岳俊濤， 孫慧敏，雷志杰， 邵 晨,

(1.第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710032；2.廈門大學(xué)附屬翔安醫(yī)院泌尿外科，福建廈門 361100； 3.第四軍醫(yī)大學(xué)西京消化病院，陜西西安 710032)

在全球范圍內(nèi)，前列腺癌發(fā)病率位居男性腫瘤第2位[1]。中國是前列腺癌發(fā)病率較低的國家，但隨著經(jīng)濟水平的發(fā)展及社會老齡化程度的加重，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]。對于患原位前列腺癌的患者來說，其5年生存率幾乎可達99%，然而一旦其發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，5年生存率則迅速下降至29%[3]。由于診療水平的限制，在我國有80%的患者在初次診斷時就已經(jīng)發(fā)生了遠處轉(zhuǎn)移，對我國男性健康造成了很大威脅[4]。因此，探究前列腺癌轉(zhuǎn)移的機制，建立進一步的預(yù)防措施，對于提高患者生存率是至關(guān)重要的。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是正常的生理過程，其在脊椎動物的胚胎發(fā)育及維持組織的形態(tài)方面意義重大[5]，最近的研究表明，EMT在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中也起到了重要作用[6]。EMT的過程伴隨著一些重要的分子標(biāo)志的改變，主要的如上皮型鈣黏蛋白(epithelial cadherin，E-cadherin)的降低，神經(jīng)型鈣黏蛋白(neural cadherin，N-cadherin)、Twist家族轉(zhuǎn)錄因子1(twist basic helix-loop-helix transcription factor 1，Twist1)及鋅指蛋白E-box結(jié)合同源蛋白1(zinc finger e-box binding homeobox 1，ZEB1)的上調(diào)等[7]。 在這些分子改變的基礎(chǔ)上，腫瘤細胞逐漸改變其形態(tài)與極性，轉(zhuǎn)移能力與侵襲能力也發(fā)生了變化。在許多前列腺癌細胞系的體內(nèi)體外實驗中已證明，擁有更多間質(zhì)特征的腫瘤細胞同時也擁有更強的細胞侵襲性及遠處轉(zhuǎn)移能力[8]。

在已經(jīng)構(gòu)建了前列腺癌細胞系PC3的循環(huán)腫瘤細胞(PC3-circulating tumor cell，PC3-CTC)的基礎(chǔ)上，本研究主要通過探究EMT相關(guān)分子在兩種不同轉(zhuǎn)移能力的前列腺癌細胞中的表達差異，并結(jié)合美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI) 的高通量基因表達數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)分析相關(guān)分子與前列腺癌患者疾病特征的相關(guān)性，尋找到有潛在研究意義的新分子，為進一步闡明前列腺癌轉(zhuǎn)移機制，尋找新的抗轉(zhuǎn)移靶點奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料PC3細胞購自美國模式菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，PC3-CTC的獲得參見之前發(fā)表過的文章[9]。兩種細胞均培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基(購自Gibco.Life Technologies公司)，培養(yǎng)基加入10%胎牛血清(購自杭州四季青公司)，置于 37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR) 使用RNeasy Plus Mini Kit從PC3及PC3-CTC細胞中提取RNA，并使用RT2 First Strand Kit將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以兩種細胞的cDNA為模板檢測EMT相關(guān)基因的表達情況。以上試劑及Human EMT PCR 芯片、 RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix均購自Qiagen公司，所有的操作步驟按照試劑說明書進行。結(jié)果檢測使用7 500 Fast 實時定量PCR儀檢(購自Applied Biosystems公司)，實驗重復(fù)3次。使用SABioscience網(wǎng)上數(shù)據(jù)分析工具分析所得到的Ct值，并做圖。(www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php)

1.3GEO數(shù)據(jù)獲取及數(shù)據(jù)分析研究所采用的的數(shù)據(jù)來自于NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫中前列腺癌基因表達數(shù)據(jù)集GSE16560的series matrix文件，所有281例前列腺癌患者的疾病特征及隨訪信息也同時包含在同一文件中。該數(shù)據(jù)集采用的芯片平臺是美國illumina公司的GPL5474(Human 6k Transcriptionally Informative Gene Panel for DASL)。該平臺包含約6 144個人類蛋白的基因片段?；颊甙凑誈leason評分(6分、7分、8分、≥9分)、腫瘤狀態(tài)(轉(zhuǎn)移與未轉(zhuǎn)移)分組分別對基因表達進行分析。采取基因表達量的中位數(shù)作為截斷值來將患者分為低表達組與高表達組進行生存期分析，0表示截止隨訪時間內(nèi)存活，1表示死亡。使用Graphpad軟件進行作圖及統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4Oncomine數(shù)據(jù)分析在Oncomine數(shù)據(jù)庫中輸入需要查詢的基因名Jagged1(JAG1) 以及絲氨酸蛋白酶抑制蛋白E1(serine proteinase inhibitor family e member 1，SERPINE1)，參數(shù)設(shè)定為P<0.05，倍性變化(fold change，F(xiàn)C)為All，基因等級(Gene Rank)為All，數(shù)據(jù)類型選擇信使RNA(messenger RNA，mRNA)。

