曹燕篆，張建偉，閆雙堆

(山西農(nóng)業(yè)大學 資源與環(huán)境學院，山西 太谷 030801)

秸稈是世界上最豐富的木質纖維素資源，同時也是主要的農(nóng)業(yè)有機廢棄物，全世界每年可產(chǎn)生近20億噸秸稈，我國作為農(nóng)業(yè)大國，秸稈產(chǎn)量每年可達7億多噸，占世界秸稈資源產(chǎn)量的25%左右[1～2]，秸稈的綜合利用對農(nóng)業(yè)生態(tài)穩(wěn)定、農(nóng)民增收及緩解能源環(huán)境壓力具有重要作用[3]。中國是世界上谷子種植面積最大的國家之一，近年來，隨著谷子的抗旱節(jié)水特性、營養(yǎng)保健功能及產(chǎn)業(yè)開發(fā)價值逐漸被人們重新認識，種植面積持續(xù)擴大，隨之而來的是產(chǎn)量可觀的谷子秸稈[4]，但目前對谷子秸稈的資源轉化研究較少。

谷子秸稈主要由木質纖維素組成，化學成分復雜，物理結構致密，對微生物的分解具有抵抗作用。分解效率低成為限制秸稈資源高效利用的瓶頸，因此多種不同的預處理方式被提出，其中NaOH處理是一種最常見的預處理方式，能夠有效去除木質素并破壞結晶結構從而增加纖維素接觸面積[5,6]。大量的研究表明，秸稈等天然木質纖維素材料經(jīng)過不同濃度的NaOH預處理后能夠顯著提高水解效率，獲得更多的還原糖、甲烷產(chǎn)量等[7,8]。然而，大量廢液的產(chǎn)生需要處理，降低了秸稈資源化經(jīng)濟效益，若處理不當則會造成環(huán)境污染問題。生物預處理由于具有成本低、環(huán)境友好、產(chǎn)量高等優(yōu)點，成為目前研究的熱點[9]。同時，研究發(fā)現(xiàn)微生物菌群比單個菌株具有更好的木質纖維素分解能力[10]。本研究利用已經(jīng)篩選獲得的一組能夠有效分解多種木質纖維素材料的菌群MC1，其組成主要包括Clostridium straminisolvens CSK1，Clostridium sp. FG4, Pseudoxanthomonas sp. M1-3，Brevibacillus sp. M1-5及 Bordetella sp. M1-6[11]，比較對NaOH處理及未經(jīng)任何前處理谷子秸稈的分解特性，研究MC1對谷子秸稈的分解潛力，對我國谷子秸稈的資源化利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：菌群MC1由中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院廢棄物資源利用研究室提供[12]。

谷子秸稈：取自山西農(nóng)業(yè)大學實驗站。一部分用1% NaOH浸泡24 h清水沖洗至pH中性，60 ℃烘干至恒重備用(堿處理秸稈AT)，另一部分直接烘干備用(未處理秸稈NT)，秸稈木質纖維素組成見表 1。

表 1 秸稈樣品組成成分Table 1 Components of millet straw samples

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

復合菌系MC1的活化及培養(yǎng)使用PCS培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，NaCl 5 g，CaCO32 g，去離子水1 L，pH 7.0。將200 mL的培養(yǎng)液加入到300 mL的三角瓶中，添加1%的谷子秸稈作為唯一碳源，121 ℃滅菌30 min。待培養(yǎng)基冷卻至室溫，接種MC1進行分解試驗，接種量為5 % v/v，接種后置于50 ℃靜置培養(yǎng)，于0，1，3，6，9，12，15 d取樣測定分解過程中的減重、生物量及酶活等指標，3次重復。

1.3 谷子秸稈的總減重及各成分減重

MC1分解過程中剩余的谷子秸稈用3%醋酸浸泡去除培養(yǎng)基中的CaCO3，用已知重量的濾紙過濾，于60 ℃烘干至恒重后稱重，計算秸稈總減重。烘干后的秸稈粉碎過1 mm篩，稱取0.5 g裝入F57專用袋中，用美國ANKOM公司生產(chǎn)的ANKOM220型纖維分析儀測定纖維素、半纖維素及木質素含量。

1.4 酶活測定

MC1分解谷子秸稈過程中的羧甲基纖維素酶活及木聚糖酶活測定方法參考文獻[13]。

1.5 生物量測定

通過測定培養(yǎng)體系中總蛋白量反應MC1分解谷子秸稈過程中生物量的變化。培養(yǎng)體系中總蛋白包括培養(yǎng)液蛋白及菌體蛋白兩部分。將所有培養(yǎng)液分次倒入離心管中8 000 r·min-1離心10 min，上清液為第1部分蛋白液，收集的菌體備用。向三角瓶中添加50 mL無菌水，150 r·min-1振蕩30 min洗脫附著在未分解秸稈上的菌體細胞，將獲得的菌液分次倒入離心管中8 000 r·min-1離心10 min，收集第2部分菌體蛋白，并與上一步離心的菌體混合，用超聲波細胞破碎儀(Scientz-IID)破碎兩次(20 KHz)，每次5 min，破碎后的懸浮液冷卻至室溫，8 000 r·min-1離心10 min，取上清作為第2部分菌體細胞的蛋白液。蛋白濃度的測定使用BCA法[14]。

