基于納米金/蔗糖酶構(gòu)建核酸適體傳感器檢測(cè)鹽酸多巴胺

姜利英，劉 帥，任林嬌，張 培，趙學(xué)偉，王延峰

臨床實(shí)踐中，多巴胺含量的檢測(cè)對(duì)神經(jīng)性食欲缺乏癥、阿爾茨海默病和帕金森癥等疾病的診斷和治療有重要作用[1-3]。但是多巴胺化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在空氣環(huán)境中易被氧化，故實(shí)際檢測(cè)中，一般以鹽酸多巴胺[4-5]（dopamine hydrochloride，DH）代替人體內(nèi)的多巴胺。目前檢測(cè)DH的方法主要有高效液相色譜法[6]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]、免疫分析法[8-9]。這些方法往往需要專業(yè)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，操作繁瑣且檢測(cè)成本較高。

核酸適體能與特定靶目標(biāo)進(jìn)行高特異性和強(qiáng)親和力結(jié)合，功能與抗體相似，并且憑借其較抗體更易合成、易修飾、易保存和高穩(wěn)定性的特點(diǎn)，被越來越多的用來制備核酸適體傳感器[10-13]。便攜式血糖儀[14-15]能夠?qū)ρ牵ㄆ咸烟牵┻M(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)量，并且具有體積小、成本低和操作簡單的特點(diǎn)，然而檢測(cè)目標(biāo)單一，限制了其應(yīng)用和發(fā)展?jié)摿?。核酸適體傳感器結(jié)合血糖儀用于檢測(cè)非糖靶目標(biāo)吸引了研究人員的興趣與關(guān)注，Yu Xiang等[16]利用蔗糖酶作為中介物質(zhì)，將被測(cè)物質(zhì)濃度與蔗糖酶的催化產(chǎn)物葡萄糖濃度相關(guān)聯(lián)，通過血糖儀檢測(cè)葡萄糖濃度實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA分子的檢測(cè)，目前已擴(kuò)展到大腸桿菌[17]、肌紅蛋白[18]、Cu2＋[19]等非糖物質(zhì)的檢測(cè)。

近年來，納米技術(shù)在分析和診斷領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，納米材料[20-22]（金屬納米材料、量子點(diǎn)、硅納米材料等）的合成及應(yīng)用取得了較大進(jìn)展。納米金由于小尺寸效應(yīng)[23-24]、催化活性[25-26]、易修飾等[27]獨(dú)特性質(zhì)，成為廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)，用于新型傳感系統(tǒng)的開發(fā)有助于構(gòu)建簡單、靈敏度高、選擇性好的納米金-適體傳感器[28-32]。

本實(shí)驗(yàn)基于納米金/蔗糖酶構(gòu)建核酸適體傳感器，利用納米金較大的比表面積固定蔗糖酶實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)信號(hào)的轉(zhuǎn)換與放大，基于核酸適體與靶目標(biāo)強(qiáng)親和力結(jié)合的競爭機(jī)制，結(jié)合血糖儀實(shí)現(xiàn)了對(duì)DH的檢測(cè)，具有操作簡便、檢測(cè)成本低、特異性好的特點(diǎn)。通過選擇合適的核酸適體容易實(shí)現(xiàn)對(duì)致病菌、抗生素等的特異靈敏檢測(cè)，在醫(yī)療衛(wèi)生和食品安全領(lǐng)域具有較大的研究價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膠體金溶液（20 nm）、DH、蔗糖酶 南京諾唯贊生物科技有限公司；去甲腎上腺素、尿酸和引物上海生工生物工程有限公司；其中引物：DNA1（DH核酸適體）：5’-GTC TCT GTG TGC GCC AGA GAA CAC TGG GGC AGA TAT GGG CCA GCA CAG AAT GAG GCC C-(CH2)3-SH-3’；DNA2（DNA1的互補(bǔ)鏈）：5’-GTG TTC TCT GGC GCA CAC AGA GAC ACA GAA TGA GGC CC-(CH2)3-SH-3’；實(shí)驗(yàn)用水是電阻為18.2 MΩ的超純水；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.3）；Tris-醋酸緩沖液（0.01 mol/L，pH 5.2）；蔗糖溶液（0.5 mol/L）和蔗糖酶溶液（1 mg/mL），用PBS做溶劑配制；三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽（tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP）溶液（0.01 mol/L）和巰基乙醇溶液（1 mmol/L），用Tris-醋酸緩沖液做溶劑配制。

1.2 儀器與設(shè)備

GL-16II型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；HZQ-F200型振蕩培養(yǎng)箱 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；07HWS-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 杭州儀表電機(jī)有限公司；電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；羅氏血糖儀 強(qiáng)生醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 傳感器的構(gòu)造及檢測(cè)原理

