肉制品在腌制的過(guò)程中，由于肌紅蛋白發(fā)生氧化，形成的高鐵肌紅蛋白導(dǎo)致肉色變成暗紅色，影響其感官品質(zhì)，也影響人們的食欲，NaNO2的添加可以使肉制品中產(chǎn)生具有誘人的鮮紅色的亞硝基肌紅蛋白[21]。如表2所示，與對(duì)照組相比，NaNO2的添加顯著提高了風(fēng)干腸的a*值（P＜0.05），且NaNO2添加量越大，a*值越高，但當(dāng)NaNO2添加量超過(guò)0.10 g/kg時(shí)，a*值增加不顯著（P＞0.05）。此外，經(jīng)NaNO2腌制的風(fēng)干腸在整個(gè)風(fēng)干發(fā)酵期間a*值保持穩(wěn)定（P＞0.05），與NaNO2添加量不相關(guān)。Riel等[22]研究發(fā)現(xiàn)，添加了NaNO2的煙熏型香腸在貯藏的1～28 d內(nèi)，a*值無(wú)顯著性變化（P＞0.05）。Terns等[23]對(duì)乳化腸貯藏期間的品質(zhì)變化進(jìn)行研究，結(jié)果表明添加了NaNO2的產(chǎn)品在0～84 d內(nèi)a*值差異不顯著（P＞0.05）。這表明添加NaNO2的產(chǎn)品紅度值比較穩(wěn)定。從表2還可以看出，只有第0天時(shí)，當(dāng)NaNO2添加量超過(guò)0.10 g/kg，可顯著降低風(fēng)干腸的L*值（P＜0.05），且隨著添加量的增加，差異不顯著（P＞0.05）。這可能是由于高含量NaNO2的添加使風(fēng)干腸在混料和灌制的過(guò)程中立即形成更多灰色和棕色的肌紅蛋白，從而使產(chǎn)品的L*值降低[24]。第3～12天時(shí)，4 組風(fēng)干腸的L*值均保持穩(wěn)定且差異不顯著（P＞0.05）。

如表3所示，添加了NaNO2的3 組風(fēng)干腸的a*值顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且與表2相比，對(duì)照組風(fēng)干腸的a*值在熟制后降低，這是因?yàn)镹aNO2的添加使風(fēng)干腸中產(chǎn)生了亞硝基肌紅蛋白，在加熱時(shí)，蛋白質(zhì)部分變性，形成亞硝基血色原，為穩(wěn)定的紅色，這種物質(zhì)甚至可以在加熱至120 ℃的肉制品中保持性狀穩(wěn)定，從而使肉制品保持顏色的穩(wěn)定[18]。此外，當(dāng)NaNO2添加量超過(guò)0.10 g/kg時(shí)，可顯著降低風(fēng)干腸熟制初期（0 d）的L*值（P＜0.05），熟制后期（6～12 d）4 組風(fēng)干腸的L*值無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。且4 組風(fēng)干腸均在第0天呈現(xiàn)最高的L*值，第3天顯著降低（P＜0.05）并在之后的發(fā)酵過(guò)程中保持穩(wěn)定（P＞0.05），這與表2研究結(jié)果一致。

表3 風(fēng)干腸發(fā)酵不同時(shí)間熟制后a*值和L*值的變化Table 3 Changes in a* values and L* values in cooked dry sausages with different fermentation times

2.5 脂肪氧化分析

脂肪適度氧化時(shí)可以產(chǎn)生一些相應(yīng)的醛、醇、酮和酯等，使肉制品呈現(xiàn)出典型的動(dòng)物油脂味及香甜的果香味等，但過(guò)度氧化會(huì)導(dǎo)致肉制品產(chǎn)生酸敗現(xiàn)象，并使得產(chǎn)品的質(zhì)地、顏色和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值發(fā)生惡化，對(duì)人體健康有一定的危害[2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中測(cè)定風(fēng)干腸的POV和TBARS值評(píng)估NaNO2對(duì)脂肪氧化的影響。

