多菌種固態(tài)發(fā)酵法提高燕麥全谷物的蛋白質(zhì)營養(yǎng)品質(zhì)

吳 寒，芮 昕，李春陽，夏秀東，董明盛,*

在“富貴病”泛濫的二十一世紀(jì)，谷物食品所代表的健康生活方式在全球受到廣泛追隨，符合當(dāng)代社會“三高兩低”飲食結(jié)構(gòu)的需要。隨著研究深入，谷物營養(yǎng)價值和保健功能不斷被挖掘，其多種功效成分對防治慢性病和輔助治療疾病有積極作用。燕麥屬于禾本科植物，根據(jù)外稃性狀可以分為裸粒型燕麥和帶稃型燕麥兩類[1]。在全球范圍內(nèi)，燕麥年總產(chǎn)量約超過24萬 t，是繼小麥、玉米、稻谷、大麥和高粱之后世界上第六大糧食作物[2]，我國的燕麥栽培以裸粒型燕麥為主，種植面積占燕麥種植總面積的90%以上[3]。

受生長環(huán)境和基因表達的影響，燕麥蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)在11.19%～19.85%之間，位于谷類作物之首，是小麥和大米等主食的1.6～2.3 倍[4]，主要包括谷蛋白、球蛋白、清蛋白和醇溶蛋白，其中球蛋白含量最高，約占總蛋白的75%[5]。燕麥中的膳食纖維、必需氨基酸、不飽和脂肪酸、VB1和礦物質(zhì)含量豐富，含有β-葡聚糖、皂苷、多酚類化合物等多種功能性物質(zhì)，具有極高的營養(yǎng)價值。研究發(fā)現(xiàn)，燕麥β-葡聚糖主要分布在胚乳和糊粉層細胞壁上，有降血脂、降血糖、調(diào)節(jié)免疫和改善腸道菌群等功能[6]。陸燦等[7]通過大孔樹脂吸附、MCI和ODS柱純化、核磁共振分析提取并分離了燕麥籽粒中的皂苷，發(fā)現(xiàn)其對乳腺癌細胞MCF-7和人宮頸癌細胞Hela有顯著的抑制作用。目前已發(fā)現(xiàn)的燕麥酚酸類化合物，如阿魏酸、香豆酸、香草酸、咖啡酸及一些衍生物主要分布在麩皮上[8]，燕麥蒽酰胺是燕麥特有的一種抗氧化成分，分為Bp、Bf和Bc三種類型，在籽粒中的含量最高[9]。

長期以來，國內(nèi)外市場上燕麥產(chǎn)品以初加工食品為主，如燕麥粒、燕麥麩、燕麥粉等，隨著人們對燕麥營養(yǎng)和保健功能的日益關(guān)注，燕麥米、燕麥飲料、燕麥膨化脆等一系列產(chǎn)品也相繼亮相。然而，燕麥不含濕面筋，面粉無法形成面團，是燕麥深加工所面臨的技術(shù)性難題，每年僅有少量燕麥用于食品開發(fā)，大部分多為農(nóng)民自產(chǎn)自食，或當(dāng)作飼料喂養(yǎng)牲畜[10-11]。為充分利用燕麥資源，開發(fā)全價營養(yǎng)、高附加值的燕麥新型食品，本研究選擇了傳統(tǒng)又新穎的加工方式——固態(tài)發(fā)酵技術(shù)，以微生物發(fā)酵為基礎(chǔ)，進一步挖掘原料的潛在價值。固態(tài)發(fā)酵是微生物發(fā)酵的主要方式之一，指的是在發(fā)酵體系無水或幾乎沒有自由水的狀態(tài)下，微生物進行生長發(fā)酵的過程，該技術(shù)簡單易操作，生產(chǎn)過程含水量低，無需廢水處理等環(huán)節(jié)，具有低成本、少污染、利用率高的特點[12-13]。相比于液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的投資成本高、廢棄物污染嚴(yán)重、產(chǎn)品運輸困難、原料無法大規(guī)模利用等現(xiàn)狀，固態(tài)發(fā)酵更加符合現(xiàn)代工業(yè)提出的“節(jié)能減排、低碳生產(chǎn)”相關(guān)要求。