核酸適體傳感器結(jié)合血糖儀檢測(cè)DH的原理如圖1所示。首先將DNA1（DH核酸適體）固定于修飾有納米金的96微孔板上做捕獲探針，再加入納米金-蔗糖酶-DNA2檢測(cè)探針，兩者通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。未加入DH時(shí)，檢測(cè)探針結(jié)合在微孔板上；加入DH，由于核酸適體與DH的特異性結(jié)合力大于堿基互補(bǔ)配對(duì)力，所以檢測(cè)探針脫離微孔板進(jìn)入上清液中，其脫離量與加入的DH量呈正相關(guān)。取出上清液加入蔗糖，蔗糖被檢測(cè)探針上的蔗糖酶水解為葡萄糖，葡萄糖的量與檢測(cè)探針的量呈正相關(guān)，故建立起葡萄糖與DH之間的線性關(guān)系，并通過血糖儀檢測(cè)葡萄糖濃度間接檢測(cè)DH濃度。

圖1 基于血糖儀檢測(cè)的DH核酸適體傳感器Fig. 1 Schematic demonstration of dopamine hydrochloride aptasensor based on the detection of glucometer

1.3.2 捕獲探針DNA1的固定

96微孔板作為DNA1的固定平臺(tái)，第1步進(jìn)行納米金修飾，第2步進(jìn)行DNA1固定。第1步，微孔中加50 μL 16 mol/L的濃硝酸處理2 h，純水沖洗3 次，再加入100 μL膠體金溶液，37 ℃培養(yǎng)24 h，純水沖洗3 次，其中微孔板的材料為聚苯乙烯，具有疏水性，與同為疏水性的納米金通過疏水作用力結(jié)合[33]，而進(jìn)行濃硝酸處理，使表面被腐蝕，增大了納米金的固定量。第2步，DNA1用TCEP稀釋至0.5 μmol/L，活化1 h，取100 μL加入微孔中，DNA1通過S-Au鍵結(jié)合于納米金，37 ℃培養(yǎng)16 h，再加入50 μL巰基乙醇，37 ℃封閉1 h，最后用50 μL的PBS沖洗3 次，至此完成捕獲探針DNA1的固定。

1.3.3 納米金-蔗糖酶-DNA2檢測(cè)探針的制備

首先將500 μL蔗糖酶與1 mL膠體金混合，4 ℃培養(yǎng)6 h，再加10 μL 20 μmol/L DNA2（PBS作溶劑），37 ℃振蕩16 h（50 r/min），混合液12 000 r/min離心15 min，離心底物用純水沖洗3 次，洗掉未與納米金結(jié)合的蔗糖酶和DNA2，最后離心底物加入1 mL PBS溶解，4 ℃保存?zhèn)溆茫链送瓿杉{米金-蔗糖酶-DNA2檢測(cè)探針的制備。

1.3.4 DH的檢測(cè)

將100 μL檢測(cè)探針加入到固定有DNA1的微孔中，檢測(cè)探針與捕獲探針通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，37 ℃培養(yǎng)2 h，用PBS沖洗3 次（沖洗掉未結(jié)合的檢測(cè)探針）。加入100 μL不同濃度DH溶液（PBS做溶劑），37 ℃培養(yǎng)2 h，取出微孔板的上清液，并用10 μL的PBS沖洗2 次，將上清液和沖洗液加入離心管，再加入30 μL的蔗糖溶液，37 ℃培養(yǎng)30 min，取2 μL最終培養(yǎng)液用血糖儀檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

由于實(shí)驗(yàn)過程涉及到生化反應(yīng)，為了使反應(yīng)進(jìn)行充分，并且在最短的時(shí)間內(nèi)獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.1 DH孵育時(shí)間優(yōu)化

圖2 DH孵育時(shí)間對(duì)血糖儀信號(hào)強(qiáng)度的影響Fig. 2 Influence of dopamine hydrochloride incubation time on the glucose meter signal intensity

選擇1 mmol/L和5 mmol/L DH，在不同孵育時(shí)間下使用血糖儀檢測(cè)最終葡萄糖濃度，對(duì)DH孵育時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，如圖2所示。30 min之前，信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間延長而增強(qiáng)，此時(shí)DH與核酸適體的競爭結(jié)合使檢測(cè)探針脫離捕獲探針并催化蔗糖為葡萄糖，檢測(cè)探針的脫離量隨DH孵育時(shí)間的延長而增多；30 min之后，信號(hào)強(qiáng)度逐漸趨于穩(wěn)定，此時(shí)DH與核酸適體競爭結(jié)合完成，檢測(cè)探針的脫離量不變，其與多巴胺的孵育時(shí)間無關(guān)，只與DH的加入量有關(guān)。故DH的孵育時(shí)間最短應(yīng)選擇30 min。

