盛潔1)2) 王開宇1) 馬貝貝2) 朱濤1)? 蔣中英2)1)?

1)(南京大學物理學院,固體微結(jié)構(gòu)物理國家重點實驗室,人工微結(jié)構(gòu)科學與技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,南京 210093)2)(伊犁師范學院電子與信息工程學院,微納電傳感技術(shù)與仿生器械重點實驗室,伊寧 835000)(2018年3月16日收到;2018年4月15日收到修改稿)

1 引 言

微納米尺寸的囊泡比表面積大,可攜帶大量的膜結(jié)合物.其中粒徑在5—200μm的巨囊泡(giant unilamellar vesicles,GUVs)易于觀測和操作,被廣泛用于生物模擬[1,2]、藥物包封和遞送[3]、納米顆粒合成及微反應器[4]等方面的研究.聚合物大分子修飾相反電性脂質(zhì)膜[5],可改變其電學性質(zhì)[6]、改進其藥物輸運能力、增強其穩(wěn)定性和生物兼容性[7].

多聚賴氨酸(poly-Llysine hydrobromide,PLL)是一類生物降解高分子聚合物,對生物體無毒、無副作用和無免疫源性,具有良好的生物相容性,可通過體內(nèi)的水解或酶解反應最終降解為小分子的氨基酸,被人體吸收.PLL側(cè)鏈的—NH2功能基團易與細胞膜上的陰離子靜電吸附,有很強的黏附力,從而被用于修飾材料,具有較高的科研價值與應用前景[8,9].

PLL可以與相反電性脂質(zhì)雙層高度結(jié)合[10].在很多應用中,正電性的PLL被用于將攜帶負電荷的受試物(例如細胞或蛋白質(zhì))黏附到負電性的襯底上[11].如PLL綁定到帶負電荷的固體支撐膜(SLBs)表面,以逆轉(zhuǎn)膜表面電性,并允許第二個雙層通過囊泡融合形成,附加層以簡單的逐層方法構(gòu)建[12].研究者已基于SLB開展了大量生物膜與聚合物作用的研究[13?15],但聚合物與GUVs相互作用的研究相對匱乏.Luan和Ramos[12]通過激光掃描共聚焦熒光顯微鏡觀察了帶反向電荷的聚電解質(zhì)(PE)分子誘導多電荷多層囊泡的形態(tài)轉(zhuǎn)變.由高PE濃度梯度誘導帶電雙層的離散和綁定,最終導致中空膠囊的自發(fā)形成,其厚壁由與PE分子結(jié)合的脂質(zhì)多層組成.Menger等[16]利用光學顯微鏡觀察到PLL可誘導負電性GUVs上出現(xiàn)黑點,并在一段時間后生長出“繩”,但未闡明其響應的機理.Kim和Sung[17]基于聚合物與生物膜作用的標度理論解釋了生物膜內(nèi)凹與外突的產(chǎn)生機制.弱吸附導致生物膜向外彎曲,產(chǎn)生的正曲率結(jié)構(gòu)有利于增加聚合物的構(gòu)象熵.而強吸附導致生物膜向內(nèi)彎曲,形成的內(nèi)陷囊泡有利于增大聚合物-生物膜的作用面積與黏附能.Lee和Larson[18]基于分子動力學模擬,發(fā)現(xiàn)PE吸附會誘導生物膜發(fā)生形變,但剛性聚酰胺-胺(PAMAM)枝狀分子誘導形變的能力顯著強于線性分子PLL.關(guān)于聚合物誘導GUVs響應的研究,仍然需要開展大量直觀顯微表征以對其內(nèi)在過程及調(diào)控因素進行深入的理解和詮釋.

利用倒置熒光顯微鏡實時觀察PLL誘導含負電性磷脂的GUVs,出現(xiàn)相鄰GUVs粘連、GUVs壁向內(nèi)增長生出“繩”狀結(jié)構(gòu)以及GUVs破裂等現(xiàn)象,并對實驗現(xiàn)象進行機理分析.為基于聚合物-GUV體系的藥物輸運和控釋、細胞形變、微觀可控反應和基因治療等方面的研究提供有價值的參考數(shù)據(jù)和技術(shù)支持.

