辛燕花，張鐵丹，劉陽,張建華，連廣平

(1.忻州師范學(xué)院 生物系,山西 忻州 034000； 2.萬物生健康產(chǎn)業(yè)有限公司,廣東 廣州 510642)

靈芝[Ganodermalucidum] 是一種歷史悠久，具有多種生理調(diào)節(jié)功能的珍貴食藥用菌[1]。靈芝可以保護肝臟，抗腫瘤，抗艾滋病病毒及艾滋病病毒的蛋白酶活性，影響組織胺的釋放，抑制血管緊張素的形成，對人體的免疫系統(tǒng)進行調(diào)節(jié)等[2～3]。陳皮是一種經(jīng)曬干或干燥后的果皮，多為蕓香科植物的成熟果實。橙皮苷是陳皮中的主要成分之一，有較強的生理調(diào)節(jié)功能，如抗脂質(zhì)氧化、抗病毒、抗癌、延緩衰老等[4]。雪梨含有多糖和多種酯類等物質(zhì)，因此具有多種生理調(diào)節(jié)功能[5]。

近年來，靈芝相關(guān)產(chǎn)品的研究和生產(chǎn)越來越多，主要得益于其豐富的營養(yǎng)價值。對于以靈芝為原料研發(fā)的發(fā)酵型飲料在市場不常見，研究較為緩慢滯后。有研究者通過添加豆渣發(fā)酵靈芝菌絲體得到的發(fā)酵液制備的果汁色澤和組織形態(tài)較好，但口感較粗糙[6]。還有一些靈芝飲料多數(shù)直接采用子實體為原料進行生產(chǎn)，導(dǎo)致靈芝本身的營養(yǎng)成分和生理功能并沒有全部被開發(fā)出來。研究表明，相比其他飲料，發(fā)酵型的食用菌功能飲料有其獨特的優(yōu)勢，經(jīng)深層發(fā)酵后的食用菌功能飲料保留了原有食用菌的生理調(diào)節(jié)功效，并且在發(fā)酵過程中這種大型的真菌分解出的酶可以促進許多新的風味物質(zhì)的形成[7～9]。因此，開發(fā)新型發(fā)酵型食用菌功能飲料具有廣闊的前景。

本文選用靈芝為出發(fā)菌株，以具有抗氧化性功效的中草藥陳皮及口感較好的雪梨為培養(yǎng)基，添加檸檬酸及低糖的木糖醇進行混合發(fā)酵靈芝，對所得的復(fù)合型飲料以感官評價為評價指標進行優(yōu)化，并進一步對該復(fù)合飲料的活性物質(zhì)及抗氧化性進行分析，為研究發(fā)酵型飲料提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝菌種購于山東冠縣靈芝基地；陳皮、雪梨市售。木糖醇(食品級)購于河南鄭州雙騰實業(yè)有限公司；檸檬酸(食品級)購于億巖生物科技股份責任制有限公司；熊果酸、蘆丁標準品購于廣東廣州國家標準物質(zhì)商城。其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

350G小型超細食品電動磨粉機(浙江萬基塑業(yè)有限公司)；UV-6100H型紫外可見分光光度計(上海美普達科學(xué)分析儀器有限公司)；JJ224BC電子天平(上?；ǔ备呖茖嶒瀮x器有限公司)；TDZ5WSB低速自動離心機(太原邁達儀器有限公司)；DKZ-2電熱恒溫振蕩水槽(太原邁達儀器有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 復(fù)合飲料研制的工藝流程

PDA液體培養(yǎng)基復(fù)配雪梨、陳皮、木糖醇、檸檬酸接種靈芝→發(fā)酵→粗濾→高溫滅菌→冷卻成品。

1.3.2 工藝說明

1.3.2.1 陳皮汁制備

稱取適量陳皮按料液比1∶30(g·mL-1，質(zhì)量體積比)配制，沸水浴浸提兩次，每次1 h，紗布過濾后冷藏備用。

1.3.2.2 雪梨汁制備

將雪梨清洗干凈后進行削皮去核并切塊，按料液比1∶2的比例榨汁后，紗布過濾，制成溶液，冷藏備用。

1.3.2.3 發(fā)酵

將1.3.2.1中活化的靈芝菌種按接種量為0.1%的接入含有陳皮汁，雪梨汁，木糖醇和檸檬酸的PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d，得到的發(fā)酵產(chǎn)物多次過濾除雜，經(jīng)4 ℃、10 000 rpm離心后，取上清，得到最終的復(fù)合飲料，120 ℃滅菌 30 min，迅速冷卻至室溫。