植物乳桿菌是公認的安全的食品級微生物，被廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品、果蔬制品和谷物制品的生產(chǎn)加工中，是近年來發(fā)酵食品生產(chǎn)選擇的理想菌種[14]。植物乳桿菌通過發(fā)酵，能夠增加食品中營養(yǎng)物質(zhì)的種類，產(chǎn)生乳酸、醋酸、丙酸等有機酸，形成新的呈味物質(zhì)；降低環(huán)境pH值，防止雜菌的污染，延長產(chǎn)品保質(zhì)期；活性菌體和代謝產(chǎn)物還能刺激巨噬細胞的吞噬作用，有效增強機體免疫力，避免病原菌的侵害[15-18]。由于乳酸菌淀粉酶和蛋白酶活力相對較低，多以液態(tài)發(fā)酵為主，難以直接利用固態(tài)基質(zhì)中的營養(yǎng)物質(zhì)，因此，對于燕麥全谷物固態(tài)發(fā)酵而言，選擇單菌種發(fā)酵的難度較大[16]。

為實現(xiàn)燕麥全谷物中乳酸菌的固態(tài)發(fā)酵，為益乳酸菌尋找新的生長載體，本研究還選擇了一株美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認證的安全菌株，即固態(tài)發(fā)酵傳統(tǒng)菌種——米根霉與之復(fù)配。該菌種屬于絲狀真菌，能夠在缺乏自由水的固態(tài)環(huán)境中穿過基質(zhì)表皮到達內(nèi)部，提高燕麥底物中營養(yǎng)成分的吸收利用率，為乳酸菌生長提供可直接利用的碳、氮源[19]。Zhang Shanting等[20]曾報道，混合發(fā)酵可以有效促進乳酸菌在固態(tài)基質(zhì)中的生長，相比水解法和添加營養(yǎng)因子法更加安全，具有廣闊的應(yīng)用前景，在大豆中接種植物乳桿菌P-8和納豆枯草芽孢桿菌，乳酸菌計數(shù)在48 h高達2.19×1010CFU/g，游離氨基酸態(tài)氮由99.7 μmol/g提高至529.17 μmol/g。本實驗將以植物乳桿菌和米根霉共同發(fā)酵為基礎(chǔ)，研究多菌種在燕麥全谷物基質(zhì)中的生長情況，圍繞微生物酶系對燕麥蛋白的水解作用展開討論，比較發(fā)酵前后燕麥蛋白質(zhì)氨基酸組成和營養(yǎng)價值評分，以期為乳酸菌固態(tài)發(fā)酵燕麥全谷物提供一定的理論依據(jù)，促進燕麥全價營養(yǎng)食品和功能型益生菌食品的后續(xù)開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌70810分離于泡菜，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品微生物實驗室提供；米根霉 安琪酵母股份有限公司；燕麥仁 安徽燕之坊食品有限公司。

MRS培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；麥角固醇（色譜純） 美國Aladdin公司；正戊烷（色譜純）上海沃凱試劑公司；甲醇（色譜純） 美國Tedia試劑公司；考馬斯亮藍G250、十二烷基硫酸鈉、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）（均為分析純） 南京壽德試劑公司；溴酚藍、丙烯酰胺（均為分析純） 德國Merck公司；牛血清白蛋白（分析純） 上海源葉生物公司；Protein Marker（分子質(zhì)量12～120 Da）上海生工生物技術(shù)公司；納他霉素、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）（均為分析純） 北京Slarbio公司；胰酪蛋白胨（分析純） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LHS-150SC恒溫恒濕箱 上海一恒科技有限公司；64RL高速冷凍離心機 美國Beckman公司；AUY-120分析天平、UV-2450紫外分光光度計 日本島津公司；Powerdry LL3000型冷凍干燥機 美國Thermo公司；1100型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配有G1315B型DAD檢測器和C18反相色譜柱） 美國Agilent公司；Mini-Protean型電泳儀 美國Bio-Rad公司；WD-9405A型脫色搖床北京六一儀器廠；GDS-8000型凝膠成像分析系統(tǒng)美國UVP公司；L-8900氨基酸分析儀（配有自動進樣器和Windows XP系統(tǒng)） 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及發(fā)酵[21]

