李建平，劉 瑩，翟曉強(qiáng)，南 寧，王 莉，王振龍，李和程，種 鐵

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710004)

前列腺癌是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的男性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)2015年在美國(guó)約有23萬(wàn)新發(fā)前列腺癌患者，死亡病例約3萬(wàn)例[1]。近幾年我國(guó)前列腺癌發(fā)病率顯著升高，已成為發(fā)病率最高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤[2]。手術(shù)治療聯(lián)合內(nèi)分泌治療和放療可以明顯改善患者預(yù)后，但在治療一段時(shí)間后，絕大部分患者會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是前列腺癌患者死亡最主要的原因。研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是促進(jìn)前列腺癌等惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的主要機(jī)制。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT后，其上皮樣特性缺失而表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表型，從而獲得遷移和侵襲能力[3-4]。因此，探究抑制EMT的機(jī)制對(duì)于改善前列腺癌患者預(yù)后，提高患者生存率具有重要意義。

白藜蘆醇是一種天然多酚類化合物，具有一定的抗炎、抗氧化及抗腫瘤作用。有研究表明，白藜蘆醇在肺癌、胰腺癌和乳腺癌中可以通過(guò)抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程發(fā)揮抗腫瘤作用[5-7]。我們前期在前列腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可抑制前列腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，同時(shí)初步提示Hedgehog信號(hào)通路在白藜蘆醇調(diào)控EMT過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，但其作用機(jī)制尚未真正明確[8]。因此，本研究在前列腺癌細(xì)胞PC-3中，以Hedgehog信號(hào)通路抑制劑環(huán)巴明為陽(yáng)性對(duì)照，觀察白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、EMT過(guò)程和Hedgehog信號(hào)通路的影響，為白藜蘆醇對(duì)前列腺癌作用機(jī)制的深入研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料PC-3細(xì)胞購(gòu)自ATCC，白藜蘆醇和環(huán)巴明購(gòu)自Sigma公司，達(dá)爾伯克改良伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基 (dulbecco’s modified eagle medium，DEME)購(gòu)自Gibco公司、MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，漢語(yǔ)化學(xué)名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]購(gòu)自Sigma公司，Transwell小室購(gòu)自Corning公司，Gli-1、SMO、E-caderin、N-caderin和Vimentin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)引物由生工生物工程有限公司合成， Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 將PC-3細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中。將含細(xì)胞的培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2孵箱中貼壁培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為3組：分別為空白對(duì)照組(僅含培養(yǎng)基)、白藜蘆醇組(0～50 μmol/L)、環(huán)巴明組(0～50 μmol/L)。

1.2.2細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期消化并計(jì)數(shù)，以5×103個(gè)/mL接種在96孔板，貼壁培養(yǎng)過(guò)夜后吸出培養(yǎng)液。白藜蘆醇組分別加入200 μL不同濃度白藜蘆醇(0、5、10、20、30、50 μmol/L)、環(huán)巴明組(cyclopamine)分別加入不同濃度環(huán)巴明(0、5、10、20、30、50 μmol/L)、空白組細(xì)胞僅加入相應(yīng)培養(yǎng)基，分別培養(yǎng) 24、48和72 h。藥物干預(yù)完成后，棄去培養(yǎng)基，加入20 μL 5 mg/mL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，最后加入150 μL DMSO處理，用酶標(biāo)儀在490 nm時(shí)測(cè)定細(xì)胞吸光度值(A)，計(jì)算抑制率。計(jì)算公式：抑制率=(1-藥物干預(yù)組A/對(duì)照組A)×100%。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn) 用胰蛋白酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，按 5×105個(gè)/mL的接種于6孔板。于37 ℃、5%CO2孵箱中貼壁培養(yǎng)24 h。用干凈的10 μL無(wú)菌槍頭的尖端分別在6孔版的各組細(xì)胞上劃痕。PBS清洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組分別加入10 μmol/L白藜蘆醇培養(yǎng)液(白藜蘆醇組)和10 μmol/L環(huán)巴明培養(yǎng)液(環(huán)巴明組)，對(duì)照組僅加入等量培養(yǎng)液。各組細(xì)胞在37℃、5% CO2孵箱中貼壁培養(yǎng)，分別在開(kāi)始時(shí)及48 h時(shí)取出6孔板在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。