1.3.3 復(fù)合飲料的單因素試驗試驗

1.3.3.1 陳皮雪梨比例

在50 mL PDA液體培養(yǎng)基中分別添加總量為20 mL不同體積比例的陳皮雪梨混合液(陳皮：雪梨為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1)混合均勻，以不添加雪梨、陳皮為對照，在28 ℃，150 r/min的恒溫振蕩器中培養(yǎng)7 d。其他變量按最小量添加(木糖醇的含量為4 g·100 mL-1，檸檬酸為0.04 g·100 mL-1)觀察靈芝菌絲生長情況，各3組平行試驗，對發(fā)酵的靈芝陳皮雪梨復(fù)合飲料進行感官評分。

1.3.3.2 陳皮雪梨添加量

設(shè)定陳皮汁與雪梨汁的體積比為1∶3，木糖醇的含量為4 g·100 mL-1，檸檬酸為0.04 g·100 mL-1，陳皮雪梨汁添加量為60%、50%、40%、30%和20%,5個梯度下混合發(fā)酵靈芝，各3組平行試驗，對發(fā)酵的靈芝陳皮雪梨復(fù)合飲料進行感官評分。

1.3.3.3 木糖醇添加量

設(shè)定陳皮汁與雪梨汁的體積比為1∶3，陳皮雪梨汁添加量為40%，檸檬酸為0.04 g/100 mL分別在木糖醇含量為3、4、5、6、7、8 g·100 mL-1的為5個梯度下混合發(fā)酵靈芝，各3組平行試驗，對發(fā)酵的靈芝陳皮雪梨復(fù)合飲料進行感官評分。

1.3.3.4 檸檬酸添加量

設(shè)定陳皮汁與雪梨汁的體積比為1∶3，陳皮雪梨汁添加量為40%，木糖醇為4 g/100 mL，分別在檸檬酸含量為0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14 g/100 mL的5個梯度下混合發(fā)酵靈芝，各3組平行試驗試驗，對發(fā)酵的靈芝陳皮雪梨復(fù)合飲料進行感官評分。

1.3.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合飲料

以產(chǎn)品感官品分作為評價指標，對復(fù)合飲料調(diào)配的陳皮雪梨比例、陳皮雪梨添加量、木糖醇添加量、檸檬酸添加量進行響應(yīng)面分析(表1)，確定最優(yōu)組合。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面分析試驗因素水平表

Table1 Factors and their levels of response surface design

因素Factors編碼水平Levels-101A陳皮雪梨比例 Proportion of tangerine peel and pear1∶21∶31∶4B陳皮雪梨添加量 Adding amount of tangerine peel and pear30 %40 %50 %C木糖醇含量/g·100 mL-1The content of xylitol 345D檸檬酸含量/g·100 mL-1The content of citric acid0.100.120.14

1.3.4 復(fù)合飲料的評定標準

復(fù)合飲料殺菌后，由30名品評員組成感官評價小組(男女各15人)對其進行感官評分，每次評分前用溫開水漱口。感官評價參考文獻進行[10]，見表2。

1.3.5 理化指標測定

可溶性固形物采用折光法測定[11]；采用精密酸度計對飲料pH 值進行測定。多糖的提取參考文獻進行[12]，并繪制標準曲線：y=1.041 4x，R2為0.999 6，R2=0.999 1。總?cè)频奶崛⒖嘉墨I進行[13]，并繪制標準曲線：y=0.140 8x+0.002 6，R2=0.999 1。

1.3.6 抗氧化性的測定

參照文獻進行[14]。其中，靈芝發(fā)酵液抗氧化性的測定直接測定發(fā)酵原液。

1.3.7 微生物指標檢測

參照 GB 7101-2015《食品安全國家標準飲料》方法檢驗。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件進行，均值之間的顯著性差異采用Duncan′s Multiple

表2 復(fù)合飲料感官評價表Table 2 Criteria for sensory evaluation of compound beverage

Range Test進行檢驗對進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 陳皮雪梨比影響因素

從圖1可以看出，不同體積陳皮雪梨比對復(fù)合飲料的口感有一定的影響，當陳皮雪梨體積比為1∶3的時候，感官評價得分最高，因此選擇陳皮雪梨的最佳比例為1∶3。

2.1.2 陳皮雪梨添加量影響因素

從圖2可以看出，隨著陳皮雪梨添加量的增加，感官評分也在逐漸增高，當達到40%時，評分最高，在40%以后，隨著陳皮雪梨添加量的增加，評分降低，表明復(fù)合飲料在此條件下，效果最佳。