2 實 驗

2.1 材 料

二油酰磷脂酰膽堿(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine,DOPC)、二油酰磷脂酸(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate,DOPA)、染色劑NB D-PE[1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-pho-sphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)(ammonium salt)]和PLL[分子量(mass fraction,MW):4000—15000和15000—30000]均購于美國Sigma公司;氯化鈉(NaCl)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、氯仿、無水乙醇和甲醇均為國產(chǎn)分析純試劑.

2.2 溶液配置

以氯仿/甲醇(體積比為19:1)為溶劑,分別配置DOPC,DOPC/DOPA(1:0.1)和DOPC/DOPA(1:0.4)磷脂溶液,濃度均為4 mg/mL.摻雜電中性的NBD-PE染色磷脂分子,染色劑占總磷脂的比例為2%(摩爾分數(shù)).PLL配制成濃度為1 mg/mL水溶液,塑料離心管封裝成若干份,?20?C儲存;使用時取出解凍,4?C冷藏,一周內(nèi)用完.10 mmol·L?1,pH=6.98的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buf f er saline,PBS)緩沖液,4?C冷藏,一周內(nèi)用完.實驗用水是經(jīng)Milli-Q離子交換凈化系統(tǒng)處理所得的超純水.

2.3 制備GUVs

氧化銦錫(ITO)導電玻璃搭建流動艙用于電制備GUVs[19,20].使用涂抹法將2μL的磷脂溶液均勻涂抹在清洗好的ITO電極上,置于真空干燥箱至少2 h,確保膜內(nèi)有機溶劑完全揮發(fā).電制備GUVs時,先向反應艙室注入PBS緩沖液,后施加電場,利用顯微鏡實時觀察GUVs的生成過程,控制生成合適粒徑的GUVs.PLL與GUVs相互作用實驗仍然在電制備GUVs的流動艙進行.艙室容積為0.235 mL,直徑10 mm、高3 mm的圓柱區(qū)域.單通道微量注射泵(KD scientif i c,美國)注液速率取0.1 mL/h.

3 結(jié)果與討論

艙室內(nèi)注入PLL(MW:15000—30000)的最終濃度達到約為49μg/mL時,相鄰DOPC/DOPA(1:0.1)GUVs粘連,囊泡內(nèi)壁生長出“繩”結(jié)構(gòu),以及粘連處面積逐漸增大,如圖1所示.GUVs中負電磷脂DOPA含量越高,所需PLL的濃度越低.換而言之,GUVs負電性越強,其對PLL的響應越劇烈.注入PLL(MW:15000—30000)的最終濃度達到700μg/mL時,對DOPC GUVs不產(chǎn)生響應.

圖1 PLL(MW:15000—30000)誘導DOPC/DOPA(1:0.1)GUVs響應的熒光顯微鏡圖 (a),(b)相鄰GUVs粘連和出“繩”;(c)20 s后,粘連處面積增大Fig.1.Fluorescence imaging of DOPC/DOPA(1:0.1)GUVs induced after the addition of PLL(MW 15000–30000):(a),(b)Attachment of adjacent GUVs and formation of ropes;(c)GUV attachment area increased after 20 s.

表1 相同條件下,PLL誘導不同GUVs產(chǎn)生響應所需的量Table 1.PLL induced the amount of response required for dif f erent GUVs under the same conditions.

以一個粒徑為40μm的DOPC/DOPA GUVs計算,其中DOPC:DOPA=1:0.1,內(nèi)含約0.7×1010個DOPA,則有1.4×1010陰離子.當艙室中PLL(MW:4000—15000)的最終濃度為10μg/mL時,其中約有1014個PLL,對應陽離子總數(shù)約為1015.因此,PLL具有足夠的電荷與DOPA結(jié)合.對照表1數(shù)據(jù),分析認為PLL可誘導負電性GUVs響應,但對電中性的GUVs無影響.