通過測定植物乳桿菌70810在MRS培養(yǎng)基中的生長曲線，確定第1次活化時間為24 h，第2次活化時間為12 h。將活化后的乳酸菌在4 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min，去除發(fā)酵上清液，加入等體積的0.85 g/100 mL生理鹽水吹打菌體，重復(fù)操作2次，獲得菌懸制備液。

1.3.2 發(fā)酵條件[22]

挑選顆粒飽滿的燕麥，加入1%乳酸溶液，在22 ℃條件下浸泡6 h。將水分排除后，用沸水蒸煮10 min，瀝干燕麥，分裝入無菌盆中冷卻。接種1.5 mL/100 g植物乳桿菌70810，封口，在30 ℃條件下，放于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵，每隔12 h取樣，樣品凍干，粉碎后過60目篩，得到乳酸菌發(fā)酵燕麥凍干粉。按上述步驟，同時接種1.5 mL/100 g植物乳桿菌70810和質(zhì)量分數(shù)0.5%米根霉，封口、戳孔，在30 ℃、90%相對濕度條件下，放于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵，每隔12 h取樣。樣品凍干，粉碎后過60目篩，得到多菌種發(fā)酵燕麥凍干粉。

1.3.3 微生物生長情況測定

1.3.3.1 乳酸菌活菌計數(shù)[23-24]

采用平板計數(shù)法測定。無菌稱取25 g燕麥，加入225 mL 0.85 g/100 mL無菌生理鹽水，混勻后進行10 倍系列稀釋，選取3 個連續(xù)且適宜的質(zhì)量濃度梯度，各吸取1 mL菌液于培養(yǎng)皿中，傾注法加入適量的MRS瓊脂培養(yǎng)基，凝固后倒置于30 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48～60 h。為避免計數(shù)過程中霉菌的生長，可用75%乙醇溶液配制納他霉素母液，過無菌0.22 μm有機系濾膜，并按一定比例加入MRS瓊脂培養(yǎng)基中，得到質(zhì)量濃度為10 μg/mL的納他霉素-MRS溶液用于計數(shù)。

1.3.3.2 麥角固醇含量測定[24]

采用HPLC法測定。準(zhǔn)確稱取10 g燕麥，搗碎后移至三角瓶中，加入37.5 mL甲醇、25 mL 95%乙醇溶液和5 g氫氧化鉀，沸水浴15 min，加入12.5 mL蒸餾水搖勻。用正戊烷重復(fù)萃取3 次，添加比例為1∶1（V/V），在30 ℃、100 r/min條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)上清液2 min，復(fù)溶于0.5 mL甲醇，過0.45 μm有機系濾膜，待測。HPLC條件：色譜柱為C18柱（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為25 ℃；流動相為100%甲醇；流速為1.5 mL/min；檢測波長為282 nm；進樣量為20 μL。以甲醇作為空白對照，麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（0～200 μg/mL）的線性回歸方程為y=15.498 0x＋27.271 0（R2=0.999 4）。

1.3.3.3 pH值測定[25]

采用pH計直接測定。準(zhǔn)確稱取10 g燕麥，在研缽中搗碎，加入100 mL無二氧化碳蒸餾水，搖勻15 min，過濾取濾液，定容至100 mL，待測。

1.3.3.4 總酸含量測定[25]

采用滴定法測定。準(zhǔn)確稱取2 g燕麥，在研缽中搗碎，加入15 mL無二氧化碳蒸餾水，75 ℃水浴加熱0.5 h，過濾取濾液，定容至250 mL。準(zhǔn)確吸取50 mL濾液，滴入3～4 滴酚酞指示劑，用標(biāo)定后的0.1 mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至溶液呈微紅且30 s不褪色，記錄所消耗氫氧化鈉的體積?？偹岫x為發(fā)酵后燕麥中所含酸的百分比，酸度以乳酸計。計算如式（1）所示：

