韓彥卿，鄭潔，武彩娟，元香梅，韓淵懷*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究所，山西 太谷 030801)

谷子(Setariaitalica(L.) P. Beauv.)，去殼后稱為小米，是起源于我國(guó)黃河流域的古老作物，由青狗尾草馴化而來(lái)，現(xiàn)廣泛栽培于歐亞大陸的溫帶和熱帶地區(qū)[1]。2015年我國(guó)谷子栽培面積1 200萬(wàn)畝，占世界80%，總產(chǎn)量占90%，位居雜糧作物之首。然而，近幾年來(lái)，谷子各種病害發(fā)生和流行，嚴(yán)重降低了谷子的產(chǎn)量和品質(zhì)。例如，谷子白發(fā)病在大發(fā)生年份可造成產(chǎn)量減產(chǎn)70%以上[2]。由此可見(jiàn)，選育抗病高產(chǎn)優(yōu)良谷子品種是解決谷子免受病害侵襲的首選[3]?；诒狙芯渴姨镩g多年調(diào)查統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，晉谷21雖然品質(zhì)優(yōu)良，但田間表現(xiàn)極易感白發(fā)病。然而其親本晉汾52在田間表現(xiàn)為抗病。這為我們研究2個(gè)品種間的抗感分子機(jī)制提供了非常好的研究材料。

隨著測(cè)序技術(shù)的突飛猛進(jìn)和發(fā)展，基因組重測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為發(fā)掘重要抗病相關(guān)基因的重要手段,已經(jīng)廣泛應(yīng)用到各個(gè)研究領(lǐng)域[4～6]。Jia等2013年對(duì)916份來(lái)自世界各地的谷子核心資源進(jìn)行了基因組重測(cè)序，分析獲得了200多萬(wàn)個(gè)SNP標(biāo)記和50萬(wàn)個(gè)插入缺失(InDel)的變異圖譜，為谷子的遺傳研究和抗病改良奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[7]。施陽(yáng)選用高抗白粉病片段代換系和高感的受體親本2個(gè)黃瓜品種進(jìn)行全基因組重測(cè)序，鑒定出了具有LRR結(jié)構(gòu)域的抗病基因，初步明確了黃瓜抗白粉病機(jī)制[6]。本研究基于本實(shí)驗(yàn)室對(duì)晉谷52 和晉汾21全基因組重測(cè)序的基礎(chǔ)上，依據(jù)已鑒定NBS家族基因的SNP、InDel、CNV和SV位點(diǎn)，對(duì)NBS(核苷酸結(jié)合位點(diǎn))類(lèi)抗性基因進(jìn)行比較分析，篩選出6個(gè)突變位點(diǎn)較多，接著克隆差異較大的基因并測(cè)序分析，擬挖掘鑒定出導(dǎo)致晉谷21及其親本晉汾52抗病性差異的關(guān)鍵基因，旨在為谷子抗白發(fā)病分子輔助育種的培育提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用感病谷子品種晉谷21(JG21)，抗病谷子品種晉汾52(JF52)，對(duì)照品種豫谷1號(hào)(YG1)為試材。3個(gè)品種在溫室盆栽種植，谷子生長(zhǎng)條件模擬田間條件進(jìn)行，待谷子長(zhǎng)到3～5葉期時(shí)，取其幼嫩葉片，立即放入液氮速凍備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 谷子基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

2個(gè)品種基因組DNA的提取，采用北京康為世紀(jì) CW0553植物基因組提取試劑盒。所提取DNA的純度和質(zhì)量分別用Nanodrop2000檢測(cè)核酸濃度和純度，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司北京DNA合成部合成。PCR擴(kuò)增體系：采用50 μL的總反應(yīng)體系，其中2×GC PCR Buffer 25 μL，dNTP Mixture 8 μL，LA Taq酶0.5 μL，正反向引物各2 μL，模板DNA 2 μL ddH2O 10.5 μL。PCR程序設(shè)置為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 sec，退火溫度57～59 ℃不等1 min，72 ℃延伸1～4 min，72 ℃復(fù)延伸10 min，循環(huán)38次，4 ℃下保存(表1)。