3.1 相鄰GUVs粘連

注入PLL后相鄰GUVs的粘連有兩種情況:1)相靠的GUVs粘連,且粘連面積增大,如圖2中紅箭頭所指之處;2)臨近的GUVs,逐漸靠近并粘連,如圖2中粉箭頭所指之處,測量該處兩個GUVs初始間距約為0.6μm.Pantazatos和Mac-Donald[21]曾研究發(fā)現(xiàn)相反電性的囊泡會粘連,粘連處面積增大,兩個囊泡中的磷脂分子相互交換,說明粘連處磷脂雙層融合.

PLL分子是含有若干個賴氨酸殘基的陽離子聚合多肽,具有很高的正電荷密度[10],可與負電性物質(zhì)結(jié)合[22].已知分子量為15000—30000的單個PLL鏈長33—66 nm、內(nèi)含190—380個陽離子.生理條件下,DOPC顯電中性,DOPA帶兩個負電荷.PA上的電荷對單價電解質(zhì)濃度的變化非常敏感,當單價鹽濃度低于75 mmol·L?1時,PC和PA將快速分離[23].因此,分析認為在實驗溶液環(huán)境中,DOPC/DOPA GUVs出現(xiàn)不混溶的PC和PA富集區(qū).我們認為,溶液中的PLL將分別吸引兩側(cè)GUVs中的DOPA富集區(qū),誘導GUVs粘連.

圖2 PLL(MW:15000—30000)誘導DOPC/DOPA(1:0.4)GUVs粘連過程的熒光顯微鏡圖(相靠GUVs的粘連如紅箭頭所指,臨近GUVs的粘連如粉箭頭所指) (a)0 min;(b)1 min;(c)3 min;(d)5 minFig.2.Fluorescence imaging of the attachment between DOPC/DOPA(1:0.4)GUVs induced by the addition of PLL(MW 15000–30000):(a)0 min;(b)1 min;(c)3 min;(d)5 min(the red and pink arrows indicate the attachments between the adjacent vesicles and the nearby vesicles,respectively).

圖3 PLL誘導DOPC/DOPA GUVs粘連的示意圖(注:示意圖與實際尺寸無關(guān)聯(lián)) (a)一個DOPA頭基占據(jù)3個PLL殘基單體的空間位置;(b)溶液中PLL均勻擴散;(c)PLL與DOPA富集區(qū)結(jié)合,形成正電性微區(qū)域,相鄰GUVs粘連;(d)粘連處面積擴大;綠色無規(guī)則線型結(jié)構(gòu)代表PLL分子,圓圈橘部分為GUVs中DOPC富集區(qū),深藍色部分代表DOPA富集區(qū)Fig.3.Schematic diagram of PLL-induced DOPC/DOPA GUV attachment:(a)Surface area of one DOPA headgroup is equal to that of three PLL residues;(b)uniform dif f usion of PLL in solution;(c)adsorption of PLL to DOPA-enriched membrane area,formation of positively charged domains,and attachment of adjacent vesicles;(d)increase of the attachment membrane area.The green coils represents PLL,while the orange and blue colors represent the membrane area enriched in DOPC and DOPA,respectively(Note:This diagram is not drawn to scale).

生理條件下,PLL陽離子殘基單體長度約0.35 nm,磷脂分子頭基半徑約0.47 nm.則從幾何限制考慮,一個DOPA頭基和PLL靜電吸附時,將占據(jù)3個殘基單體的位置,則富余4個陽離子,如示意圖3(a)所示.該處電性反轉(zhuǎn),且增加為原來的兩倍.圖3(b)所示,GUV1,GUV2和GUV3彼此相鄰,空間中分散著PLL分子,GUVs上DOPC和DOPA不混溶的富集區(qū)隨機分布.PLL與GUVs中DOPA富集區(qū)靜電吸附[12,24,25],形成一個PLL/DOPA的微結(jié)構(gòu)域[7,26,27],且該微區(qū)域的電性由負電性反轉(zhuǎn)為正電性,并增加兩倍.PLL上充足的胺基陽離子可作為橋梁[27,28],通過靜電吸附,將相鄰的GUVs緊密粘連在一起,如示意圖3(c)所示.這與PLL和負電性磷脂雙層形成層層自組裝結(jié)構(gòu)現(xiàn)象一致,是否存在粘連融合的情況仍需進一步驗證.由于PLL為無規(guī)則卷曲構(gòu)像,其粘連在GUVs上將呈現(xiàn)平面結(jié)構(gòu).因此,隨著粘連處周圍吸附的PLL增多,粘連處的面積也逐漸擴大,如圖3(d)所示.綜上,PLL誘導GUVs彼此粘連的動力是靜電吸引力.