式中：X為樣品總酸質(zhì)量分數(shù)/%；c為氫氧化鈉濃度/（mol/L）；V為滴定消耗氫氧化鈉體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g；K為換算系數(shù)，即1 mmol氫氧化鈉相當(dāng)于主要酸的克數(shù)（以乳酸計，折算系數(shù)為0.09）。

1.3.4 燕麥蛋白水解情況的測定

1.3.4.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）[26-27]

準(zhǔn)確稱取40 mg燕麥凍干粉，加入1 mL 0.1 mol/L Tris-HCl pH 8.8緩沖液，顛倒混勻1 h，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min，收集蛋白上清液，凍存于-18 ℃待測。將提取液與2×上樣緩沖液體積比1∶1混合，在沸水浴中保溫3～5 min，取出待用。電泳時，濃縮膠和分離膠質(zhì)量分數(shù)分別為4%和15%，上樣量為20 μL，先調(diào)節(jié)電壓為60 V，當(dāng)樣品進入分離膠后再調(diào)節(jié)電壓為120 V，溴酚藍移至底部不足0.5 cm時切斷電源，停止電泳。

1.3.4.2 可溶性蛋白含量的測定[25,28]

采用考馬斯亮藍法（Bradford）測定。準(zhǔn)確稱取200 mg燕麥凍干粉，加入10 mL pH 9.0硼酸-氫氧化鈉緩沖液，在28 ℃搖床中混勻1 h，在4 ℃、8 000 r/min條件下離心15 min，取上清液定容至10 mL，凍存于-18 ℃待測。1 mL樣液與5 mL考馬斯亮藍染色液混勻，室溫反應(yīng)5 min后，測定595 nm波長處吸光度?？扇苄缘鞍缀坑门Ｑ灏椎鞍桩?dāng)量表示，以蒸餾水代替樣品反應(yīng)，作為空白對照，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（0～140 μg/mL）的線性回歸方程為y=0.006 1x＋0.027 3（R2=0.996 9）。

1.3.4.3 多肽含量的測定[29-31]

采用OPA法測定。將2 mL上述蛋白溶液轉(zhuǎn)移至截留分子質(zhì)量為10 kDa的Millipore超濾管中，在4 ℃、3 000 r/min條件下離心30 min，收集蛋白滲透液，凍存于-18 ℃待測。用150 mL雙蒸水徹底溶解200 mg SDS和7.62 g四硼酸鈉，用4 mL乙醇溶解160 mg OPA，二者混合并加入176 mg DTT和400 μL β-巰基乙醇，定容至200 mL為OPA反應(yīng)試劑（避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用）。吸取50 μL樣液與2 mL OPA反應(yīng)試劑混勻，室溫下精確反應(yīng)2 min，測定340 nm波長處吸光度。多肽含量用胰酪蛋白胨當(dāng)量表示，以蒸餾水代替樣品反應(yīng)，作為空白對照，胰酪蛋白胨標(biāo)準(zhǔn)溶液（0～20 mg/mL）的線性回歸方程為y=0.065 0x-0.023 2（R2=0.997 5）。

1.3.5 燕麥蛋白營養(yǎng)價值的評價1.3.5.1 氨基酸組成的測定[32]

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》測定。氨基酸分析儀條件：分離柱為鈉離子高效水解液分析柱；茚三酮流速為25 mL/h；緩沖液流速為35 mL/h；反應(yīng)溫度為135 ℃；檢測波長為440 nm和570 nm；進樣量為20 μL。

1.3.5.2 氨基酸評分（amino acid score，AAS）計算[33]

式中：m*EAA為被測蛋白質(zhì)中某一必需氨基酸含量/（mg/g）；m**EAA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中同一必需氨基酸含量/（mg/g）；以FAO/WHO推薦模式為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3.5.3 必需氨基酸指數(shù)（essential amino acid index，EAAI）測定[34]