POV作為檢測(cè)脂肪初級(jí)氧化程度的重要指標(biāo)，其指示的是過(guò)氧化物的產(chǎn)生。如圖3A所示，4 組風(fēng)干腸的初始POV均為0.115 mmol/kg左右，0～3 d急劇增長(zhǎng)并在第3天達(dá)到最高值，隨后逐漸降低，這表明此時(shí)過(guò)氧化物的形成速率比其分解速率慢，而發(fā)酵初期POV的增加可能是因?yàn)樵谠先獾那兴橐约盎靹虻倪^(guò)程中，脂肪暴露于空氣中而使氧化更易發(fā)生[25]。從圖3A還可以看出，添加NaNO2的風(fēng)干腸，其POV顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），且添加量越大，POV越?。≒＜0.05），這說(shuō)明NaNO2的添加可以有效地抑制風(fēng)干腸中過(guò)氧化物的生成。

TBARS值是檢測(cè)脂肪氧化次級(jí)產(chǎn)物的重要指標(biāo)，也是影響產(chǎn)品風(fēng)味的重要指標(biāo)，如果過(guò)高則會(huì)使食品產(chǎn)生哈喇味[26]。如圖3B所示，隨著風(fēng)干發(fā)酵的進(jìn)行，各組風(fēng)干腸的TBARS值均呈逐漸上升的趨勢(shì)。發(fā)酵初期，TBARS值增加速率相對(duì)緩慢，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵初期主要是脂肪氧化初級(jí)產(chǎn)物的大量積累階段，且分解速率較慢，所以次級(jí)氧化產(chǎn)物積累還比較少，發(fā)酵后期，TBARS值增加速率較快，說(shuō)明此階段脂肪氧化的初級(jí)產(chǎn)物生成速率減慢而分解速率加快，脂肪氧化的程度加大，次級(jí)產(chǎn)物含量增多。

從圖3B還可以看出，與對(duì)照組相比，添加了NaNO2的3 組風(fēng)干腸在0～12 d內(nèi)TBARS值均處于較低的狀態(tài)，且NaNO2添加量越大，TBARS值越低（P＜0.05）。較低的TBARS值說(shuō)明NaNO2具有良好的抑制脂肪次級(jí)氧化的作用。亞硝酸鹽在肉制品中可以通過(guò)幾種不同的方式來(lái)抑制脂肪的氧化：通過(guò)與血紅素蛋白中心的鐵配位而形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而防止氫過(guò)氧化物被血紅素蛋白催化分解；與肉中的一些成分反應(yīng)，形成具有抗氧化活性的亞硝基和亞硝?；衔?；除此之外還可以通過(guò)與碳-碳雙鍵反應(yīng)來(lái)穩(wěn)定脂質(zhì)部分[7]。

圖3 風(fēng)干腸發(fā)酵過(guò)程中脂肪氧化的變化Fig. 3 Changes in lipid oxidation in sausages during fermentation

2.6 揮發(fā)性風(fēng)味化合物分析

在風(fēng)干腸發(fā)酵的第0天和第12天，利用SPME-GC-MS提取并鑒定出63 種揮發(fā)性化合物。將這些化合物分為8 類，如表4所示，包括12 種醛、11 種醇、4 種酮、6 種酸、6 種酯、5 種烷烴、16 種烯烴以及3 種其他物質(zhì)，這些化合物主要來(lái)源于碳水化合物代謝，蛋白質(zhì)水解，脂肪水解和氧化以及香辛料。

碳水化合物發(fā)酵和氨基酸降解是肉制品發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生風(fēng)味的重要途徑[27]。如表4所示，2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮、乙酸和丙酸是由乳酸菌代謝風(fēng)干腸中的碳水化合物產(chǎn)生[28]。細(xì)菌發(fā)酵可以促進(jìn)風(fēng)干腸中肌肉蛋白質(zhì)降解成游離氨基酸，氨基酸通過(guò)微生物轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化為α-酮酸，進(jìn)而代謝成相應(yīng)的醛。此外，醛可以通過(guò)醇脫氫酶和醛脫氫酶轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的醇和羧酸[29]。風(fēng)干腸中的2-甲基丙醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、苯甲醛和苯乙醛以及它們相應(yīng)的醇和酸，分別源自纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸的降解。如表4所示，NaNO2的添加顯著降低了風(fēng)干腸中2-辛烯醛、2-甲基丁醛、2-辛烯醇、3-甲基-1-丁醇及它們所對(duì)應(yīng)的酸的含量（P＜0.05），但與NaNO2的添加量不相關(guān)（P＞0.05）。