3.2 GUVs內(nèi)生長出“繩”結(jié)構(gòu)

實驗觀察到,在pH中性環(huán)境中,少數(shù)粒徑較大(>20μm)、空間位置相對獨立的DOPC/DOPA GUVs易出現(xiàn)“繩”結(jié)構(gòu),如圖4所示.推斷可能是由于流體力學半徑較大的GUVs的膜更容易受到溶液環(huán)境干擾而觸發(fā)形變.GUVs會出現(xiàn)的“繩”結(jié)構(gòu),在GUVs中處于無規(guī)則擾動狀態(tài),其數(shù)量和長度都會逐漸變多、變長;也有GUVs中僅有一條“繩”的情況.圖4(a)中GUVs充滿了“繩”結(jié)構(gòu),熒光圖不可辨識中空管狀結(jié)構(gòu).圖4(b)是30 s后GUVs在不同焦平面上的圖像,GUVs中有一條寬1.4μm的微管(紅箭頭所指),熒光圖可辨識為管狀結(jié)構(gòu).圖4(c)中,黃箭頭所指GUVs中僅存在一條“繩”,綠箭頭所指GUVs中有多條“繩”.圖4(d)中GUVs生出的微管,熒光圖可辨識,截面直徑為2μm.

測量PLL溶液不同濃度的滲透壓顯示,PLL濃度小于 50μg/mL時,在測量精度范圍內(nèi)(1 mOsm/L)未發(fā)現(xiàn)滲透壓改變;濃度在200μg/mL時,分子量小的PLL溶液透壓小幅度降低.注入的PLL溶液使囊泡外部滲透壓降低,將阻礙“繩”向囊泡內(nèi)萌出[29].實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示,導致DOPC/DOPA GUVs產(chǎn)生“繩”結(jié)構(gòu)所需的PLL溶液濃度小于50μg/mL.因此,可以排除滲透壓對出“繩”過程的貢獻.我們認為GUVs壁向內(nèi)生長出的“繩”結(jié)構(gòu),屬于磷脂膜的側(cè)向再組織行為.

由于PLL含大量正電荷,其幾何長度為幾納米到幾十納米.因此,一條或多條PLL可與GUVs上的DOPA富集區(qū)靜電吸附,形成一個正電性的PLL/DOPA微區(qū)域,如圖5(a)所示.PLL/DOPA微區(qū)域相較于吸附前,物理特性改變,即磷脂膜兩側(cè)吸附不對稱和電性翻倍反轉(zhuǎn),這將破壞該處原來的穩(wěn)定狀態(tài).PLL/DOPA微區(qū)域內(nèi)磷脂分子密度和分子間應力受到PLL構(gòu)像的影響.PLL吸附造成微區(qū)域中GUVs外葉磷脂分子橫向壓縮,該處膜自發(fā)曲率向GUVs內(nèi)部釋放膜間應力,萌出“芽”結(jié)構(gòu),如圖5(b)所示.另外,相鄰的PLL/DOPA微區(qū)域之間、PLL/DOPA微區(qū)域和溶液中分散的PLL之間,均存在靜電排斥力,如圖5(c)所示紅箭頭所示.且分別增加為原來的4倍和兩倍,嚴重打破了原有磷脂分子間的力學平衡.靜電排斥力將“芽”與GUVs連接邊緣處的PLL/DOPA微區(qū)域逐漸推入GUVs內(nèi)部,即生長出“繩”結(jié)構(gòu).