式中：Lysp為樣品蛋白質(zhì)中賴氨酸含量/（mg/g）；Lyss為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中賴氨酸含量/（mg/g）；其他依此類推，以FAO/WHO推薦模式為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；n為比較的氨基酸種類。

1.3.5.4 生物價（biological value，BV）計算[35]

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實驗所得，結(jié)果表示為 ±s。應(yīng)用SPSS 17.0軟件對結(jié)果進行顯著性和相關(guān)性分析，采用Origin 8.5軟件作圖，運用Quantity One 4.62軟件分析蛋白SDS-PAGE圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌和米根霉在燕麥固態(tài)基質(zhì)中的生長情況

2.1.1 植物乳桿菌單獨發(fā)酵燕麥分析

圖1 發(fā)酵時間對燕麥基質(zhì)中乳酸菌活菌數(shù)和pH值的影響Fig. 1 Effects of fermentation time on viable Lactobacillus number and pH value

以燕麥為基質(zhì)，接種植物乳桿菌70810進行固態(tài)發(fā)酵，如圖1所示，在發(fā)酵過程中，乳酸菌活菌數(shù)呈先緩慢上升再快速下降的趨勢，發(fā)酵至72 h由（7.34±0.05）（lg（CFU/g））增加至（7.90±0.06）（lg（CFU/g））。發(fā)酵前期，微生物繁殖相對較快，燕麥pH值顯著下降，隨著其代謝活動的逐漸減弱，pH值變化趨于平穩(wěn)，最終僅由5.46±0.01降至4.79±0.03。由于燕麥全谷物種皮較厚，乳酸菌不易進入，以及乳酸菌酶系發(fā)達程度較低，燕麥中的大分子營養(yǎng)物質(zhì)難以被利用。前期，微生物生長主要利用蒸煮后燕麥的糊化淀粉及部分自溶菌體蛋白，后期由于營養(yǎng)不足則表現(xiàn)出活菌數(shù)顯著下降、pH值變化緩慢的結(jié)果。

2.1.2 植物乳桿菌和米根霉共同發(fā)酵燕麥分析

圖2反映了植物乳桿菌70810和米根霉共同發(fā)酵燕麥全谷物的基本情況，隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸菌活菌數(shù)顯著增加，在72 h達到最大值，比70810單獨發(fā)酵時提高了7.14%，分別為（7.90±0.06）（lg（CFU/g））和（8.46±0.04）（lg（CFU/g）），由此可見，米根霉在一定程度上提高了乳酸菌在固態(tài)燕麥基質(zhì)中的生長能力。麥角固醇是絲狀真菌細胞膜的主要成分，其含量可以直接表征米根霉的生長情況[36]，結(jié)果表明，米根霉在發(fā)酵過程中持續(xù)合成麥角固醇，72 h含量由（5.59±2.11）μg/g顯著增加至（137.04±6.13）μg/g，生長狀況十分良好。根據(jù)相關(guān)報道，米根霉酶系發(fā)達，能夠分泌大量的糖化酶、液化酶、蛋白酶和肽酶，使大分子淀粉分解成糊精、低聚糖和葡萄糖等小分子物質(zhì)，蛋白質(zhì)和多肽水解生成小肽和氨基酸[37]，提高了底物營養(yǎng)成分的吸收利用效率。因此，在共同發(fā)酵體系下，燕麥全谷物能夠釋放更多養(yǎng)分，為多菌種生長提供充足的碳、氮源，使乳酸菌和米根霉均能生長良好。

圖2 發(fā)酵時間對燕麥基質(zhì)中乳酸菌活菌數(shù)、麥角固醇含量、pH值和總酸含量的影響Fig. 2 Effect of fermentation time on viable Lactobacillus number,ergosterol content, pH and total acidity