脂肪氧化也是風(fēng)干腸發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生揮發(fā)性化合物并改善風(fēng)味的重要途徑之一。在63 種揮發(fā)性化合物中，線性醛、酮及其相應(yīng)的醇、酸和酯以及烷烴是由脂肪的自動(dòng)氧化產(chǎn)生[30]。己醛、庚醛和壬醛可能分別是亞油酸、n-6和n-9多不飽和脂肪酸氧化的產(chǎn)物[4]。己烷和庚烷通常由脂肪自動(dòng)氧化產(chǎn)生的過(guò)氧化物經(jīng)分子重新排列而產(chǎn)生[31]。當(dāng)這些化合物達(dá)到一定濃度時(shí)，即可產(chǎn)生風(fēng)干腸特有的發(fā)酵香味。如表4所示，在第0天時(shí)揮發(fā)性化合物只檢測(cè)出了壬醛，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，脂肪氧化促進(jìn)了醛類和酮類物質(zhì)的大量生成，第12天時(shí)，與對(duì)照組相比，NaNO2的添加顯著降低了風(fēng)干腸中己醛的相對(duì)含量（P＜0.05），但與NaNO2的添加量不相關(guān)（P＞0.05）。己醛是肉中脂肪酸自動(dòng)氧化最重要的產(chǎn)物，易產(chǎn)生具有刺激性的腐敗和辛辣的味道[32]。此外，NaNO2添加量顯著影響風(fēng)干腸中辛醛和壬醛的相對(duì)含量，這2 種物質(zhì)只有在NaNO2添加量大的風(fēng)干腸中有所減少。同時(shí)，與對(duì)照組相比，NaNO2的添加還顯著降低了作為脂肪酸氧化最終產(chǎn)物的酮類物質(zhì)的相對(duì)含量（P＜0.05），NaNO2添加量越大，酮類物質(zhì)相對(duì)含量越小（P＜0.05）。醛類和酮類揮發(fā)性化合物相對(duì)含量的減少可以歸因于NaNO2抗脂肪氧化的作用，這與POV和TBARS值的測(cè)定結(jié)果相符。

4 組風(fēng)干腸中，共檢測(cè)出22 種源于香辛料的揮發(fā)性化合物，包括3 種醇、16 種烯烴和3 種其他物質(zhì)，從表4可以看出，此類物質(zhì)不受發(fā)酵時(shí)間以及NaNO2添加量的影響（P＞0.05）。

表4 風(fēng)干腸揮發(fā)性風(fēng)味化合物相對(duì)含量的變化Table 4 Changes in relative contents of volatile flavor compounds in sausages

續(xù)表4

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)研究不同NaNO2添加量對(duì)自然發(fā)酵哈爾濱風(fēng)干腸理化特性及揮發(fā)性化合物的影響。結(jié)果表明NaNO2添加量不影響風(fēng)干腸的pH值、水分活度和發(fā)酵后期（6～12 d）的L*值，但在發(fā)酵初期（0～3 d），當(dāng)NaNO2添加量達(dá)到0.10 g/kg時(shí)，可顯著降低風(fēng)干腸的L*值，且當(dāng)NaNO2添加量達(dá)到0.10 g/kg時(shí)，便可以有效抑制脂肪氧化，提高風(fēng)干腸的a*值。此外在發(fā)酵后期NaNO2添加量與殘留量之間相關(guān)性不顯著，后期可進(jìn)一步研究NaNO2殘留量在亞硝胺形成中的作用。微生物分析結(jié)果表明，NaNO2添加量不影響風(fēng)干腸中細(xì)菌總菌和乳酸菌的生長(zhǎng)，但只有當(dāng)NaNO2添加量達(dá)到0.10 g/kg時(shí)，才可顯著降低大腸桿菌菌群的繁殖。與此同時(shí)，添加NaNO2還能夠抑制由脂肪氧化得到的氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，且與低NaNO2添加量風(fēng)干腸相比，當(dāng)NaNO2添加量達(dá)到0.10 g/kg時(shí)，可以抑制更多脂肪氧化產(chǎn)物的形成，但NaNO2的添加對(duì)一般的風(fēng)味化合物產(chǎn)生無(wú)不良影響且與NaNO2添加量不相關(guān)。綜上所述，可以將風(fēng)干腸中NaNO2的添加量減少為0.10 g/kg。