圖4 PLL(MW:4000—15000)誘導DOPC/DOPA(1:0.4)GUVs產(chǎn)生“繩”結(jié)構(gòu)的熒光顯微鏡圖 (a)大量“繩”結(jié)構(gòu),寬度<1μm;(b)30 s后的微管結(jié)構(gòu),直徑1.4μm;(c)GUVs中僅一條“繩”,黃箭頭指示;(d)微管結(jié)構(gòu),直徑為2.3μm,粉箭頭指示Fig.4.Fluorescence imaging of the formation of ropes from DOPC/DOPA(1:0.4)GUVs induced by the addition of PLL(MW 4000–15000):(a)Large number of ropes with diameter less than 1 μm;(b)after 30 s,the diameter of ropes increases to around 1.4μm;(c)GUV with one rope(yellow arrow)and many ropes(green arrow);(d)tube with a diameter of 2.3μm(pink arrow).

圖5 “繩”結(jié)構(gòu)萌出過程示意圖(注:示意圖與實際尺寸無關(guān)聯(lián)) (a)DOPA富集區(qū)吸附PLL形成的正電性的微區(qū)域;(b)圖(a)中微區(qū)域的放大圖,磷脂雙層外葉面積收縮引起膜向囊泡內(nèi)部隆起;(c)萌出“芽”結(jié)構(gòu),紅箭頭代表微區(qū)域間靜電排斥,以及微區(qū)域和PLL靜電排斥;(d)形成微管;(e)形成“繩”Fig.5.Schematic diagram of PLL-induced rope formation:(a)Adsorption of PLL adsorpted to DOPA-enriched membrane area,formation of positively charged domains;(b)enlarged image from panel(a)shows that the contraction asymmetry in the two lipid leaf l ets causes the bending of the lipid membrane inward;(c)budding of the membrane;the red arrows indicates the electrical repulsion between the micro-domains,as well as the electrical repulsion between micro-domain and PLL;(d)formation of the tubes;(e)formation of ropes(Note:This diagram is not drawn to scale).

Khalifa等[30]利用微操實現(xiàn)局部pH梯度,觀察到定向誘導50μm的GUVs動態(tài)嵴狀膜內(nèi)陷,若撤去該處pH梯度,內(nèi)陷可以恢復并消失.實驗觀察到GUVs內(nèi)陷生出“繩”未自動收縮消失.分析認為,當“芽”萌出,生長成“繩”后,磷脂分子間應力得到了釋放.分子間力平衡后,“繩”的長度固定,系統(tǒng)達到相對穩(wěn)定,如圖4(c)中黃箭頭所指的GUVs中長度穩(wěn)定的“繩”.

“繩”在GUVs內(nèi)無規(guī)則的擾動是 “繩”繼續(xù)生長的一種動力.內(nèi)含多條“繩”的GUVs,“繩”中PLL/DOPA微區(qū)域的電性使“繩”彼此間靜電排斥,造成劇烈擾動.擾動的“繩”不斷將GUVs接口拖處的分子拖入“繩”內(nèi),即出現(xiàn)“繩”不斷變長.

分別測圖4(a)和圖4(b)中GUVs的直徑,各15組,取平均值,參見表2.分析認為“繩”的生長消耗GUVs中磷脂分子,導致GUVs直徑減小?D=DA?DB≈2.5μm(A代表0 s,B代表30 s),其表面積減少?S=SA?SB≈862μm2.已知磷脂雙分子層厚4 nm,PLL(MW:4000—15000)對應的無規(guī)則卷曲線型構(gòu)像,長度約為8—30 nm,這對于熒光圖中估測的微米級直徑的“繩”而言,可以將“繩”看作如示意圖5(d)和圖5(e)所示直徑不同的微管[16].