1.5Kaplan-Meier生存分析從Kaplan-Meierplotter網(wǎng)站中查詢卵巢癌、肺癌、胃癌的相關(guān)數(shù)據(jù)并繪制Kaplan-Meier生存曲線(http://kmplot.com/analysis/)。比較JAG1及SERPINE1與此3種腫瘤患者總隨訪時間的關(guān)系。

1.6基因富集分析(genesetsenrichmentanalysis，GSEA) 使用GSEA 3.0 進行基因富集分析。數(shù)據(jù)集使用的是 c2.cp.kegg.v6.1.symbols.gmt。使用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計方法進行富集分析，計算錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)及名義P值(nominal P value)，隨機組合次數(shù)設(shè)置為1 000次。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法對于同一基因不同分組之間的表達比較采用非配對的t檢驗。生存分析采用Log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1EMT相關(guān)基因在PC3與PC3-CTC細胞中的表達差異分析對比PC3細胞及PC3-CTC細胞在EMT PCR芯片中的表達差異(圖1)，結(jié)果顯示84個EMT相關(guān)基因中，明顯上調(diào)的有27個(表1)，其中EMT發(fā)生過程的標(biāo)志性分子是上調(diào)的,如：N-cadherin(CDH2)、Twist1、ZEB1等。

表127個上調(diào)的EMT相關(guān)基因

編號基因上調(diào)倍數(shù)P值A(chǔ)03BMP16.570.000 012A10CDH26.930.037 24B02CTNNB112.530.005 244B07ESR18.50.000 048B10FN17.620.006 106B11FOXC272.050.040 68B12FZD716.260.029 826C03GSK3β5.170.021 302C10JAG16.660.021 083D01KRT79.40.001 764D03MMP23.510.010 251D06MSN15.720.002 302E07SERPINE1575.280.012 187E11SNAI26.490.002 35E12SNAI360.038 189F01SOX1017.290.000 528F02SPARC58.710.039 4F03SPP117.290.028 512F04STAT317.290.013 058F09TGFB110.880.001 427F11TGFB34.380.007 2G04TWIST110.150.011 982G06VIM6.30.036 107G08WNT1128.60.017 362G10WNT5B28.380.022 058G11ZEB19.550.017 728G12ZEB215.080.046 015

上調(diào)倍數(shù)=PC3-CTC的表達量/PC3的表達量。

2.2上調(diào)基因與前列腺癌患者不同分組的關(guān)系我們依據(jù)281名患者的腫瘤狀態(tài)分別將患者分為腫瘤轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組，依據(jù)此分組對上調(diào)的27個基因進行分析(圖2A)。結(jié)果顯示：JAG1(P=0.000 1)、TWIST1(P=0.004 6)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGFB1)(P=0.036 6)、富半胱氨酸分泌蛋白((secreted protein acidic and rich in cyst-eine，SPARC)(P=0.015 1)、SERPINE1(P=0.028 3)5個基因在腫瘤轉(zhuǎn)移的患者中表達高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者，且具有統(tǒng)計學(xué)差異。

圖1 具有不同轉(zhuǎn)移能力前列腺癌細胞系之間EMT相關(guān)基因的表達差異分析

我們分析了上調(diào)基因與患者前列腺癌Gleason評分的關(guān)系(圖2B)。結(jié)果顯示：有7個基因的表達隨著Gleason評分的升高而升高，呈正相關(guān)性且有統(tǒng)計學(xué)意義。取上調(diào)基因的中位數(shù)作為截斷值將281名患者分為高表達組與低表達組，并對其隨訪時間(月)進行生存分析(圖2C)。結(jié)果示：JAG1(P=0.000 3)、TWIST1(P=0.001 0)、纖維連接蛋白1(FN1)(P=0.003 3)、WNT家族蛋白11(WNT11)(P=0.023 5)、SERPINE1(P=0.024 5)5個基因低表達組的患者生存時間長于高表達組，且具有統(tǒng)計學(xué)差異。