隨著微生物繁殖和代謝產(chǎn)物的積累，燕麥全谷物pH值和總酸含量也發(fā)生明顯變化，一定程度上反映了微生物代謝活動的綜合情況。例如，乳酸菌能夠代謝碳水化合物，并將其轉(zhuǎn)化為乳酸[38]；米根霉獨特的發(fā)酵雙邊性使其在糖化底物中碳水化合物的同時，還能生成L-乳酸、富馬酸等有機酸[39]，使環(huán)境中的pH值降低、總酸含量增加。如圖2所示，0～72 h燕麥的pH值顯著下降，總酸質(zhì)量分數(shù)顯著上升，在72 h分別達到3.74±0.04和（1.08±0.08）%，說明植物乳桿菌70810和米根霉共同發(fā)酵過程中，燕麥基質(zhì)中的微生物生長十分旺盛。經(jīng)過發(fā)酵，較低的pH值、較高的總酸含量還能抑制腐敗菌生長，延長產(chǎn)品保質(zhì)期，使燕麥的口感更加豐富。

2.2 燕麥蛋白在多菌種固態(tài)發(fā)酵過程中的水解情況

2.2.1 蛋白SDS-PAGE分析

通過SDS-PAGE技術(shù)，對分子質(zhì)量在12～120 kDa的燕麥蛋白進行分析，比較了0～72 h發(fā)酵過程中不同蛋白亞基的變化情況。從圖3a可以看出，燕麥蛋白的分子質(zhì)量主要分布在12～60 kDa之間，泳道中有12 條可見條帶，分別為A（54.91 kDa）、B（35.08 kDa）、C（33.52 kDa）、D（32.75 kDa）、E（31.89 kDa）、F（29.83 kDa）、G（27.76 kDa）、H（23.83 kDa）、I（22.57 kDa）、I（21.18 kDa）、K（13.38 kDa）和L（12.78 kDa），其中在27.76～35.08 kDa（包括6個亞基）和21.18～23.83 kDa（包括3個亞基）兩個區(qū)域較為集中。由于微生物酶系的作用，不同時間下燕麥蛋白亞基的數(shù)量和分子大小也有所區(qū)別[40-42]，例如，條帶F、G、J、K和L在0～48 h逐漸增加，條帶A、B、C、D、E、H和I則快速減少，48 h之后，已水解的蛋白亞基基本消失，生成的亞基無明顯變化。整體規(guī)律表現(xiàn)為：1）發(fā)酵時間越長，燕麥的蛋白亞基數(shù)目越少，分子質(zhì)量越低；2）發(fā)酵前期，大分子亞基被大量水解，發(fā)酵中期和后期，小分子亞基逐漸生成；3）發(fā)酵至48 h時，在植物乳桿菌70810和米根霉的共同作用下，燕麥蛋白水解程度接近于完全，SDS-PAGE圖中條帶分布無明顯改變。

圖3 發(fā)酵過程中燕麥蛋白SDS-PAGE圖（a）和不同分子質(zhì)量蛋白的降解情況（b）Fig. 3 SDS-PAGE patterns and degradation of oat protein with different molecular masses during fermentation

為進一步討論燕麥蛋白在不同微生物共同作用下的水解情況，選擇Quantity One凝膠分析軟件定量分析圖3a中的蛋白條帶光密度值，以0 h條帶作為對照，分別計算不同發(fā)酵時間下（即不同泳道中）各蛋白條帶光密度的變化率。變化率為負值，則表明該處條帶的光密度值降低，蛋白亞基發(fā)生降解；若變化率為正值，光密度值升高，此處蛋白亞基有所生成。如圖3b所示，發(fā)酵24～72 h過程中，條帶B、C、D、H、I 處亞基逐步被水解，72 h的降解程度分別為90.30%、91.55%、76.66%、50.19%和30.63%，表明植物乳桿菌70810和米根霉的混合蛋白酶系對燕麥蛋白的水解作用十分明顯，尤其對B和C有較強的特異性。0～24 h，條帶E和J處亞基明顯生成，最大生成率為192.35%和49.81%。條帶F、G、K、L對應(yīng)的4個小分子亞基在0～48 h快速生成，除L外的其他亞基均在48 h 達到最大生成率，分別為373.70%、278.93%和247.97%。多菌種發(fā)酵后，燕麥蛋白有效水解，并在48 h時基本完全，發(fā)酵后的燕麥蛋白分子質(zhì)量較小，更有利于人體消化吸收，可作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的重要來源[43]。