1.2.2 NBS類(lèi)型基因比對(duì)分析

基于前期基因組重測(cè)序及測(cè)序拼接的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)室獲得了完整的NBS類(lèi)型基因序列。隨后利用序列比對(duì)軟件ClustalX對(duì)基因的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，尋找差異位點(diǎn)。并對(duì)含有突變位點(diǎn)進(jìn)行多次測(cè)序驗(yàn)證，確認(rèn)確實(shí)是由于輻射誘變導(dǎo)致的突變。蛋白特性分析采用Compute pI/Mw軟件，蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析用SOPMA和ScanProsite軟件，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分析分別軟件SignalP和ProtScale軟件。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 NBS類(lèi)基因的擴(kuò)增片段比較

利用上述設(shè)計(jì)的6對(duì)PCR引物，對(duì)3個(gè)不同谷子品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析擴(kuò)增條帶發(fā)現(xiàn)，4個(gè)基因Si028867、Si033294-1、Si033294-2和Si028382在3個(gè)谷子品種中均擴(kuò)增出單一條帶；對(duì)Si027260基因擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，在YG1號(hào)和JG21中擴(kuò)增出單一清晰的片段，JF52中沒(méi)有擴(kuò)增出條帶；而Si027455中均未擴(kuò)增出條帶。通過(guò)對(duì)3個(gè)品種的Si027260基因片段擴(kuò)增結(jié)果我們推測(cè)認(rèn)為，JF52未擴(kuò)增出條帶可能與其抗病性有關(guān)(圖1)。

2.2 NBS類(lèi)基因的核苷酸序列比對(duì)

基于擴(kuò)增結(jié)果，我們?cè)噲D分析3個(gè)品種中均擴(kuò)增出條帶的2個(gè)基因Si028867和Si033294在DNA序列上存在哪些堿基差異。經(jīng)核苷酸序列比對(duì)后，在Si028867基因中發(fā)現(xiàn)有5處單核苷酸突變(圖2A)，依次分別是T-C、G-A、C-G、T-C、A-C，其中包含3個(gè)位置的轉(zhuǎn)換和兩個(gè)位置的顛換，前3個(gè)位置的堿基突變發(fā)生在中間部位，位于1 000～1 500 bp之間，剩余的2處堿基突變發(fā)生末端；比對(duì)Si033294基因堿基序列發(fā)現(xiàn)，在2個(gè)品種中存在1處顛換，為T(mén)-G，該突變發(fā)生在基因的起始位置，此外，在基因的260 bp處有一個(gè)單堿基A的插入(圖2B)，其余部分序列未發(fā)現(xiàn)突變。

圖1 NBS類(lèi)基因PCR產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Electrophoretic map of PCR product of NBS gene

圖2 (2A, 2B)Si028867和Si033294兩個(gè)核苷酸序列同源比對(duì)Fig.2 (2A and 2B)Homologous comparison of two nucleotide sequence in Si028867 and Si033294A.Si028867；B.Si033294

2.3 NBS類(lèi)基因的的氨基酸序列分析

為明確JF52和JG21品種的2個(gè)NBS類(lèi)基因Si028867和Si033294差異，對(duì)其氨基酸序列同源比對(duì)分析。發(fā)現(xiàn)2個(gè)品種的Si028867蛋白中有4處氨基酸發(fā)生突變，分別在338、416、704和737位氨基酸處，依次是L-S、L-V、F-L和H-P；發(fā)現(xiàn) 2個(gè)品種的Si033294蛋白的氨基酸差異較大，同源性較低，推測(cè)可能是由于誘變而來(lái)的JG21可能由于該基因中核苷酸片段的插入導(dǎo)致(圖3A和3B)。

2.4 差異基因的蛋白結(jié)構(gòu)分析與預(yù)測(cè)

蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)特征分析發(fā)現(xiàn)，Si028867蛋白在2個(gè)品種中，無(wú)論是蛋白特性，還是二級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)均沒(méi)有明顯差異。而對(duì)Si033294的蛋白分析發(fā)現(xiàn)存在較大不同，其在JF52中蛋白為親水性，其二級(jí)結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)則卷曲，其次為α-螺旋；在JG21中的蛋白為疏水性，二級(jí)結(jié)構(gòu)則與其相反(表2)。對(duì)Si028867蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，JF52和JG21中蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)十分類(lèi)似。而Si033294蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，2個(gè)谷子品種之間的差異較大(圖4)。

