，，

(1.陜西省腫瘤醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710061；2.陜西省腫瘤醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710061)

惡性腫瘤具有細胞生長不受控制的特性，是嚴(yán)重致命的疾病之一[1]。消化道系統(tǒng)惡性腫瘤中最普遍的結(jié)腸癌是僅次于肺癌和乳腺癌的第三大癌癥，是癌癥死亡的第二常見原因[2-4]。與疾病有關(guān)的基因，與許多癌癥類型有關(guān)[5]。結(jié)腸癌的發(fā)病機制和相關(guān)分子是目前的研究熱點?；瘜W(xué)治療被認(rèn)為是控制多種惡性腫瘤有效治療方法之一。盡管由于其嚴(yán)重的細胞毒性且無法僅作用于惡性腫瘤細胞，標(biāo)準(zhǔn)化療計劃通常只能一定程度上延長生存時間[6-7]。目前主要的問題是化療藥物的靶向性不足，導(dǎo)致作用靶標(biāo)偏離目標(biāo)細胞而造成過多的副作用[8]。之前已有相關(guān)文獻集中討論了聯(lián)合使用麻醉藥物治療惡性腫瘤[9]。普魯卡因是常用的局部麻醉藥品，也是常用的化療藥物之一。其表現(xiàn)出一種表觀遺傳的行動模式，去甲基化劑為DNA高甲基化CpG島，因此成為治療不同類型癌癥的選擇之一[10]。本研究的主要目的是探討普魯卡因(作為DNMT抑制劑藥物的代表)對結(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為的影響情況，從而明確普魯卡因在結(jié)腸癌細胞中作用機制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本和實驗器材

脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購自上海吉凱基因，Trizol購自美國Ambion公司。PCR試劑盒購自美國Kapa公司。熒光素酶活性檢測試劑盒購自Promega公司。熒光素酶報告載體由Promega公司合成。Transwell小室購自美國Millipore公司(Millipore，Billerica，MA)，Matrigel購自Bio-Rad (Bio-Rad，Madrid，Spain)。

1.2 細胞株和培養(yǎng)

人類結(jié)腸癌細胞系(sw480)獲自中國科學(xué)院細胞庫(中國上海)。所有細胞在含有10%胎牛血清和100 u/mL青霉素或100 mg/mL鏈霉素的Dulbecco’s改良的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37 ℃含5%CO2的恒溫孵箱中。

1.3 細胞活性測定

使用不同濃度的普魯卡因處理結(jié)腸癌細胞，在24 h后以每孔5 000個細胞接種于96孔板(每孔5 000個細胞)中。在接種細胞24,48和72 h后，使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)測量細胞增殖。使用微孔板分光光度計在450 nm處測定吸光度。實驗重復(fù)3次。

1.4 蛋白質(zhì)印跡

使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜。使用5%脫脂牛奶充分封閉膜，并與LPS抗體(濃度1∶1 000)，內(nèi)參GAPDH(濃度1∶2 000)，4 ℃，孵育過夜。次日，TBST充分沖洗過后，使用二抗辣根酶標(biāo)記物(濃度1∶5 000)孵育2 h，TBST充分沖洗過后，使用增強的化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯影液檢測目標(biāo)蛋白的表達水平。

1.5 細胞遷移能力檢測

使用傷口愈合測定評估細胞遷移。將轉(zhuǎn)染的細胞在6孔板(每孔5×104個細胞)中培養(yǎng)。在90%～95%匯合時，使用無菌塑料微量移液槍頭刮擦單層細胞，然后將細胞在標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)24 h。洗滌幾次后，觀察傷口的恢復(fù)并使用X71倒置顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)拍照。

1.6 細胞侵襲能力檢測

使用Transwell侵襲測定以確定細胞侵襲。將1×105個轉(zhuǎn)染的sw480細胞接種到具有游離血清培養(yǎng)基的上室中。含有10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化劑添加到下部室中，將細胞在37 ℃和5%CO2下侵入48 h。然后將侵入過濾器下表面的細胞在70%乙醇中固定30 min，并用0.1%結(jié)晶紫染色10 min。在倒置顯微鏡下隨機選擇的5個視野中計數(shù)遷移到下側(cè)的細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的普魯卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞的影響

通過CCK-8細胞活性實驗檢測不同濃度的普魯卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞細胞活性的影響情況，實驗結(jié)果顯示：質(zhì)量濃度為0.02,0.04,0.06,0.08,0.10 mg/mL的普魯卡因處理結(jié)腸癌細胞，細胞活性分別為(0.82±0.12)，(2.21±0.35)，(2.98±0.41)，(4.12±0.81)，(1.72±0.81)。說明質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL的普魯卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞的活性影響情況最明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 不同濃度的普魯卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞細胞活性的影響

2.2 普魯卡因?qū)χ嗵潜磉_活性的影響

Western blotting檢測不同濃度的普魯卡因?qū)χ嗵墙Y(jié)合蛋白表達情況的影響。實驗結(jié)果顯示：質(zhì)量濃度為0.02,0.04,0.06,0.08,0.10 mg/mL的普魯卡因處理結(jié)腸癌細胞后，各組脂多糖結(jié)合蛋白相對表達量分別為(35.62±4.32)，(31.29±5.32)，(19.25±3.26)，(8.62±2.21)，(31.95±3.35)。表明合適濃度的普魯卡因可以抑制脂多糖結(jié)合蛋白的活性，其中質(zhì)量濃度為0.08 mg/mL的普魯卡因?qū)χ嗵墙Y(jié)合蛋白的表達水平抑制最明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2Westernblotting檢測普魯卡因?qū)χ嗵墙Y(jié)合蛋白表達的影響

