方廷兵 嚴浩 徐志蓉 馮梅 王增智

血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為新生血管、血管通透性密切關(guān)聯(lián)的血管生成因子,可通過產(chǎn)生一些列的病變(新生血管、纖維組織增生、出血)影響或者破壞眼內(nèi)結(jié)構(gòu)、功能, 從而產(chǎn)生角膜病、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等, 降低患者視力, 甚至引起失明。其中, 角膜病是常見的致盲疾病, 目前臨床對于該病的治療, 有靶向生物制劑、角膜移植等, 角膜移植常伴隨不同程度的免疫排斥反應, 由于手術(shù)、炎癥等內(nèi)外界因素可刺激患者角膜血管和淋巴管生成, 破壞前房免疫屏障, 從而對角膜植片產(chǎn)生免疫排斥［1］。VEGF-C拮抗劑可有效抑制角膜新生血管的生成,從而降低排斥反應程度, 提高角膜移植成功率。本次實驗將以大鼠為模型, 進一步驗證VEGF-C拮抗劑(貝伐單抗)對大鼠角膜新生血管的抑制效果, 以及對角膜移植物成功的影響, 為其臨床的應用提供指導。報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SPF級Wistar、SD大鼠各48只, 體質(zhì)量為180～220 g, 雌雄各半, 均購自上海斯萊克實驗動物有限公司,生產(chǎn)許可證SCXK(滬)2015-0018。所有實驗操作遵守動物倫理委員會發(fā)布的倫理及管理指南。實驗前使用裂隙燈檢查大鼠雙眼, 排除新生血管、角膜瘢痕等疾病。

1.2 實驗方法

1.2.1 異種角膜移植 以SD大鼠為角膜供體, Wistar大鼠為角膜受體, 對大鼠角膜右眼行穿透性移植, 具體操作：①散瞳：大鼠置于避光環(huán)境中, 并于術(shù)前約20 min采用復方托吡卡胺滴眼液點術(shù)眼3次, 以散開瞳孔。②麻醉消毒：腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉進行麻醉, 安爾碘消毒術(shù)眼周圍皮膚及毛發(fā),并用生理鹽水沖洗大鼠結(jié)膜囊。③穿透性角膜移植術(shù)：在40倍放大的顯微鏡視野下選擇直徑3.5 mm的環(huán)鉆, 以便角膜中央形成印跡, 用1 ml注射器針頭適宜角度穿透角膜, 并注入玻璃酸鈉, 然后沿環(huán)鉆印跡剪下角膜植片, 置于0.9%生理鹽水中。然后在Wistar大鼠角膜中制備植床, 使用尼龍線間斷縫合約10針以固定植床與角膜植片, 手術(shù)期間注射玻璃酸鈉, 術(shù)后吸除前房用于維持前房深度玻璃酸鈉, 并注射無菌空氣形成前房, 涂上氧氟沙星軟膏, 縫合眼瞼, 24 h后拆除眼瞼邊緣縫線。術(shù)后30 d內(nèi)定期用妥布霉素滴眼液進行抗感染, 4次/d, 1滴/次。

1.2.2 動物給藥 Wistar大鼠隨機分為低劑量組(給予貝伐單抗5 mg /kg)、中劑量組(給予貝伐單抗10 mg /kg)、高劑量組(給予貝伐單抗15 mg /kg)和對照組(于尾靜脈注射等體積生理鹽水), 每組12只。異種角膜移植成功后, 術(shù)后每周尾靜脈近似體積注射給藥1次后, 連續(xù)給藥4周, 于第28天觀察VEGF-C的表達量, 角膜新生血管最長長度、新生血管面積, 并統(tǒng)計角膜移植物成功率。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定VEGF-C的表達量。

1.3 觀察指標及判定標準 比較四組大鼠角膜新生血管面積、角膜新生血管最長長度、VEGF-C平均光密度值及角膜移植物成功率。其中角膜移植物效果參照Larkin法對各組角膜植片進行評估, 即分別對角膜不透明度、角膜水腫、角膜新血管形成情況進行評分, 若三個指標總評分＞5分, 則表明發(fā)生了角膜移植排斥反應, 移植失敗。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示, 采用t檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四組角膜新生血管最長長度、新生血管面積比較低劑量組、中劑量組、高劑量組角膜新生血管最長長度、新生血管面積均低于對照組, 且高劑量組新生血管面積為(8.63±0.74)mm2, 顯著低于低劑量組的(12.15±1.37)mm2, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 四組VEGF-C平均光密度值及移植成功率比較 低劑量組、中劑量組、高劑量組VEGF-C平均光密度值均顯著低于對照組, 且高劑量組的VEGF-C平均光密度值顯著低于低劑量組, 高劑量組、中劑量組移植成功率顯著高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表1 四組角膜新生血管最長長度、新生血管面積比較( ±s)

表1 四組角膜新生血管最長長度、新生血管面積比較( ±s)

注：與對照組比較, aP＜0.05；與高劑量組比較, bP＜0.05

低劑量組 12 1.43±0.24ab 12.15±1.37ab中劑量組 12 1.02±0.19a 9.83±0.96a高劑量組 12 0.83±0.14a 8.63±0.74a對照組 12 2.12±0.26 15.35±1.42

表2 四組VEGF-C平均光密度值及移植成功率比較［ ±s, %(只)］

表2 四組VEGF-C平均光密度值及移植成功率比較［ ±s, %(只)］

注：與對照組比較, aP＜0.05；與高劑量組比較, bP＜0.05

低劑量組 12 25.43±8.04ab 66.67(8)中劑量組 12 21.02±7.59a 83.33(10)a高劑量組 12 17.83±7.14a 91.67(11)a對照組 12 35.12±9.26 50.00(6)

3 討論

眼球作為新生血管性疾病高發(fā)器官, 為保證眼球屈光系統(tǒng)的透明性, 正常的角膜不存在血管系統(tǒng)［2-5］。角膜的病變或者其他原因刺激角膜血管的形成, 導致角膜透明性、視力降低, 甚至引起患者失明。血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、成纖維細胞生長因子等各種生長因子在誘導新生血管過程中起重要作用, 其中血管內(nèi)皮生長因子作用更為顯著, 主要通過促進血管內(nèi)皮有絲分裂而誘導血管新生［6-10］。目前,以靶向生物制劑為主的血管內(nèi)皮生長因子拮抗劑在治療血管新生、血管通透性增加為主的眼內(nèi)疾病中逐漸顯現(xiàn)出獨特的療效優(yōu)勢, 而且還能有效降低角膜移植排斥反應, 促進患者預后, 提高手術(shù)成功率和視力。

本次研究顯示, 低劑量組、中劑量組、高劑量組角膜新生血管最長長度、新生血管面積均低于對照組, 且高劑量組新生血管面積顯著低于低劑量組, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。低劑量組、中劑量組、高劑量組VEGF-C平均光密度值均顯著低于對照組, 且高劑量組的VEGF-C平均光密度值顯著低于低劑量組, 高劑量組、中劑量組移植成功率顯著高于對照組, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明VEGF-C拮抗劑可有效抑制VEGF-C的表達、大鼠角膜新生血管, 阻礙大鼠角膜新生血管的生長, 且隨著VEGF-C拮抗劑劑量的增加, 抑制效率呈現(xiàn)一定程度的增加趨勢, 從而降低新生血管對角膜的侵襲和角膜移植排斥反應, 提高移植成功率。

綜上所述, VEGF-C拮抗劑對大鼠角膜新生血管的抑制效果顯著, 可有效降低降低角膜移植排斥反應, 提高移植成功率。