1.6 培養(yǎng)液中有機酸的測定

利用高效液相色譜儀(LC-20 A，島津)測定谷子秸稈分解過程中有機酸的累積情況。培養(yǎng)液經(jīng)12 000 r·min-1離心10 min，上清液與乙腈按體積比1∶1混合后靜置5 min，12 000 r·min-1離心10 min后上清過0.22 μm濾膜。儀器配置及條件為：伯樂Aminex HPX-87H液相色譜柱，柱溫為40 ℃，SPD-S20 A檢測器，流動相5 mm H2SO4，流速為0.6 mL·min-1，測定時間40 min。

1.7 培養(yǎng)液中還原糖的測定

采用蒽酮硫酸法測定培養(yǎng)液中還原糖的濃度，測定方法參照文獻[15]。

2 結果與分析

2.1 MC1對谷子秸稈的分解能力

由圖1可知，MC1能夠有效分解谷子秸稈。培養(yǎng)15 d后，堿處理秸稈的總減重為61.8%，未處理秸稈的總減重為60.0%，分解6 d后兩種處理秸稈的分解率差異較小，堿處理秸稈的分解率比未處理秸稈的分解率高0.3%～3.6%。但是，3 d內堿處理秸稈的分解速率顯著高于未處理秸稈。3 d后，對堿處理秸稈的分解率達到44.1%，而對未處理秸稈的分解率只有20.8%?？梢?，堿處理能夠在較短時間提高MC1對谷子秸稈的分解率，若分解時間超過6 d，MC1對未處理谷子秸稈同樣具有良好的分解效果。

圖1 谷子秸稈分解效果Fig.1 Degradation of Millet straw by MC1

2.2 木質纖維素各成分減重

由表1可知，0 d未處理秸稈的纖維素半纖維素的總量為82.5%，堿處理秸稈為81.7%，堿處理后纖維素比例增加，半纖維素及木質素含量減少。分解15 d后，谷子秸稈殘留的木質纖維素成分見圖2，未處理秸稈殘余的纖維素、半纖維素、木質素含量分別為0.45 g，0.18 g，0.11 g，分解率分別為58.2%，69.3%，47.2%。堿處理秸稈殘余的纖維素、半纖維素、木質素含量分別為0.41 g，0.12 g，0.12 g，分解率分別為65.0%，74.3%，30.2%。可見，MC1對未處理谷子秸稈具有明顯的分解能力，并且對半纖維素的分解能力最強。

圖2 谷子秸稈分解過程中的成分減重Fig.2 Degradation of lignocellulosic components of Millet straw

2.3 分解過程中的酶活變化

圖3分析了MC1分解谷子秸稈過程水解液中羧甲基纖維素酶活及木聚糖酶活，結果顯示發(fā)酵液中的木聚糖酶活高于羧甲基纖維素酶活。堿處理秸稈為底物時，分解第9 d木聚糖酶活、羧甲基纖維素酶活均達到最高，分別為84.8 IU·mL-1和14.1 IU·mL-1。未處理秸稈為底物時，分解第9 d羧甲基纖維素酶活達到最高，為13.1 IU·mL-1，木聚糖酶活呈逐漸增加的趨勢，在第15 d達到最高為79.2 IU·mL-1。另外，從圖 3可以看出羧甲基纖維素酶活和半纖維素酶活在3 d后都有一個快速增加的趨勢，6 d后變化的幅度減少，該變化規(guī)律與秸稈分解率一致。

圖3 谷子秸稈分解過程中的酶活Fig.3 Enzyme activities during Millet straw degradation

2.4 培養(yǎng)液中還原糖的累積

由圖4可知，分解第0 d，未處理及堿處理秸稈為底物時培養(yǎng)液中的還原糖濃度分別為147.3 mg·L-1和111.4 mg·L-1，堿處理浸泡和沖洗過程會造成秸稈中還原糖的部分損失。MC1分解未處理秸稈第9 d培養(yǎng)液中的還原糖濃度達到最高為355.6 mg·L-1，分解堿處理秸稈第9 d達到一個高峰后先下降又上升，其中第9 d時培養(yǎng)液中還原糖的濃度為299.5 mg·L-1，第15天時為305.9 mg·L-1。