2.3 普魯卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞遷移能力的影響

為了進一步評估普魯卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞體外轉(zhuǎn)移的影響，在用0.08 mg/mL的普魯卡因處理結(jié)腸癌sw480細胞后測定細胞遷移能力。劃痕愈合測定顯示普魯卡因可以直接抑制結(jié)腸癌細胞的運動能力，相比對照組細胞，遷移距離比例相對減小，且隨著時間進展差異明顯加大，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

圖3劃痕愈合實驗檢測普魯卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞遷移能力的影響

2.4 普魯卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞侵襲能力的影響

使用Transwell侵襲實驗檢測普魯卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞侵襲能力的影響，實驗結(jié)果顯示：相比對照組細胞，24 h后的侵襲細胞數(shù)目相對減少[(28.35±3.36)vs.(19.21±2.62)]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。上述結(jié)果表明普魯卡因可以直接抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲行為。

圖4Transwell侵襲實驗檢測普魯卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞侵襲能力的影響

3 討論

鑒定臨床治療對惡性細胞的影響最直接的方法之一是評估細胞活力的表達[11]，通過對比不同組細胞活力的變化判斷藥物的作用效果。細胞數(shù)量的減少可歸因于外源性凋亡途徑的激活，通過該外源性凋亡途徑，普魯卡因與苯基丁酸鈉聯(lián)合使一些凋亡相關(guān)基因去甲基化，繼而激活細胞凋亡，導(dǎo)致細胞活性降低[12-13]。有研究已經(jīng)表明化療藥物/藥物組合在減少惡性細胞活性方面具有顯著功效[14-15]。同時有研究指出苯二甲酸丁二醇酯與普魯卡因聯(lián)用時有拮抗作用，其中前者可以抑制普魯卡因起作用[16]。但當(dāng)普魯卡因與厄洛替尼或卡鉑結(jié)合時，細胞活性顯著降低。厄洛替尼和卡鉑與普魯卡因相比也具有不同的作用方式[17-18]。

本研究顯示，濃度為0.08 mg/mL的普魯卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞的活性影響情況最明顯，同時該濃度的普魯卡因?qū)χ嗵荓PS的影響作用最明顯。進一步探討普魯卡因?qū)Y(jié)腸癌細胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果表明使用0.08 mg/mL 的普魯卡因可在一定程度上抑制結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲行為，表明適宜濃度的普魯卡因可能在一定程度上抑制腫瘤細胞的生物活性，但是針對其可能的調(diào)控機制及蛋白表達目前尚無相關(guān)研究指出。

有研究表明全身炎癥和術(shù)后感染在一定程度上可以導(dǎo)致惡性腫瘤的復(fù)發(fā)[19]。對術(shù)后革蘭陰性細菌感染促進癌癥復(fù)發(fā)的機制了解甚少。盡管脂多糖誘導(dǎo)的系統(tǒng)性炎癥可以增加腫瘤細胞向肝竇的募集和體內(nèi)肝轉(zhuǎn)移，但是有關(guān)脂多糖對體內(nèi)癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能直接影響的文獻較為有限[20]。盡管脂多糖可能會改變癌細胞的增殖和凋亡行為，并且可能參與癌細胞的轉(zhuǎn)移過程，但其在結(jié)腸癌細胞中的表達作用目前不甚清楚。之前有學(xué)者證實了脂多糖可以誘導(dǎo)的TLR4信號傳導(dǎo)，促進人肝癌細胞在體外對內(nèi)皮細胞和各種ECM底物的黏附能力[21]。事實上，有研究表明，脂多糖可能誘導(dǎo)免疫抑制細胞因子和促血管生成趨化因子的分泌[22]。本實驗中，通過檢測合適濃度普魯卡因?qū)χ嗵墙Y(jié)合蛋白的表達水平的調(diào)控，推測普魯卡因可以影響脂多糖結(jié)合蛋白的表達進一步干擾結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲行為，在sw480細胞中的實驗可以驗證這一點。之前有研究指出，一方面，普魯卡因可以通過與肝竇內(nèi)的不同的基質(zhì)組分直接相互作用來介導(dǎo)細胞黏附；另一方面，普魯卡因可以直接與內(nèi)皮細胞上的蛋白受體結(jié)合配偶體結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用[23]。所以，通過本研究的結(jié)果推測普魯卡因可能通過影響脂多糖結(jié)合蛋白的表達調(diào)控結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲。

當(dāng)然，本研究存在一定程度的不足，普魯卡因作為一種化療輔助藥物，可以進一步探討與其他化療藥物(如卡鉑、厄洛替尼、順鉑等)的聯(lián)合作用，增強普魯卡因在臨床治療中的應(yīng)用方式，同時還需要完善動物體內(nèi)實驗，進一步證明普魯卡因?qū)嶓w腫瘤的作用效果。

綜上所述，本研究結(jié)果表明普魯卡因可作為化療輔助藥物，為探索結(jié)腸癌診療的分子機制和新的潛在治療策略提供相應(yīng)理論幫助，為結(jié)腸癌的臨床治療方式提供有效的支持。