2.5 抗性基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了明確抗性基因的遺傳進(jìn)化，我們將Si028867和Si033294基因編碼的氨基酸序列同水稻、高粱、小麥等禾本科植物蛋白序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)蛋白與所選植物蛋白序列的同源性較高，Si028867與比對(duì)的幾種植物序列的高度同源區(qū)段相對(duì)集中，而Si033294則比較分散，分布在幾個(gè)區(qū)段(圖5A和5B)。隨后，我們分別構(gòu)建了Si028867和Si033294進(jìn)化發(fā)育樹(shù)，谷子中Si028867蛋白與玉米的同源蛋白的親緣關(guān)系最近，其次是水稻和高粱；而谷子中Si033294蛋白與谷子和高粱的同源蛋白聚在一起，而其它物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖6)。

圖3 (3A，3B)Si028867和Si033 294兩個(gè)基因氨基酸序列同源比對(duì)Fig.3 (3A and 3B)Homologous comparison of two gene’s amino acid sequence in Si028867和Si033294A.Si028867；B.Si033294

蛋白Protein特性Characteristics二級(jí)結(jié)構(gòu)Secondary structure等電點(diǎn)pI分子量Mw(kD)信號(hào)肽Signal peptide親水性Hydrophilyα-螺旋/%α-helixβ-轉(zhuǎn)角/%β-turn無(wú)規(guī)則卷曲Randomcoil延伸鏈/%ExtendedJF52-Si0288677.0490.95None-0.25526 433.1749 6.1631 539.5716 821.11JG21-Si0288677.0392.24None-0.23127 433.8746 5.6932 339.9316 620.52JF52-Si0332949.44153.48None-0.23340 729.951 047.6558 442.9726 419.43JG21-Si0332949.80155.97None0.02654 440.241 188.7337 527.7431 523.30

圖4 Si028867和Si033294的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Tertiary structure prediction of Si028867and Si033294

3 討論與結(jié)論

植物中的NBS類(lèi)型基因是抗病基因家族中數(shù)目最龐大的一類(lèi)家族，抗病基因多成簇分布?？共』虻腖RR(富含亮氨酸的重復(fù)序列)位點(diǎn)可與病原菌相互識(shí)別。相關(guān)研究表明，LRR區(qū)域的核苷酸突變是導(dǎo)致抗感差異的重要因素[8～10]。Bryan 等研究發(fā)現(xiàn)在水稻NBS-LRR序列中單核苷酸變

異是導(dǎo)致水稻抗/感稻瘟病的原因所在[11]。

我們基于前期全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)分析獲得的NBS類(lèi)型抗病基因，進(jìn)一步克隆比對(duì)篩選，最后發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因：Si028867和Si033294。經(jīng)對(duì)晉谷21、晉汾52的Si028867和Si033294序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Si028867在LRR區(qū)域有5個(gè)核苷酸位點(diǎn)發(fā)生突變；對(duì)2個(gè)品種抗病基因的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，氨基酸在4個(gè)位置上發(fā)生了非同義突變：T-C、C-G、T-A、A-C。非同義突變很可能造成蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變化，蛋白構(gòu)象變化會(huì)直接影響抗病性表現(xiàn)。由此推測(cè)氨基酸的非同義突變可能是造成2個(gè)親緣關(guān)系較近的品種抗病和感病的原因。這一研究與施陽(yáng)的研究結(jié)果一致[6]。對(duì)另一個(gè)基因Si033294分析，其突變也由核苷酸的插入而導(dǎo)致非同義突變，由于該堿基的插入導(dǎo)致2個(gè)氨基酸序列發(fā)生了很大差異，這些突變是否導(dǎo)致2個(gè)谷子品種對(duì)病原菌抗性差異的主要原因有待于進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)對(duì)前期重測(cè)序結(jié)果分析篩選出的6個(gè)NBS類(lèi)型基因通過(guò)鑒定和比較分析，晉谷21和晉汾52兩個(gè)品種中發(fā)現(xiàn)Si028867和Si033294兩個(gè)基因的突變位點(diǎn)較多，主要表現(xiàn)為非同義突變，二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)中也存在蛋白特征和構(gòu)象變化，推測(cè)可能是2個(gè)品種間的抗病基因序列發(fā)生非同義突變，是造成抗病性差異的主要原因。本研究結(jié)果為研究谷子抗病分子機(jī)理和抗病分子輔助育種提供了理論指導(dǎo)。

圖6 (6A, 6B)Si028867和Si033294的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.6 (6A and 6B)Phylogenetic tree of protein in millet and other plant注：左圖為Si028867的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)；右圖為Si033294的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Note：Phylogenetic tree on the left map was Si028867; Phylogenetic tree on the right map was Si033294