1.2.4Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell上室聚碳酸脂膜上鋪入50 μL稀釋的Matrigel膠，將小室放入37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育4 h使Matrigel膠凝固。用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞(5×105個(gè)/mL)和藥物。取100 μL細(xì)胞懸液和100 μL藥液加入Transwell上室，分為3組，即對(duì)照組、10 μmol/L白藜蘆醇組、10 μmol/L環(huán)巴明組。下室加入500 μL(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)48 h，取出Transwell小室，PBS清洗3次，使用甲醇固定細(xì)胞15 min，0.1%結(jié)晶紫染色液染色15 min，PBS清洗后，用干凈棉簽擦去上室中未侵襲細(xì)胞，顯微鏡下(放大倍數(shù)為200倍)觀察并采集圖像，計(jì)數(shù)10個(gè)視野中的細(xì)胞，反映細(xì)胞的侵襲能力。

1.2.5RT-PCR 檢測(cè)Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)基因(Gli-1、SMO)和EMT標(biāo)記基因(E-cadherin和Vimentin)mRNA表達(dá)情況，10 μmol/L白藜蘆醇和10 μmol/L環(huán)巴明分別處理各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞48 h，胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，使用Trizol法提取總RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒操作要求對(duì)提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。分別應(yīng)用表1中的引物進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，β-actin為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件為95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果，并進(jìn)行灰度值分析。

1.2.6Western blotting 實(shí)驗(yàn) 分別向培養(yǎng)48 h的對(duì)照組和藥物處理組細(xì)胞加入1 mL細(xì)胞裂解液提取總蛋白。分別取50 μg樣品蛋白/孔上樣至10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移到NC膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，然后分別加入相應(yīng)的一抗(1∶1 000)4 ℃平搖過(guò)夜，TBST洗滌3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶2 000)避光孵育2 h，TBST洗滌3次后用顯色液顯色，定影，掃描條帶并進(jìn)行凝膠成像分析，以目的條帶與β-actin條帶吸光度的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

表1RT-PCR檢測(cè)引物序列

基因名稱引物序列上游下游E-cadherin5'-CGCATTGCCACATACA-3'5'-CGTTAGCCTCGTTCTCA-3'Vimentin5'-CGCTTCGCCAACTACAT-3'5'-AGGGCATCCACTTCACAG-3'Gli-15'- AGCGTGAGCCTGAATCTGTG-3'5'- CAGCATGTACTGGGCTTTGAA-3'SMO5'-TCGAATCGCTACCCTGCTG-3'5'-CAAGCCTCATGGTGCCATCT -3'β-actin5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'

2 結(jié) 果

2.1白藜蘆醇和環(huán)巴明對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖抑制作用MTT法分別檢測(cè)白藜蘆醇和環(huán)巴明對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖的抑制作用。結(jié)果如圖1所示，隨著白藜蘆醇和環(huán)巴明濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖抑制率越大。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選擇10 μmol/L白藜蘆醇和10 μmol/L環(huán)巴明作為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)藥物濃度。

圖1環(huán)巴明和白藜蘆醇抑制PC-3細(xì)胞增殖

2.2白藜蘆醇和環(huán)巴明對(duì)前列腺癌細(xì)胞遷移能力的抑制作用在開(kāi)始時(shí)和48 h時(shí)間點(diǎn)分別測(cè)量3組劃痕間的寬度，結(jié)果顯示對(duì)照組劃痕愈合率為(93.4±4.0)%。環(huán)巴明組劃痕愈合率為(75.2±6.4)%。白藜蘆醇組劃痕愈合率為(69.1±8.4)%。白藜蘆醇組和環(huán)巴明組劃痕寬度大于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.009，圖2)，表明白藜蘆醇組和環(huán)巴明組愈合速度慢于對(duì)照組。

2.3白藜蘆醇和環(huán)巴明抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力應(yīng)用10 μmol/L的白藜蘆醇和10 μmol/L環(huán)巴明分別處理PC-3 細(xì)胞48 h，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果如圖3顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)白藜蘆醇處理的PC-3細(xì)胞的侵襲數(shù)均低于對(duì)照組。經(jīng)環(huán)巴明處理的PC-3細(xì)胞侵襲數(shù)低于對(duì)照組(P=0.001)。提示抑制Hedgehog信號(hào)通路可抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞的侵襲能力。