2.2.2 可溶性蛋白及多肽的變化情況

圖4 不同發(fā)酵時間下燕麥可溶性蛋白含量和小于10 kDa肽含量的變化情況Fig. 4 Changes in contents of soluble protein and peptide lower than 10 kDa during oat fermentation

由圖4可知，燕麥蛋白被分解成了氨基酸、多肽和一些有一定空間結(jié)構(gòu)但分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)，增加了蛋白質(zhì)的溶解性，為微生物持續(xù)、穩(wěn)定的生長提供了充足的氮源。進一步觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前期，由于全谷物固態(tài)發(fā)酵保留其種皮，微生物難以直接利用氮源，蛋白水解十分緩慢；48 h之后，隨著微生物生長達到一定數(shù)量級，生長維持所消耗的小分子氮水平與微生物酶解產(chǎn)生的氮水平基本一致，蛋白溶解性和小分子蛋白含量均趨于穩(wěn)定。12～48 h期間，燕麥的可溶性蛋白含量和小于10 kDa肽含量分別由（7.66±0.35）mg/g和（329.65±0.38）mg/g提高至（11.19±0.25）mg/g和（356.15±1.69）mg/g，發(fā)酵至72 h，可溶性蛋白含量為（11.58±0.16）mg/g，分子質(zhì)量小于10 kDa肽含量為（366.51±1.30）mg/g。蛋白水解程度顯著增加，這與SDS-PAGE的分析結(jié)果相一致。該結(jié)果主要是由微生物酶系作用和以下兩方面原因所造成：1）燕麥pH值大幅下降，谷物內(nèi)源性蛋白酶被激活，大分子蛋白共價鍵斷裂，小分子蛋白增加[44]；2）米根霉分泌大量糖化酶，在水解淀粉的同時減弱了其與蛋白質(zhì)的相互作用力，釋放出更多結(jié)合態(tài)的燕麥蛋白[45]。根據(jù)報道，短肽類物質(zhì)如游離氨基酸的消化吸收性更強，具有一定分子質(zhì)量和空間結(jié)構(gòu)的多肽則可以發(fā)揮不同的生理活性功能，如抗菌、抗癌、抗高血壓和調(diào)節(jié)免疫等，因此，植物乳桿菌和米根霉共同發(fā)酵大大提高了燕麥的食用價值[46]。

2.3 多菌種固態(tài)發(fā)酵對燕麥蛋白營養(yǎng)價值的影響

2.3.1 燕麥蛋白必需氨基酸組成的變化

根據(jù)上述水解情況，發(fā)酵至48 h時，燕麥蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布、溶解性和小于10 kDa肽含量基本穩(wěn)定，因此可選擇0 h和48 h的燕麥蛋白，對其營養(yǎng)價值相關(guān)指標(biāo)做后續(xù)評價。氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位，它的組分含量決定了不同蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、特性和營養(yǎng)價值。通過鹽酸水解，經(jīng)離子交換柱分離并與茚三酮溶液顯色反應(yīng)，本實驗測定了天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等17種氨基酸含量，圖5為不同氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分析圖。由表1可見，植物乳桿菌和米根霉共同發(fā)酵后，燕麥蛋白必需氨基酸組成發(fā)生明顯變化，其中異亮氨酸、蘇氨酸和賴氨酸質(zhì)量分數(shù)顯著增加，分別從（2.76±0.02）%、（3.34±0.01）%和（3.44±0.09）%升高至（2.82±0.01）%、（3.51±0.10）%和（3.98±0.03）%；非必需氨基酸中甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸和酪氨酸含量顯著增加，發(fā)酵至48 h質(zhì)量分數(shù)分別為（3.99±0.01）%、（5.05±0.03）%、（3.74±0.01）%和（2.50±0.09）%。必需氨基酸多指人體無法自身合成或合成速度不能滿足機體需要，必須從食物中攝取的一類氨基酸，而賴氨酸是第一限制性氨基酸，能夠有效促進嬰幼兒生長發(fā)育，發(fā)酵后的燕麥蛋白中賴氨酸比例明顯優(yōu)于大米、小麥、玉米等其他谷物[47]。