結(jié)合以上的分析，我們篩選出TWIST1、JAG1、SERPINE1三個與前列腺癌的轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)的EMT相關(guān)基因，做進一步研究(圖2D)。

2.3SERPINE1以及JAG1在其他腫瘤中的功能分析作為EMT過程的標(biāo)志性基因，對TWIST1的研究已經(jīng)非常充分。因此我們把焦點放在JAG1以及SERPINE1上。

為了驗證JAG1與SERPINE1是否與腫瘤的轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后正相關(guān)，我們還探究了這兩個基因在其他腫瘤中的情況。從Oncomine數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，在近20種腫瘤與相應(yīng)的正常組織比較中，JAG1在164項腫瘤組織獨立分析中高表達，在147項正常組織獨立分析中低表達。SERPINE1在152項腫瘤組織獨立分析中高表達，在61項正常組織獨立分析中低表達(圖3A)。

在卵巢癌、肺癌、胃癌3種腫瘤的Kaplan-Meier生存分析中，SERPINE1低表達的患者總生存期長于高表達患者，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。而JAG1則并未顯示有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B)。

綜上所述，SERPINE1可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)?？梢宰鳛闈撛诘拇倌[瘤轉(zhuǎn)移基因來進行進一步的研究。

圖2不同腫瘤患者分組中上調(diào)基因的表達意義分析

A：按照腫瘤轉(zhuǎn)移、非轉(zhuǎn)移分組；B：按照Gleason評分分組；C：上調(diào)基因與前列腺癌患者隨訪生存期的關(guān)系；D：綜合分析篩選出TWIST1、JAG1、SERPINE1作為潛在研究對象。

圖3 在其他腫瘤中分析SERPINE1和JAG1的功能

A：JAG1與SERPINE1在不同腫瘤及相應(yīng)正常組織中的表達情況比較；B：JAG1與SERPINE1在卵巢癌、肺癌、胃癌的Kaplan-Meier生存分析。

2.4SERPINE1的功能基因集富集通過GSEA方法對高表達SERPINE1的腫瘤樣本進行分析，結(jié)果顯示高表達SERPINE1與血管生成(P=0.034，F(xiàn)DR=0.014)、細胞粘附分子(P=0.02，F(xiàn)DR=0.053)、細胞外基質(zhì)分子(P=0.035，F(xiàn)DR=0.316)以及基質(zhì)受體(P=0.002，F(xiàn)DR=0.033)等基因集相關(guān)(圖4)。這表明SERPINE1 可能通過影響腫瘤血管生成以及腫瘤細胞轉(zhuǎn)移從而促進腫瘤進展。

圖4使用GSEA分析SERPINE1相關(guān)富集基因集

3 討 論

本研究通過分析兩種轉(zhuǎn)移侵襲能力不同前列腺癌細胞系PC3及PC3-CTC中EMT相關(guān)分子的變化，結(jié)合GEO數(shù)據(jù)庫、Oncomine數(shù)據(jù)庫及其他腫瘤的Kaplan-Meier生存分析結(jié)果，最終篩選出了促癌轉(zhuǎn)移基因SERPINE1。并通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)SERPINE1可能通過影響血管生成等過程促進前列腺癌轉(zhuǎn)移。

SERPINE1或者纖溶蛋白酶原激活物抑制物1(plasminogen activator inhibitor 1，PAI-1)屬于絲氨酸蛋白激酶抑制劑家族成員，其編碼的蛋白能夠抑制組織型纖維蛋白酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA) 以及尿激酶型纖維蛋白酶原激活物(urokinase plasminogen activator，uPA)的活性，從而抑制纖維蛋白溶解過程。正常生理狀態(tài)下，SERPINE1能夠平衡纖維蛋白激活及溶解系統(tǒng)，有利于傷口愈合，病理狀態(tài)下，血漿中SERPINE1的異常升高導(dǎo)致過度的纖維蛋白激活，形成疤痕[10]。此外，SERPINE1還參與了心臟、肝、肺、腎、皮膚等器官的纖維化病理過程[11]。

最近的研究表明SERPINE1參與了腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及化療藥物耐藥過程，但具體機制尚不明確，SERPINE1作為EMT通路中的一員，可能通過促進腫瘤的血管生成來到達促進腫瘤生長的目的。