圖4 谷子秸稈過程中產(chǎn)生的還原糖Fig.4 Analysis of reducing sugar during Millet straw degradation

2.5 培養(yǎng)液中揮發(fā)性產(chǎn)物的變化

利用HPLC分析了MC1分解谷子秸稈過程中產(chǎn)生的主要有機酸：甲酸、乙酸和丙酸的含量，分解液中未檢測到丁酸(圖5)。結果表明乙酸產(chǎn)量高于甲酸和丙酸，分解第3 d乙酸濃度達到最高，未處理秸稈和堿處理秸稈為底物時的濃度分別為1.18 g·L-1、1.27 g·L-1。分解過程中甲酸的累積規(guī)律與乙酸相似，分解第3 d，甲酸的濃度達到最高，未處理秸稈和堿處理秸稈為底物時的濃度分別為0.54 g·L-1、0.65 g·L-1。丙酸濃度在整個分解期間比較穩(wěn)定，為0.60±0.10 g·L-1。

圖5 谷子秸稈分解過程中揮發(fā)性產(chǎn)物的變化Fig.5 Changes of major volatile products during Millet straw degradation

2.6 生物量

MC1分解谷子秸稈過程中，無論是培養(yǎng)液中的蛋白還是菌體蛋白都呈先上升后下降的趨勢(圖 6)。培養(yǎng)0 d，未處理秸稈和堿處理秸稈培養(yǎng)液中的蛋白濃度為437.5 mg·L-1，主要來自培養(yǎng)基中的蛋白胨成分。在整個分解過程中，培養(yǎng)液中的蛋白濃度最高出現(xiàn)在第9天，分解未處理秸稈及堿處理秸稈的濃度分別為1 810.0 mg·L-1和1 220.6 mg·L-1。菌體蛋白最高濃度出現(xiàn)在第6 d，分解未處理秸稈及堿處理秸稈的濃度分別為855.21 mg·L-1和1 405.6 mg·L-1。結果表明添加未處理秸稈有利于培養(yǎng)液中蛋白的累積，而堿處理秸稈有利于菌體蛋白的積累，并且以未處理秸稈為底物時總生物量略高于堿處理秸稈為底物。

圖6 谷子秸稈分解過程中生物量的變化Fig.6 Changes of protein concentration during Millet straw degradation

3 討論與結論

為了提高秸稈的分解效率，通常需要對秸稈進行物理、化學或生物預處理。王慧等[16]利用復合菌系XDC-2對未經(jīng)化學處理的水稻秸稈進行分解，12 d總質量減少了39.71%，顯著低于堿處理水稻秸稈58.2%的降解率[17]。楊巧麗等[18]從糞便中篩選到一組木質纖維素分解菌群，6 d對未經(jīng)化學處理但粉碎后的小麥秸稈、稻草秸稈、玉米秸稈的降解率分別為47.0%，48.62%及50.21%。復合菌系MC1能夠15 d分解堿處理秸稈的61.8%，未處理秸稈的60.0%，6 d對2種秸稈的分解率都達到50%以上。另外，焦有宙等利用幾株木質纖維素優(yōu)勢土著菌及其混合菌對玉米秸稈進行分解，35 d對纖維素、半纖維素的最高分解率為46.32%和48.53%[19]，而MC1能夠在14 d分解玉米秸稈纖維素的53.1%，半纖維素的76.4%[20]。主要由于復合菌系沒有破壞菌群之間的協(xié)同共生關系，對天然木質纖維素的分解能力大于單個菌株或菌株的簡單混合。

谷子秸稈分解過程中可產(chǎn)生還原糖、甲酸、乙酸及丙酸等能源物質，甲酸和乙酸濃度在分解的第3 d達到最高。有研究表明秸稈水解酸化過程中會產(chǎn)生短鏈揮發(fā)性產(chǎn)物，同時對木質纖維素材料的進一步水解酸化有重要意義，另外有機酸的種類、濃度的變化取決于pH、微生物的種類、溫度及有機物的種類等[21～22]。秸稈水解后的有機酸尤其是乙酸、丁酸被認為是產(chǎn)甲烷的最適底物，能夠促進甲烷效率并提高甲烷生產(chǎn)的穩(wěn)定性[23]。

MC1分解谷子秸稈過程中以未處理秸稈為底物時總生物量略高于堿處理秸稈為底物。李湘等利用復合菌系MC1降解不同預處理后的玉米秸稈也發(fā)現(xiàn)，未處理秸稈的生物量要大于堿處理秸稈，并且氣爆處理后生物量最大[24]。綜上，高效木質纖維素分解復合菌系MC1能有效分解未經(jīng)任何處理的谷子秸稈，可產(chǎn)生還原糖、有機酸等能源物質，為谷子秸稈的資源利用提供依據(jù)。