計算?S≈862μm2可以新生成以下3種結(jié)構(gòu):1)約6條直徑1.4μm、長度30μm的微管,但實際上調(diào)整不同聚焦平面僅觀測到一條;2)假設(shè)PLL伸展后的線狀結(jié)構(gòu)可以橫跨粘連微管壁,呈現(xiàn)如示意圖5(d)所示,可生成約190條,直徑0.03μm,長度50μm的微管,這與實驗觀察到“繩”的數(shù)量有較大差異;3)直徑0.5μm、長度40μm的微管,可新生成28條,這與觀察到的實際圖像符合.綜上分析,?S可新生成的“繩”結(jié)構(gòu)是不同直徑的微管,這仍需要進一步用實驗證實.

表2 GUVs形變和生成微管的相關(guān)幾何參數(shù)及計算數(shù)據(jù)Table 2.Geometric parameters and calculation data of GUVs deformation and microtubules generation.

3.3 GUVs破裂

實驗觀察到,注入PLL可導致GUVs破裂.大多數(shù)GUVs粘連后迅速破裂,未觀察到“繩”結(jié)構(gòu)的生長.個別生出“繩”結(jié)構(gòu)的GUVs在一段時間后破裂.分析認為,PLL誘導GUVs粘連或向內(nèi)生出大量的“繩”,使GUVs中某處分子的間距大于范德瓦耳斯截斷半徑時,造成GUVs破裂.

另外,粘連的GUVs中,一個或幾個GUVs破裂后,完整的GUVs表面會出現(xiàn)類似相分離的微疇結(jié)構(gòu).如圖6(a)中紅箭頭所指GUVs破裂后,出現(xiàn)圖6(c)黃箭頭所指的高亮區(qū).分析認為,由于PLL上足夠的電荷可作為中間橋梁,分別吸附兩側(cè)負電性帶電體,自組裝形成多層膜結(jié)構(gòu)[27].此高亮區(qū)是殘余雙層膜通過PLL靜電吸附在完整的GUVs上,顯示出高亮熒光區(qū)域.由于PLL/DOPA微區(qū)域間靜電排斥和磷脂分子的流動性,微疇區(qū)域出現(xiàn)面積改變和位置移動的響應.這一結(jié)果為GUVs與聚合物大分子層層自組裝復合系統(tǒng)的研發(fā)提供了重要的參考依據(jù).

圖6 PLL誘導DOPC/DOPA(1:0.1)GUVs破裂圖熒光顯微鏡 (a)相鄰 GUVs粘連;(b)其中一個GUVs破裂;(c)GUVs上出現(xiàn)類似相分離微疇區(qū)域Fig.6.Fluorescence imaging of PLL-induced DOPC/DOPA(1:0.1)GUVs rupture:(a)Attachment between adjacent GUVs;(b)rupture of one GUV;(c)formation of the phase separation structure.

4 結(jié) 論

利用熒光顯微鏡原位觀測研究了PLL對磷脂GUVs的影響.實驗發(fā)現(xiàn),PLL引發(fā)含負電磷脂的GUVs向內(nèi)部長生出“繩”、粘連和破裂.

PLL誘導負電性GUVs形變響應,對中性GUVs無影響.PLL與負電性GUVs相互作用是自發(fā)曲率、靜電排斥力與膜間張力的競爭過程.在低鹽溶液中,DOPC和DOPA混溶性差,形成DOPA富集的微區(qū)域.PLL與DOPA富集區(qū)靜電吸附,使PLL/DOPA微區(qū)域電性反轉(zhuǎn),帶電量翻倍.PLL作為橋梁,因靜電力分別吸附兩側(cè)GUVs粘連.PLL/DOPA微區(qū)域之間、PLL/DOPA微區(qū)域和PLL之間,存在靜電排斥力.GUVs吸附PLL,導致內(nèi)外葉面積不對稱,引起該處膜自發(fā)曲率.磷脂分子間張力增加,阻礙“繩”生成.靜電排除力、自發(fā)曲率促進粘連、出“繩”和破裂.

我們的研究結(jié)果對聚合物-GUVs體系為模型的藥物輸運和控釋、細胞形變、微觀可控反應和基因治療等方面的研究提供有利的支持.