圖5 不同氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC出峰圖Fig. 5 HPLC analysis profiles of different amino acid standards

注：*.同種氨基酸差異顯著（P＜0.05）；**.同種氨基酸差異極顯著（P＜0.01）。下同。

2.3.2 燕麥蛋白營養(yǎng)指標(biāo)的變化

表2 發(fā)酵前后燕麥蛋白的主要氨基酸AASTable 2 Amino acid scores of oat protein before and after fermentation

表3 發(fā)酵前后燕麥蛋白的EAAI和BVTable 3 Essential amino acid index and biological value of oat protein before and after fermentation

表2以FAO/WHO推薦模式作為參考蛋白，計算得出發(fā)酵前后燕麥蛋白質(zhì)的主要AAS，AAS值越接近100表明氨基酸組成越接近推薦模式，蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值越高[48]。由表2可見，異亮氨酸、蘇氨酸和賴氨酸的AAS值在多菌種固態(tài)發(fā)酵后顯著提高，分別達到70.50±0.25、87.80±2.30和72.32±0.55；纈氨酸、蛋氨酸＋胱氨酸的AAS值呈下降趨勢，為86.86±0.60和124.30±0.57；亮氨酸、苯丙氨酸＋酪氨酸的AAS值基本不受發(fā)酵影響，無顯著變化。

EAAI是評價食物中蛋白質(zhì)質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，考慮了蛋白質(zhì)所有必需氨基酸對于高價蛋白質(zhì)（一般為標(biāo)準(zhǔn)蛋白）必需氨基酸的比率，若EAAI值接近100，則樣品蛋白質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的必需氨基酸組成越接近，蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值越高[49]。而BV指的是食物中蛋白質(zhì)經(jīng)過消化吸收，能被機體利用的氮量占總吸收氮量的百分比率，通常作為衡量經(jīng)過消化吸收后蛋白質(zhì)可利用程度的重要指標(biāo)[50]。如表3所示，燕麥全谷物蛋白的EAAI值和BV在發(fā)酵之后顯著提高，48 h的EAAI值為75.63±0.10，BV為70.74±0.13。該結(jié)果與張慶等[35]的研究報道相一致，說明微生物發(fā)酵對于提高谷物蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值有十分重要的意義，發(fā)酵后的燕麥無論在蛋白含量還是氨基酸組成比例方面，均比發(fā)酵前的燕麥和其他谷物有明顯優(yōu)勢。

3 結(jié) 論

本實驗在燕麥全谷物基質(zhì)中加入植物乳桿菌70810和米根霉，通過多菌種固態(tài)發(fā)酵顯著提高了燕麥蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值。實驗結(jié)果表明，米根霉能夠促進乳酸菌在固態(tài)基質(zhì)中的生長能力，使原料在無需粉粹或酶解的情況下富集大量有益微生物，實現(xiàn)乳酸菌固態(tài)發(fā)酵全谷物的目的。經(jīng)過發(fā)酵，燕麥蛋白質(zhì)明顯降解，小分子亞基種類大大增加，發(fā)酵后的燕麥可溶性蛋白含量和10 kDa以下肽含量均高于發(fā)酵之前，氨基酸比例和AAS、EAAI、BV等指標(biāo)也得到明顯改善。綜上所述，本研究選用的加工方式可以充分挖掘燕麥的潛在價值，保留谷物全部營養(yǎng)素的同時，提高了燕麥蛋白質(zhì)的營養(yǎng)水平和生物活性，使發(fā)酵后的燕麥成為一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源，為開發(fā)益生菌燕麥?zhǔn)称泛吞厥馊巳荷攀逞a充劑提供了新的研究思路。