血管形成是腫瘤發(fā)展的重要過程，與此相同的是， EMT也在腫瘤進展中扮演重要角色。而關(guān)于二者之間的關(guān)系，有研究表明主要由間質(zhì)樣腫瘤細胞構(gòu)成的腫瘤組織中血管密度明顯高于上皮樣腫瘤細胞所形成的腫瘤組織，對于血管內(nèi)皮的標(biāo)志物CD34的檢測結(jié)果也表明在間質(zhì)性腫瘤中CD34表達要高于上皮性質(zhì)的腫瘤。由同一種乳腺癌細胞發(fā)展而來的間質(zhì)樣腫瘤細胞中相較于上皮樣腫瘤細胞檢測出了更高的A型血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF-A)水平，無論是從mRNA以及蛋白水平均如此[12]。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是目前最有效的EMT過程激動劑[7]，通常認(rèn)為TGF-β通過激活果蠅抗體節(jié)極性蛋白類似蛋白(similar mothers against decapentaplegic，SMAD)途徑進而發(fā)揮作用，然而有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β作用存在一種SMAD非依賴途徑，其下游包括胞外信號調(diào)節(jié)激酶/有絲分裂激活蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase /mitogen-activated protein kinase，ERK/MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路，而這些通路大多參與了EMT相關(guān)過程[13]。而ERK/MAPK、PI3K/Akt信號通路同時也是血管生成過程不可或缺的環(huán)節(jié)[14]。這表明EMT與血管生成過程有共用的信號通路。ZHANG等[15]報道富亮氨酸α-2糖蛋白1(leucine rich α-2-glycoprotein 1，LRG1)能夠通過激活缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)來調(diào)節(jié)血管生成過程以及EMT的發(fā)生，HIF-1α在VEGF通過與其血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)結(jié)合之后啟動一系列下游通路從而促進腫瘤血管生成的過程中起到至關(guān)重要作用，此外，HIF-1α也能夠通過作用于Twist1以及Snail家族轉(zhuǎn)錄受體1(snail family transcriptional repressor 1，Snail1)來調(diào)節(jié)EMT過程。綜上所述，EMT過程與血管生成擁有共同通路以及一些分子，EMT過程中一些表達變化的分子可能會促進前血管生成因子表達，從而促進血管生成的發(fā)生。

與腎癌不同，關(guān)于血管生成過程在前列腺癌中的作用的研究比較少，一般認(rèn)為前列腺癌是寡血管生成的腫瘤。然而有研究表明血管內(nèi)皮的標(biāo)志物CD34、VEGF-A及HIF-1α的表達均隨著癌組織Gleason評分、T分期的升高及伴有遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)[16]。這表明血管生成可能在前列腺癌的發(fā)展過程中起到一定作用。SARASWATI等[17]報道α-檀香醇能夠通過調(diào)節(jié)VEGFR2介導(dǎo)的AKT/雷帕霉素作用靶點激酶(mechanistic target of rapamycin kinase，mTOR)/核糖體蛋白S6激酶β1(ribosomal protein s6 kinase beta-1，P70S6K)通路來抑制血管生成以及前列腺癌的生長。ROY等[18]報道維甲酸受體應(yīng)答物1(retinoic acid receptor responder 1，RARRES1)能夠通過抑制腫瘤血管生成過程，增強了氧化應(yīng)激對前列腺癌細胞的生長抑制作用。還有研究顯示雄激素受體(androgen receptor，AR)作為轉(zhuǎn)錄因子能夠作用于VEGF相關(guān)基因的上游，促進VEGF的轉(zhuǎn)錄[19]。除此之外，一些針對血管生成的靶向治療臨床研究早已在進行中，目前的結(jié)果表明能夠穩(wěn)定或者降低患者的前列腺特異抗原(prostate specific antigen，PSA)水平[20]。一項臨床試驗結(jié)果顯示抗雄激素聯(lián)合抗VEGF(貝伐珠單抗Bevacizumab、阿瓦斯汀Avastin)治療相較于單獨抗雄治療能夠顯著延長前列腺癌患者生存期[21]。SERPINE1能夠通過抑制纖溶蛋白酶，從而促進腫瘤的血管生成，進而參與前列腺癌的進程。

綜上所述，SERPINE1在多種疾病中發(fā)揮著重要作用，然而其在前列腺癌中的功能研究得并不充分。本研究綜合多種方法發(fā)現(xiàn)了SERPINE1作為潛在促癌基因，同時也為SERPINE1可能通過血管生成來促進前列腺癌轉(zhuǎn)移的機制研究提供生物信息學(xué)證據(jù)支持。然而SERPINE1促進前列腺癌發(fā)展轉(zhuǎn)移的具體機制仍需要進一步的實驗證據(jù)支持。