圖2 環(huán)巴明和白藜蘆醇抑制PC-3 細(xì)胞遷移

圖3 白藜蘆醇和環(huán)巴明抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲能力

2.4白藜蘆醇和環(huán)巴明影響PC-3細(xì)胞Gli-1、SMO和EMT標(biāo)記物(E-cadherin和Vimentin)mRNA的表達(dá)環(huán)巴明組Hedgehog通路關(guān)鍵蛋白Gli-1和SMO mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011,P=0.002)。環(huán)巴明組EMT上皮型標(biāo)記物E-cadherin mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P=0.025)，而間質(zhì)性標(biāo)記物Vimentin mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。白藜蘆醇組Gil-1和SMO mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004,P=0.001)。白藜蘆醇組EMT上皮型標(biāo)記物E-cadherin mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P=0.002)，而間質(zhì)性標(biāo)記物Vimentin mRNA表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。白藜蘆醇組SMO和Gil-1表達(dá)高于環(huán)巴明組，表明白藜蘆醇對(duì)Hedgehog通路抑制作用強(qiáng)于環(huán)巴明，但兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)差異。白藜蘆醇組E-caderin mRNA表達(dá)水平高于環(huán)巴明組(P=0.015)。Vimentin mRNA表達(dá)在白藜蘆醇組中低于環(huán)巴明組(P=0.091)。

圖4 白藜蘆醇和環(huán)巴明影響Gli-1、SMO和

2.5白藜蘆醇和環(huán)巴明對(duì)PC-3細(xì)胞中Gli-1、SMO和EMT標(biāo)記物(E-cadherin和Vimentin)蛋白表達(dá)的影響環(huán)巴明組Hedgehog通路關(guān)鍵蛋白Gil-1和SMO 蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組。環(huán)巴明組EMT上皮型標(biāo)記物E-cadherin 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，而間質(zhì)性標(biāo)記物Vimentin 蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組(圖5A)。白藜蘆醇組Hedgehog通路關(guān)鍵蛋白Gil-1和SMO 蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組。白藜蘆醇組EMT上皮型標(biāo)記物E-cadherin 蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，而間質(zhì)性標(biāo)記物Vimentin 蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組(圖5B)。

圖5 白藜蘆醇和環(huán)巴明影響PC-3細(xì)胞Gli-1、SMO和EMT標(biāo)記物蛋白表達(dá)

3 討 論

白藜蘆醇是從葡萄、花生等植物中提取的一種多酚類化合物。多項(xiàng)研究表明，白藜蘆醇可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，對(duì)于白藜蘆醇抗腫瘤作用的分子機(jī)制的進(jìn)一步闡明，可為白藜蘆醇的臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。本研究首先使用MTT法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)前列腺癌細(xì)胞PC-3的增殖作用。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可以呈時(shí)間——?jiǎng)┝恳蕾囆缘匾种芇C-3細(xì)胞增殖。白藜蘆醇濃度越大，作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)PC-3細(xì)胞增殖抑制作用越強(qiáng)。這些結(jié)果提示白藜蘆醇可能對(duì)前列腺癌具有一定的治療價(jià)值。

侵襲轉(zhuǎn)移是前列腺癌患者死亡的主要原因，約90%的前列腺癌患者因發(fā)生骨轉(zhuǎn)移而死亡[9]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)， EMT是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要機(jī)制。EMT過(guò)程伴隨著腫瘤細(xì)胞E-cadherin等上皮型標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，Vimentin等間質(zhì)性標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)上皮表型細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)表型細(xì)胞，獲得較強(qiáng)的遷移侵襲能力[10-11]。本研究采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以抑制PC-3細(xì)胞的遷移和侵襲能力。為進(jìn)一步驗(yàn)證白藜蘆醇是否通過(guò)抑制EMT過(guò)程發(fā)揮抗遷移和侵襲能力，采用RT-PCR和Western blotting法分別檢測(cè)E-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果提示，經(jīng)白藜蘆醇處理的細(xì)胞中，間質(zhì)性標(biāo)記物Vimentin均表達(dá)下調(diào)，提示白藜蘆醇可能通過(guò)抑制EMT過(guò)程發(fā)揮抗腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲作用。

EMT過(guò)程的發(fā)生受多因素多基因調(diào)控作用，Hedgehog信號(hào)通路都可能調(diào)控EMT過(guò)程[12-15]。本研究進(jìn)一步采用Hedgehog信號(hào)通路抑制劑環(huán)巴明作為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)白藜蘆醇處理前后細(xì)胞的Hedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵因子Gil-1和SMO mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，Hedgehog信號(hào)通路在白藜蘆醇調(diào)控前列腺癌細(xì)胞EMT過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

綜上所述，白藜蘆醇可通過(guò)抑制Hedgehog信號(hào)通路從而抑制前列腺癌轉(zhuǎn)移，這將為白藜蘆醇在前列腺癌治療中的應(yīng)用提供新的依據(jù)。