2.1.2 蔗糖酶的催化反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

選擇1 mmol/L和5 mmol/L DH，在不同催化時(shí)間下使用血糖儀檢測(cè)最終葡萄糖濃度，對(duì)蔗糖酶催化時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖3所示。120 min之前，信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間的延長而增強(qiáng)，此時(shí)檢測(cè)探針上的蔗糖酶催化蔗糖生成葡萄糖，葡萄糖的生成量與反應(yīng)時(shí)間有關(guān)；120 min之后，信號(hào)強(qiáng)度逐漸趨于穩(wěn)定，此時(shí)蔗糖酶完成催化，葡萄糖的生成量與反應(yīng)時(shí)間無關(guān)，只與蔗糖酶的量（檢測(cè)探針的量）有關(guān)。故蔗糖酶催化反應(yīng)時(shí)間最短應(yīng)選擇120 min。

圖3 酶的催化反應(yīng)時(shí)間對(duì)血糖儀信號(hào)強(qiáng)度的影響Fig. 3 The influence of enzymatic reaction times on the signal intensity of glucose meter

2.2 傳感器的線性檢測(cè)范圍

在上述實(shí)驗(yàn)條件下，加入不同濃度DH（0.45、0.70、1.00、1.50、2.00、2.50、4.00、5.00、10.00 mmol/L）進(jìn)行檢測(cè)，血糖儀的信號(hào)強(qiáng)度與DH濃度在0.45～10 mmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系：Y=0.343 6＋1.168 4X（其中Y為血糖儀信號(hào)強(qiáng)度，X為DH濃度），相關(guān)系數(shù)R為0.997，檢出限（樣品中目標(biāo)分析物能被準(zhǔn)確檢出的最小量）為0.45 mmol/L。

2.3 傳感器的準(zhǔn)確性與精確性測(cè)定結(jié)果

使用血糖儀對(duì)DH標(biāo)準(zhǔn)曲線的高中低3 個(gè)水平（8.0、3.0、0.8 mmol/L）標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行測(cè)定（樣本數(shù)n=5），最終的葡萄糖濃度如表1所示。將葡萄糖濃度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算DH濃度，結(jié)果如表2所示。8.0、3.0、0.8 mmol/L的DH標(biāo)準(zhǔn)液使用該傳感器的檢測(cè)值分別為7.940、2.958、0.838 mmol/L，標(biāo)準(zhǔn)差為0.071 8、0.040 2、0.040 2 mmol/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD）為0.9%、1.4%、4.8%。故該傳感器對(duì)DH檢測(cè)具有較好的準(zhǔn)確性和精確性，且對(duì)高濃度DH檢測(cè)的RSD較小。

表1 葡萄糖的測(cè)量結(jié)果Table 1 Results of glucose detection after adding different concentrations of dopamine hydrochloride

表2 DH的測(cè)量結(jié)果Table 2 Results of detection of different concentrations of dopamine hydrochloride

2.4 傳感器的特異性測(cè)定結(jié)果

選擇DH標(biāo)準(zhǔn)曲線上的一個(gè)濃度（0.45 mmol/L），在相同實(shí)驗(yàn)條件下，檢測(cè)同濃度的尿酸、去甲腎上腺素、Na＋、K＋溶液，結(jié)果如圖4所示。DH的血糖儀信號(hào)強(qiáng)度要明顯強(qiáng)于尿酸等干擾物的信號(hào)強(qiáng)度，且在實(shí)驗(yàn)全程中，采用保鮮膜對(duì)微孔板進(jìn)行物理封閉，減少非特異性背景信號(hào)，故該傳感器對(duì)DH檢測(cè)具有特異性。

圖4 DH檢測(cè)的特異性（0.45 mmol/L）Fig. 4 Specific detection of dopamine hydrochloride (0.45 mmol/L)

3 結(jié) 論

利用核酸適體與靶目標(biāo)的親和力強(qiáng)于核酸適體與互補(bǔ)鏈間的堿基力原理，基于納米金/蔗糖酶構(gòu)建競爭型核酸適體傳感器，并結(jié)合血糖儀實(shí)現(xiàn)對(duì)DH的檢測(cè)。結(jié)果表明，靶目標(biāo)孵育時(shí)間和蔗糖酶催化時(shí)間分別為30 min和120 min；DH的線性檢測(cè)范圍為0.45～10 mmol/L，相關(guān)系數(shù)為0.997，檢出限為0.45 mmol/L。對(duì)該傳感器的準(zhǔn)確性和特異性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，表明該方法具有選擇性好、穩(wěn)定性高、操作簡單的特點(diǎn)，并在環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全的即時(shí)檢測(cè)方面具有應(yīng)用前景。目前該方法的檢測(cè)范圍還具有一定局限性，這是由血糖儀自身制備工藝所限制，未來可以通過實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化以及采取合理的信號(hào)放大等方法來改善。