2.1.3 木糖醇添加量影響因素

圖1 陳皮雪梨體積比對復(fù)合飲料感官性狀的影響Fig.1 Effect of tangerine peel and pear volume ratio on the sensory score of clarified compound beverage

圖2 陳皮雪梨添加量對感官性狀的影響Fig.2 Effect of adding amount of tangerine peel and pear on the sensory score of clarified compound beverage

圖3 木糖醇添加量對性狀評價的影響Fig.3 Effect of adding amount of newtol on the sensory score of clarified compound beverage

從圖3可以看出，感官評分隨著木糖醇含量的 增加而增高，在4 g/100 mL時，評分最高，當高于或者低于4 g/100 mL時，評分依次降低，木糖醇含量過高或過低，均會影響口感，感官評價均較差。

2.1.4 檸檬酸添加量影響因素

由圖4可知，隨著木糖醇含量的增加，感官評分也在增高，當檸檬酸添加量為0.12 g/100 mL時感官評分達到最高，表明檸檬酸含量在0.12 g/100 mL時效果最佳，產(chǎn)品酸甜可口，品質(zhì)較好。

圖4 檸檬酸添加量對感官性狀的影響Fig.4 Effect of adding amount of citric acid on the sensory score of clarified compound beverage

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

通過單因素試驗得出，陳皮雪梨比例為1∶3、陳皮雪梨汁添加量為40 %、木糖醇含量為4 g/100 mL、檸檬酸含量為0.12 g/100 mL時效果最佳，以飲料的感官得分為響應(yīng)值進行響應(yīng)面的分析試驗，如下表3。

對上表的試驗數(shù)據(jù)進行處理，得到以下四元二次方程：

Y=96.667+0.000 A-1.176B-0.667C+1.381D-7.079 A×A-8.592B×B-6.329C×C-4.843D×D-1.000 A×B-0.250 A×C+0.750 A×D-0.750B×C+0.892B×D-0.500C×D

對表3的設(shè)計試驗的數(shù)據(jù)進行分析得到響應(yīng)面回歸模型的系數(shù)顯著性可見4因素3水平方差分析結(jié)果由表4可知。

如表5所知，本試驗所用的二次模型的極顯著性(P<0.01)顯著(P<0.05)，可見陳皮雪梨添加量(B)、檸檬酸含量(D)以及A2、B2、C2、D2對感官得分有非常顯著的影響P<0.01，木糖醇含量(C)對其也有較顯著的影響p<0.05，這些說明試驗因素對感官得分的影響不是所謂的線性關(guān)系，同時也可以得知研究的幾個單因素對感官得分影響的程度依次為：檸檬酸含量>陳皮雪梨添加量>木糖醇含量>陳皮雪梨比例。由表4所顯示的分析結(jié)果所示，本試驗所用方差分析模型顯著性P<0.000 1為極顯著，而失擬項P=0.260>0.05為不顯著，說明模型對實踐的擬合程度很好，對現(xiàn)實生活有非常好的指導(dǎo)作用。同時也意味著此所模擬的實踐中的四因素三水平是可靠的，可以運用所得到的回歸方程對試驗數(shù)據(jù)模擬分析，從而得到開發(fā)靈芝陳皮雪梨飲料的最好條件。通過對回歸方程的降維分析來探討任意兩個因素是否同時影響復(fù)合飲料的口味，結(jié)果如圖5所示。

表3 陳皮雪梨發(fā)酵靈芝復(fù)合飲料最佳配方工藝響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Response surface design arrangement and corresponding experimental data

由圖5等高線可以看出檸檬酸含量與陳皮雪梨比例(圖5c)、檸檬酸含量與陳皮雪梨添加量(圖5e)組合對復(fù)合飲料的口味的影響較大。當陳皮雪梨比例和陳皮雪梨添加量一定時，感官得分隨著檸檬酸含量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

2.3 最佳條件的確定以及驗證試驗分析

通過響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)分析，得到通過計算得出陳皮雪梨比例為0.38，陳皮雪梨汁添加量為41%，檸檬酸的用量為0.11 g/100 mL，木糖醇的用量為3.94 g/100 mL預(yù)期感官得分為96.358 4，在這樣的條件下飲料達到最優(yōu)，但考慮到實際問題將試驗條件修改為為陳皮雪梨比例為1∶3，陳皮雪梨汁添加量為60%、50%、40%、30%和20%， 5個梯度下混合發(fā)酵靈芝，各3組平行試驗，對發(fā) 酵的靈芝陳皮雪梨復(fù)合飲料進行感官評分。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance for quadric regression model

注：**為極顯著：*為顯著。

Note:**Extremely striking contrast，*Striking contrast.

注：**為極顯著：*為顯著。

Note：**Extremely striking contrast，*Striking contrast.

2.4 理化指標檢測

經(jīng)測定，可溶性固形物為含量117.3 mg·mL-1、pH5.25～5.75。在最優(yōu)組合下，對陳皮雪梨發(fā)酵靈芝復(fù)合飲料中的活性物質(zhì)和抗氧化性進行測定后，結(jié)果如下(表6、表7)。

加量為40%，檸檬酸的用量0.11 g/100 mL，木糖醇的用量為4 g/100 mL按照此提取條件進行三組平行試驗，得到的飲料顏色純凈自然，有清新的陳皮味，并且伴有靈芝特有的味道，酸甜適中，感官得分為96，與理論值96.358 4相對照，相對差值為0.358 4，從而充分證明響應(yīng)面分析對實踐具有非常有效的指導(dǎo)意義。

從表6可以看出，靈芝陳皮發(fā)酵靈芝的復(fù)合飲料中含有活性物質(zhì)多糖和總?cè)苹衔?，并且多糖和總?cè)频暮扛哂陟`芝發(fā)酵液中多糖和三萜的含量。從表7可以看出，該復(fù)合飲料具有一定的氧化性，羥自由基清除率為16.27%，還原力為0.23，均高于靈芝發(fā)酵原液。

圖5 各兩因素交互作用對飲料感官評分影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the effects of various ingredients on the sensory score of beverage

Table6 Active ingredient of compound beverage under the optimal combination

檢測指標Active ingredient mg·mL-1對照(靈芝發(fā)酵液)Control (Ganoderma lucidumfermentation broth)復(fù)合飲料Compound beverage多糖Polysaccharide137.80±0.08a152.44±0.07b總?cè)芓otal triterpenes83.36±0.0.06a92.09±0.08b

注：數(shù)據(jù)右上角標注的字母表示不同處理的同一指標在0.05水平上的顯著差異性。

Note：Different capital letters show significant difference at the 0.05 level in the same row.

2.5 微生物指標

細菌總數(shù)<100 cfu/mL，大腸桿菌< 6 MPN/100 mL，致病菌未檢出。

表7最優(yōu)組合下復(fù)合飲料的抗氧化性能

Table7 Anti-oxidative properties of compound beverage under the optimal combination

檢測指標Active ingredient 對照(靈芝發(fā)酵液)Control (Ganoderma lucidum fermentation broth)復(fù)合飲料Compound beverage羥自由基清除率/%13.52%±0.18a16.27%±0.18b還原力 (OD)0.11±0.17a0.23±0.18b

注：數(shù)據(jù)右上角標注的字母表示不同處理的同一指標在0.05水平上的顯著差異性。

Note：Different capital letters show significant difference at the 0.05 level in the same row

3 討論

本研究優(yōu)化后得到的陳皮雪梨發(fā)酵靈芝的復(fù)合飲料具有一定的抗氧化性，且抗氧化性能高于靈芝發(fā)酵液中。對復(fù)合飲料中的活性物質(zhì)多糖和總?cè)频暮扛哂陟`芝發(fā)酵液中的含量，推測引起這種變化的原因，可能是在發(fā)酵液中靈芝會吸收陳皮雪梨中的某些營養(yǎng)物質(zhì)作為合成多糖和某些抗氧化活性物質(zhì)的原料，其次，靈芝發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶會水解陳皮雪梨中細胞壁上的纖維素和木質(zhì)素等，可引起多糖等物質(zhì)的釋放；除此之外，微生物在發(fā)酵過程中的生物轉(zhuǎn)化作用導(dǎo)致其他成分可能轉(zhuǎn)化為多糖類物質(zhì)。

大分子物質(zhì)會被靈芝生長過程中產(chǎn)生的酶類水解，有研究表明，靈芝胞外三萜對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有較好的抑菌作用[15～17]。本研究制備的陳皮雪梨發(fā)酵型功能飲料含有較高的三萜類化合物，可以進一步探討該飲料的抑菌及其他生理調(diào)節(jié)功能。

4 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化陳皮雪梨發(fā)酵靈芝最佳配方，通過模型回歸分析得到在試驗范圍內(nèi)存在最大值，100 mL發(fā)酵復(fù)合飲料的最佳配方比為陳皮雪梨汁40%，體積比1∶3，檸檬酸0.11 g，木糖醇4 g。該復(fù)合飲料中的多糖含量為152.44 mg·mL-1，總?cè)坪繛?2.09 mg·mL-1，與靈芝發(fā)酵原液相比，羥自由基清除率為16.27%，還原力為0.23，具有一定的抗氧化性。